Name: in vivo gene transfer to the rabbit common carotid artery endothelium
Uploaded: 2018-05-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium at JoVE.com

אנו מודים AdVec, inc. רשות להשתמש HDAd ריאגנטים, ג'וליה Feyk לסיוע מינהלי, ואת המחלקה לרפואה השוואתי הוטרינריים לייעוץ כירורגי ותמיכה. עבודה זו נתמכה על ידי HL114541, קרן צדקה של ג'ון לוק, ג ' ל'.

המחברים אין לחשוף.

היבטים מסוימים של טכניקה כירורגית ראויות תשומת לב מיוחדת. חשיפה מלאה והתגייסות של עורק תרדמני באמצעות ניתוח זהיר הרצון להקל על העברת גנים ותיקון arteriotomy. עם זאת, בזמן, טפלול ישיר של העורק הראשי צריך להיות ממוזער כדי למנוע vasospasm. בנוסף, דימום צמוד העורק להפסיקו על ידי הפעלת לחץ קל עם גזה, דם extravasated לנקותם באופן מיידי על ידי שטיפה באזור עם תמיסת מלח. זה חשוב גם למנוע נזק התועה, אשר פועל במקביל עורק תרדמני. זמירה את adventitia באזור של arteriotomy המתוכנן יעזור באופרטור כדי לבצע arteriotomy נקיים ופונקציונליים והן כדי לתקן את arteriotomy. לבסוף מתפצל עורק תרדמני חייב להיות מזוהה, מאתרים באופן מאובטח כדי למנוע דליפה של וקטור של לומן העורק.
ישנם גם היבטים קריטיים וקטור אינפוזיה ותיקון arteriotomy. במהלך וקטור אינפוזיה, חשוב distend שחתך את עורק הצוואר כדי קליבר פיזיולוגיים או מעט גדול יותר כדי להשיג התמרה חושית יעילה. בעת תיקון של arteriotomy, התפר צריך לחדור את הקיר כלי קרוב ככל האפשר את הקצוות של arteriotomy, ולא צריך נקיה הזן ועל יציאה לומן ולא לעבור axially דרך הקיר כלי. אם רק השכבות החיצוניות של הקיר כלי נמשכים ביחד כי התפר עובר axially דרך הקיר כלי ולא עובר בצורה רדיאלית דרך הקיר והזנת לומן, פער יישארו ב- אינטימה, הסיכון לפקקת יגדל. אם חדירות תפר ירווחו באופן נרחב מדי, או אם התפר הוא הידקו יתר כאשר קשורות, קפלי רקמה תיווצר באתר arteriotomy. קיפולים אלה לשבש את זרימת הדם למינריות נורמלי, גם הגדלת הסיכון פקקת. שמירה על מאפייני הזרימה עקביים חשוב עבור ניסויים שבוצעו במודלים חייתיים של מחלות (למשל., טרשת עורקים) כי הזרימה שינו יכול לתרום תהליך המחלה30.
אופרטורים חדשים בדרך כלל נתקלים thrombosed העורקים-קציר. פקקת luminal הוא סיבוך הרסנית, עיבוד העורק שמיש בתור דוגמה ניסיוני. למניעת פקקת, אנחנו מפקחים באופן שגרתי הפארין הרביעי לפני העברה גנטית. פקקת גם נמנעת באמצעות סגירת זהיר arteriotomy, כפי שתואר לעיל. המינון הפארין יכול להיות מוגברת למניעת פקקת, או אספירין יכול להינתן במשככי. עם זאת, מינון גבוה יותר של הפארין גם להגדיל את פוטנציאל סיבוכים דימום, אספירין יכול להפריע נקודות הקצה ניסיוני, במיוחד אם הוא נחקר דלקת. לכן, עדיף להתמקד בטכניקה כירורגית משופרת, כאמצעי למניעת פקקת.
אם מניפולציה גם נמרצות, עורק עלול לעבור עווית, יכול לתרום גם פקקת על ידי הפחתת זרימה. אם הוא נתקל vasospasm, זה ניתן להקל על-ידי יישום של papaverine אקטואלי. כאשר כלי הקציר מתוכננים עבור יותר מ 2-3 ימים לאחר התמרה חושית, פקקת היא דאגה, אולטרסאונד transcutaneous ניתן להעריך noninvasively כלי patency. גילוי thrombosed העורקים עשויה להוביל המתת חסד כדי לחסוך עלויות הדיור. בעלי חיים נוספים יכול גם להיות רשום, למלא קבוצות הניסוי. פרי - ו פוסט - intervention התמותה שכרוכות בשיטה זו צריכה להיות < 1% (כלומר., לא שונה התמותה המשויך ניתוחים אחרים מתבצע על ארנבים בריא)31.
לאחר אופרטור הופך נוח עם ההיבטים הטכניים של פרוטוקול כירורגי, היכולת לבצע העברה גנטית יעיל לצרכים אנדותל, לאימות באמצעות הגישות המתוארות בסעיף לעיל על תוצאות נציג. אם מתעוררות בעיות עם השגת העברה גנטית לשחזור, האשם סביר באחד בשני תחומים. אחרי הספינה הוא מבודד הדם נשטף של לומן, חשוב להסיר את המאגר לשטוף DMEM כך הפתרון חדורים וקטור הוא לא מדולל במהלך התמרה חושית. היבט חשוב אחר הוא distend את הכלי כדי קליבר פיזיולוגיים או מעט גדול יותר במהלך וקטור אינפוזיה. בגלל, מניסיוננו, עורק הצוואר לא נפוחה באופן מלא או לא להישאר נפוחה במהלך העירוי 20 דקות אמין יש ביטוי transgene נמוך, סביר להניח כי התנפחות של העורק כדי קליבר הפיזיולוגיות משפר את התמרה חושית יעילות. עם זאת, יש מעולם לא למדנו את זה באופן שיטתי. זה אפשרי כי הגדלת הלחץ אינפוזיה מעל רמות פיזיולוגיים יכול להגביר את היעילות התמרה חושית, ולאפשר גם רמות גבוהות יותר של התמרה חושית של תאים בתקשורת כלי הדם. אולם, שיבוש של המכשול אנדותל ככל הנראה נזק את כלי הקיבול, להגדיל את הסיכון לפקקת. אם הכלי לא נותר נפוחה במשך תקופת כל 20 דקות וקטור-הדגירה, סביר להניח כי וקטור דולף של ענפי עורק תרדמני. להיות זהיר במהלך ניתוח כדי לזהות מאתרים ומפסיקים את כל הענפים כדי למנוע דליפה של וקטור של לומן העורק.
בשיטה זו יש מספר מגבלות הקשורות לשימוש של ארנבים. ארנבים יקרים פחות בית ולהאכיל יותר חיות גדולות אחרות (כלבים, חזירים, כבשים); עם זאת, העלויות של רכישת, דיור, מאכיל ארנבים הם במידה ניכרת יותר עבור עכברים וחולדות. מתקני חדר הניתוח ודרישות רגולטוריות לניתוח הארנב הם גם הרבה יותר נרחב מאשר למכרסמים. בנוסף, ניכרת מומחיות טכנית יש צורך לבצע ביעילות את פרוטוקול העברת הגן כירורגית. מומחיות זו ניתן לרכוש באמצעות מפעילי שעברו אין תרגולי רשמית. לפחות 2 אנשים בקבוצה שלנו (כולל המחבר הראשי של כתב יד זה) יש ללמוד את טכניקות ניתוחיות, להחיל אותם באופן פרודוקטיבי. למרות זאת, אימונים קפדני ובדיקת זהיר של יעילות העברת גנים של אופרטור הפארמצבטית (כמתואר בסעיף התוצאות נציג) נדרשים לפני האופרטור להתחיל להפיק נתונים באיכות גבוהה.
ההסגר של ביטוי transgene באופן כמעט בלעדי אנדותל עם שיטת29,32,33,34,הזה35,36,37 אפשרות זו שימושית בכך שהיא מאפשרת חקירת תופעות transgene בתאי האנדותל ומדידה של פעילות של חבר העמים אקטינג רצפי DNA תקינה בתאי האנדותל. יכול להיות transduced מספר קטן של תאים adventitial או המדיאלי; אולם, היכולת של שיטה זו יעילה מגלי תאים nonendothelial מונע את היישום של השיטה במחקר של סוגים אחרים של תאים קיר כלי הדם (כגון תאי שריר חלק, מקרופאגים). למרות ביטוי של חלבונים המופרש מתאי אנדותל transduced יכול לאפשר חקירת ההשפעות של חלבונים אלו על אחרים תא וסקולרית יקליד, התפקידים של חלבונים שאינם מופרש אלה סוגי תאים כלי דם אחרים (למשל-קולטנים או חלבונים המעורבים אותות) לא ייחקר בשיטה זו.
כאמצעי לבדיקת הטיפול הגנטי, ממוקדות קיר העורק, השיטה שונה משיטות אחרות פרה בשתי דרכים עיקריות. ראשית, השיטה משתמשת מודל ארנב עבור ויוו בדיקות של טיפול גנטי ולא יותר נפוץ מודלים מכרסמים8,12,15,38,39. השימוש של ארנבים מאפשרת הערכה של הביטוי transgene ואת התפקיד הביולוגי של המוצר transgene במודל חיה outbred, אשר מייצג יותר של מגוון גנטי אנושי מאשר הם מכרסמים המפגרים. המודל יכול לשמש כדי להעריך ריפוי גנטי או העורקים רגילה או בכל העורקים ארנב שיש פתולוגיה עורקי הדומה לזה שנמצא העורקים אדם חולה. ארנב העורקים גם קרובים יותר בגודל של העורקים האנושית מאשר העורקים מכרסמים ומספקים רקמות הרבה יותר לניתוח יותר זמין של העורקים מכרסמים. ההבדל השני הוא כי שיטה זו משתמשת בגישה כירורגית כדי לספק transgene וקטור אנדותל כלי הדם. ריפוי גנטי סומאטית לעיתים קרובות מועבר מערכתית, לעתים קרובות על ידי מיקוד הכבד עם המטרה של שינוי פלזמה רמות של transgene חלבון25,40. על ידי מיקוד אנדותל כלי הדם, השיטה מספקת המוצר transgene טיפולית באופן מקומי, עם ריכוז שיא שלה בתוך קיר העורק, בדיוק איפה הוא נחוץ לטיפול מחלת כלי דם. על ידי מסירת את transgene רק באופן מקומי, השיטה מבטלת גם תופעות לוואי מערכתית של המוצר transgene. קבוצות אחרות מפתחים שיטות באמצעות פפטידים, נוגדנים או שינויים אחרים capsid הכוונת וקטורי מערכתית מוזרק אנדותל בריא או חולה לספק ג'ין וסקולרית מקומית טיפול41,42 , 43. עם זאת, בהן מיקוד שיטות להישאר תחת פיתוח, הם עדיין מסובך התמרה חושית מערכתית משמעותי, במיוחד ב-43,הכבד42,44. שיטה כירורגית שלנו מספקת מדויק ויעיל הקדמה של transgenes אנדותל כלי הדם עם מינימלית - אם בכלל - התמרה חושית במקומות אחרים. 1 השיטה הוא גם יותר נוח, יעיל, ו גבוה יותר-לכל אורך ממוצע (לעומת transgenesis נבט-קו או הזרקת מערכתית של וקטורים אנדותל במיקוד) לבדיקת הפעילות של רצפי DNA תקינה כלי גדול אנדותל, לתפקוד החלבון transgene הבדיקה בקיר העורק ולאחר בדיקה ריפוי גנטי כלי-קיר-ממוקד.
שיטה זו מאפשרת חקירה התפקיד הביולוגי של כל transgene, כאשר זה מתבטא אנדותל עורק גדול. אם שינוי כדי לבטא אובדן-של-פונקציה ריאגנטים כגון קולטנים שליליים דומיננטי או סיכת ראש קצר RNA, זה מאפשר חקירה של התפקידים של חלבונים אנדותל אנדוגני, איתות המסלולים. השיטה יכולה לשמש גם כדי למדוד את הפעילות תעתיק של כל רצף ה-DNA cis אקטינג בעורק הראשי תאי אנדותל5,6,7. בנוסף, השיטה מאפשרת בדיקה של כל סוג של גן וקטור העברה יעילות ובטיחות כאשר נמסר באופן מקומי אנדותל, תחשוף את היכולת של וקטור להשיג ביטוי transgene עמיד. לבסוף, השיטה מאפשרת פיתוח ובדיקות של שילובים של וקטורים, transgenes שנועדו לספק טיפול גנטי, ממוקדות קיר כלי הדם. השיטה יכול לשמש ככלי מיון לזיהוי גנים טיפוליים, זה אולי-בעתיד-ניתן להעביר את אנדותל של כל העורקים הראשיים (או כל חולה עורקים גדולים) מאת percutaneously מוזרק וקטורים, ממוקדות קיר כלי הדם. בגלל חסינות קיימים בבני אדם אדנו סוג 545, זה להיות מאתגר להשתמש אדנו סוג מבוסס-5 וקטורים ביישומים קליניים. הנדסה של capsid אדנו 5, שימוש אדנו חלופי אשר נגרמו מהזנים אליהם46, או השימוש וקטורים פחות-immunogenic כגון AAV העשויים להידרש להביא ריפוי גנטי וסקולרית למרפאה. כלי ניסיוני, עם זאת, אנחנו מודעים לכל וקטור יכול להתחרות עם אדנו תלויי-helper 5 בהשגת transgene עמיד ויעיל ביטוי כלי הדם1.

המטרה של שיטה זו היא להציג את transgene לתוך אנדותל עורקי התרדמה נפוצות ארנב. הקדמה של transgene מאפשר את ההערכה של תפקיד ביולוגי של המוצר transgene עורקים רגילים והן במודלים הארנב של מחלת עורקים אנושי. ביטוי של transgene המחלה במודלים יכול לחשוף אם את transgene (ואת מוצריו חלבון) להראות הבטחה כמו סוכני טיפולית-1-2,,3,-4. הכללת רכיבים רגולטוריות cis אקטינג בקלטת ביטוי transgene מאפשר הערכת הפעילות של רכיבים אלה אנדותל עורקי ויוו5,6. הידע הפעילות של רכיבים ספציפיים של הרגולציה cis אקטינג יכול לשמש כדי לעצב ביטוי פעיל יותר קלטות וכדי לחקור מנגנונים של הכונה אנדותל ויוועורק גדול7.
ארנבים הם מודל ערך עבור היבטים שונים של פיזיולוגיה אנושית וסקולרית ומחלות. ארנבים חולקים תכונות כלי דם רבות עם בני אדם. לדוגמה, ערכים של תוכנית בסיסית hematological, תקנה hemostatic, ו למתח האורך כלי הדם דומים בין הארנבים ובני8. ארנב מודלים של מחלות לב וכלי דם לשכפל את תכונות מפתח של מחלות רבות, כולל: מפרצות (דומה גיאומטריים, מאפייני הזרימה)9, vasospasm (תגובה דומה לטיפול endovascular)10,11, ו טרשת עורקים (intimal הפלאק עם תכונות דומות, כולל את ליבה של עתיר השומנים, מקרופאגים, ותאי שריר חלק כיפה סיבית)12,13. בהתאם לכך, פותחו מודלים ארנב למחלות כלי דם רבות כגון פקקת, vasospasm, מפרצת, סוכרת, היצרות כלי הדם שתל טרשת עורקים8,13,14, 15,16.
לחוקרים בחירה בין מודלים חייתיים של פיזיולוגיה וסקולרית ומחלות, הארנב יש מספר יתרונות. כלי גדול יותר של ארנבים לעומת מכרסמים, לאפשר קל כירורגי מניפולציה, שימוש של endovascular התקנים בהם כמות גדולה של רקמות עבור מדידות כמותיים. ארנבים הם קרובים יותר phylogenetically פרימטים מאשר הם מכרסמים17, מגוון גנטי גדול ארנבים outbred קירוב טוב יותר ההשתנות גנטי של בני אדם. מגוון גנטי חשוב במיוחד ללימודים פרה, אשר-על-ידי שלהם בטבע-aim לפתח טיפולים שניתן להחיל באוכלוסייה אנושית מגוונת מבחינה גנטית. כמו עם מינים רבים, אם לא כל שאר מודל, ארנב גנים בקלות לשכפל או מסונתז כי יש כבר וסודרו הגנום ארנב עם כיסוי גבוה (7.48 x) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway?db=oryCun2]. לעומת דגמים בעלי חיים גדולים אחרים (כגון כלבים, חזירים או כבשים), ארנבים הם זולים יחסית וניתן לרכוש, הבית וכל אלה קל יותר לגדל ולטפל. מחלת כלי דם ספציפית הדגמים בארנבים כל יש משלהם יתרונות, חסרונות כמו מודלים של מחלות אנושיות כי הם מעבר להיקף זה כתב היד8,12,18. חוקר לעיין אלה יתרונות, חסרונות כדי לקבוע אם הארנב הוא המודל הטוב ביותר בשביל לענות על שאלה ספציפית ניסיוני.
הקדמה של רצפי רגולטוריות חומצה deoxyribonucleic (DNA) לתוך תאי אנדותל ויוו מאפשר חקירה של הפעילות של רצפי אלה בסביבה הפיזיולוגיות מורכבת. מחקרים במבחנה בתאי האנדותל transfected יכול להיות שימושי עבור הערכה ראשונית של רצפי DNA תקינה; עם זאת, רמות הביטוי במודלים תרביות רקמה הם לפעמים לא לשכפל כאשר המחקרים חוזרים ונשנים ויוו5,19,20. מערכות במבחנה ניתן גם שימושי עבור חקר מסלולים בסיסיים של חלבון איתות, פיזיולוגיה אנדותל כמו גם תקשורת בין תאים בתרבית כלי דם; עם זאת, מורכבת יותר מסלולים או רשתות רגולטוריות מושפעים אוכלוסיות מורכבות של התאים הסמוכים כלי הדם או המערכת החיסונית נלמדים בצורה הטובה ביותר אין ויוו מערכת6,20. השיטה המתוארת במסמך זה מספק פלטפורמה עבור חקר רגולציה של ביטוי transgene אנדותל בתוך ההקשר של כלי שלם, עם או בלי מחלות. המערכת ויוו מאפשרת גם חקירת crosstalk הסלולר פיזיולוגיים ופתולוגיים וזיהוי של תרומות של המערכת החיסונית כדי ויסות של ביטוי גנים6.
נבט-קו transgenesis (בעיקר בעכברים) היא גישה חלופית להכוונת transgene ביטוי לתאי אנדותל. גישה זו יכולים לספק ביטוי transgene חיים ארוך, אנדותל מיקוד מתווכת על ידי יזם ספציפי או אזורים רגולטוריות21,22. עם זאת, הדור של העכברים הטרנסגניים היא יקרה ועתירת, מספר קווי הטרנסגניים חייב להיבדק לעתים קרובות כדי להבטיח פילוח של transgene סוג התא הרצוי, ההישג של רמות ביטוי הולם transgene, וניסויים תוצאות מאתר מערכות יכול להיות תלויי-מתח. מודלים מהונדס מאתר עם transgenes אנדותל במיקוד יש יתרונות רבים: אין צורך לבצע ניתוח על כל חיה ניסיוני על מנת להשיג transgenesis, ניתן לגדל עכברים ניסיוני עם רבים אחרים זמינים העכברים הטרנסגניים ב כדי לבדוק אינטראקציות הגנטי פנוטיפי ו, ויש מבחר רחב של נוגדנים כי מגיבים עם מאתר חלבונים, דבר המקל על אפיון של פנוטיפים. עם זאת, פילוח של transgenes אנדותל דרך קו נבט בדרך כלל תוצאות בביטוי transgene ברחבי להערכת,22 ולכן קשה לקבוע את האתר שבו פועלת המוצר transgene. זה נכון במיוחד כאשר המוצר transgene מופרש, כי מוצר transgene מופרש על ידי תאי אנדותל ברחבי להערכת יכול להיות פעילות ביולוגית-כל מספר של האתרים שבתוך חיה. למרות השיטה המתוארת בכתב יד זה דורש מומחיות טכנית ומתקנים מיוחדים, זה יכול להיות פחות זמן רב ויקרים פחות לפתח קו העכבר הטרנסגניים אנדותל ספציפיים. זה מאפשר ההערכה של הפונקציה של חלבון באופן בררני בתאי האנדותל של קטע של עורק גדול, הוא מאפשר שימוש contralateral שחתך את עורק הצוואר כפקד לזווג (סילוק גורמים מערכתית יכולה להשתנות בין ניסיוני בעלי חיים-למשל, לחץ דם או רמות כולסטרול-כמשתנים בלתי מבוקרת).
ריפוי גנטי היא גישה מבטיחה לטיפול של מחלות לב וכלי דם, מחלות כרוניות במיוחד, כי יישום יחיד יכול לספק מתמשכת או חיים ארוך יכול להיות ביטוי של גנים טיפוליים23. ההבטחה טיפולית של טיפול גנטי יש נחקרו במודלים חייתיים של העברה גנטית הסומטית, לעיתים קרובות מיקוד כבד24,25, המהווה מטרה קלה יחסית מכיוון וקטורים ויראלי נישא בדם רבים hepatotropic. עם זאת, יש השפעה על מחלת כלי דם, ריפוי גנטי כמטרה בכבד חייב להשיג מערכתית ביטוי של חלבונים. פעולה זו דורשת בדרך כלל מינונים גבוהים של וקטור, אשר יכול להיות רעילים או אפילו קטלני26. יתר על כן, מערכתית רמות גבוהות של העלאה חלבון הסיכון של תופעות לוואי המטרה, אשר יכול לסבך או אפילו לטשטש פרשנות של תוצאות הניסוי. ריפוי גנטי המקומי מיקוד אנדותל כלי הדם כמתואר בכתב יד זה יכול למנוע תופעות לוואי מערכתית מכיוון הווקטור חדורים לא המופץ נרחב מעבר המקטע העורקים transduced, אפקטים וסקולרית מקומית יכולה להיות מושגת ללא שינויים ברמות הפלסמה מערכתית של חלבון. 27 . בנוסף, סכום נמוך בהרבה של וקטור יש צורך מגלי מקטע עורקי ממה הוא צריך להשיג התמרה חושית הכבד חזקים. Transgene ביטוי מן הכבד דווח לרדת לאורך זמן, כנראה בגלל מחזור התא, הדורש מינון חוזרות אם הביטוי transgene ברמה גבוהה היא תישמר. 28 , לעומת זאת, שיעור תחלופה נמוכה אנדותל מספק הביטוי יציבה לפחות 48 שבועות בארנבים צ'או-fed לפחות 24 שבועות בנגעים טרשת עורקים כולסטרול-fed ארנבים. 1 , 27
כדי לקבוע אם שיטה זו של העברה גנטית כדי אנדותל לעורק הצוואר נפוץ ארנב מתאים, היתרונות והחסרונות (טבלה 1) להתייחס בהקשר של מטרות מחקר ספציפי. היתרונות של שיטה זו כוללים: outbred הארנבים נציגה טובה יותר של מגוון גנטי אנושי מאשר עכברים המפגרים (חשוב לעבודה פרה); ארנבים לספק כלי גדול יותר עבור מניפולציה קל יותר רקמות לצורך ניתוח; השיטה ניתן להשיג transgene, ממוקדות אנדותל ביטוי הרבה יותר מהר מאשר נבט-קו אנדותל פילוח העכברים הטרנסגניים; מינון וקטור ניתן להתאים בקלות לרמות משתנה דגם של ביטוי transgene; תהליכים ספציפיים אנדותל בעורק גדול יכול ייחקרו; transgenesis וסקולרית מקומית מאפשרת בעורק מול אותה חיה כדי לשמש פקד, סילוק גורמים מערכתית כמשתנים בלתי מבוקרת. החסרונות כוללים: שירותים מיוחדים ומומחיות נדרשים; רקעים מהונדסים פחות שעליו להתנסות זמינים ב ארנבים מאשר עכברים; ויש מבחר פחות נרחב של נוגדנים הארנב לעומת עכבר חלבונים (עבור immunodetection של חלבונים transgene, אנטיגנים אחרים שעשויים להיות חשוב לפרש תוצאות ניסויית).

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Disposables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3mL syringe with 24G needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>309571</td><td>2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery</td></tr><tr><td>1mL syringe with 27G needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>309623</td><td>6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery</td></tr><tr><td>20mL syringe, luer lock</td><td>Nipro Medical Corp</td><td>JD+20L</td><td></td></tr><tr><td>Catheters, 24G x 3/4&quot;</td><td>Terumo Medical Products</td><td>SROX2419V</td><td></td></tr><tr><td>19G needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305187</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>21G needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305165</td><td>For 20 mL syringe of saline</td></tr><tr><td>Gauze 4&quot; x 4&quot;</td><td>Dynarex</td><td>3242</td><td>~10-15 per surgery</td></tr><tr><td>3-0 silk suture</td><td>Covidien Ltd.</td><td>S-244</td><td></td></tr><tr><td>5-0 silk suture</td><td>Covidien Ltd.</td><td>S-182</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>7-0 polypropylene suture</td><td>CP Medical</td><td>8648P</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>5-0 polyglycolic acid suture</td><td>CP Medical</td><td>421A</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>3-0 polyglycolic acid suture</td><td>CP Medical</td><td>398A</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>Alcohol swabs</td><td>Covidien Ltd.</td><td>6818</td><td>For placement of I.V. line</td></tr><tr><td>Catheter plug</td><td>Vetoquinol</td><td>411498</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>Ketamine HCl, 100 mg/mL</td><td>Vedco Inc.</td><td>05098916106</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine, 100 mg/mL</td><td>Akorn Inc.</td><td>4821</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine HCl, 2%</td><td>Pfizer</td><td>00409427702</td><td></td></tr><tr><td>Bupivacaine HCl, 0.5%</td><td>Pfizer</td><td>00409161050</td><td></td></tr><tr><td>Beuthanasia D-Special</td><td>Intervet Inc.</td><td>NDC 00061047305</td><td>Harvest surgery only</td></tr><tr><td>Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL&amp;nbsp;</td><td>Patterson Veterinary</td><td>12496075705</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>Saline IV bag, 0.9% sodium chloride</td><td>Baxter</td><td>2B1309</td><td>2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one</td></tr><tr><td>Heparin&amp;nbsp; (5000 U/mL)</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-047-10</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>Fentanyl patch, 25 mcg/hr&amp;nbsp;</td><td>Apotex Corp.</td><td>NDC 60505-7006-2</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Multiple vendors</td><td>Catalog number not available</td><td></td></tr><tr><td>Gene transfer vector</td><td></td><td></td><td>Dilute 350 &amp;micro;L per artery; 2 x 10&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt; vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Surgical Instruments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metzenbaum needle holder 7&quot; straight</td><td>Roboz</td><td>RS-7900</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>Operating scissors 6.5&quot; straight blunt/blunt</td><td>Roboz</td><td>RS-6828</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder /w suture scissors</td><td>Miltex</td><td>8-14-IMC</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>Castroviejo scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5658</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo needle holder, 5.75&quot; straight with lock</td><td>Roboz</td><td>RS-6412</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>Stevens scissors 4.25&quot; curved blunt/blunt</td><td>Roboz</td><td>RS-5943</td><td></td></tr><tr><td>Alm retractor 4&quot; 4X4 5mm blunt prongs</td><td>Roboz</td><td>RS-6514</td><td>2x</td></tr><tr><td>Backhaus towel clamp 3.5&quot;</td><td>Roboz</td><td></td><td>4x</td></tr><tr><td>Micro clip setting forceps 4.75&quot;</td><td>Roboz</td><td>RS-6496</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>Micro vascular clips, 11 mm</td><td>Roboz</td><td></td><td>2x for gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>Surg-I-Loop</td><td>Scanlan International</td><td>1001-81M</td><td>5 cm length</td></tr><tr><td>Bonaccolto forceps, 4&amp;rdquo; (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width</td><td>Roboz</td><td>RS-5210</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5042</td><td></td></tr><tr><td>Graefe forceps, 4&amp;rdquo; (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip</td><td>Roboz</td><td>RS-5280</td><td></td></tr><tr><td>Halstead mosquito forceps,&amp;nbsp; 5&quot; straight, 1.3mm tips</td><td>Roboz</td><td>RS-7110</td><td>2x</td></tr><tr><td>Halstead mosquito forceps,&amp;nbsp; 5&quot; curved, 1.3mm tips</td><td>Roboz</td><td>RS-7111</td><td></td></tr><tr><td>Jacobson mosquito forceps 5&quot; curved extra delicate, 0.9 mm tips</td><td>Roboz</td><td>RS-7117</td><td></td></tr><tr><td>Kantrowitz forceps, 7.25&quot; 90 degree delicate, 1.7 mm tips</td><td>Roboz</td><td>RS-7305</td><td></td></tr><tr><td>Tissue forceps 5&quot;, 1X2 teeth, 2 mm tip width</td><td>Roboz</td><td>RS-8162</td><td></td></tr><tr><td>Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width</td><td>Fine Science Tools</td><td>11092-12</td><td>2x</td></tr><tr><td>Adson forceps, 12 cm, serrated, straight</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Veterinary electrosurgery handpiece and electrode</td><td>MACAN Manufacturing</td><td>HPAC-1; R-F11</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Surgical Suite Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Circulating warm water blanket and pump</td><td>Multiple vendors</td><td>Catalog number not available</td><td></td></tr><tr><td>Forced air warming unit</td><td>3M</td><td>Bair Hugger Model 505</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>IV infusion pump</td><td>Heska</td><td>Vet IV 2.2</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>Isoflurane vaporizer and scavenger</td><td>Multiple vendors</td><td>Catalog number not available</td><td></td></tr><tr><td>Veterinary multi-parameter monitor</td><td>Surgivet</td><td>Surgivet Advisor</td><td></td></tr><tr><td>Veterinary electrosurgery unit</td><td>MACAN Manufacturing</td><td>MV-9</td><td></td></tr><tr><td>Surgical microscope</td><td>D.F. Vasconcellos</td><td>M900</td><td>Needs ~16x magnification</td></tr></tbody></table>

in vivo gene transfer to the rabbit common carotid artery endothelium

המטרה של שיטה זו היא להציג את transgene לתוך אנדותל של שני בעורקים ארנב נפוצות מקטעי מבודד. השיטה משיגה מוקד transgenesis אנדותל סלקטיבית, ובכך לאפשר חוקר כדי לקבוע את התפקידים הביולוגיים של אנדותל הביע transgenes וכדי לכמת את הפעילות תעתיק ויוו של רצפי DNA בעורק גדול תאי אנדותל. השיטה משתמשת בידוד כירורגי של עורק נפוצות ארנב, arteriotomy כדי לספק וקטור ויראלי לבטא transgene לתוך לומן עורקי. תקופת דגירה קצרה וקטור בלומן, עם השאיפה עוקבות של התכנים לומן, מספיקה להשיג ביטוי עמיד ויעיל transgene ב אנדותל, ללא לזיהוי התמרה חושית או מחוץ לביטוי פלח עורקי מבודד. השיטה מאפשרת הערכה של הפעילות הביולוגית של מוצרים transgene עורקים רגילים והן במודלים של מחלת כלי דם אנושי, תוך הימנעות תופעות מערכתיות יכולה להיגרם גם על ידי מיקוד המסירה הגן לאתרים אחרים (למשל. הכבד) או על ידי הגישה החלופית של אספקת מבנים גנטיים אנדותל מאת נבט קו transgenesis. היישום של השיטה הוא מוגבל על ידי הצורך מנתח מנוסה, כמו כן, חדר הפעלה המאובזר, את העלויות של רכישת דיור ארנבים, והצורך מומחיות העברה גנטית וקטור בנייה ושימוש. התוצאות המתקבלות בשיטה זו כוללים: שינויים הקשורים transgene מבנה עורקי, cellularity, מטריצה חוץ-תאית או פונקציית עושות; עליות או הפחתות דלקת עורקים; שינויים תא וסקולרית אפופטוזיס; התקדמות, פיגור או רגרסיה של מחלות כגון היפרפלזיה intimal או טרשת עורקים. השיטה מאפשרת מדידה של היכולת של רצפי רגולטוריות DNA יליד וסינתטיים לשנות את הביטוי transgene בתאי האנדותל, מתן תוצאות הכוללות: רמות של transgene ה-mRNA, רמות החלבון transgene, רמות של transgene פעילות אנזימטיות.

כדי ליישם שיטה זו בביטחון, ניסויים מוקדמים נחוצים לבסס האופרטור משיגה העברה גנטית לשחזור ויעילה, עם transgene ביטוי בעיקר בתאי האנדותל luminal. מניסיוננו, זה בקלות הרבה ביותר שקובעת באמצעות וקטור המבטאת β-galactosidase. 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-גל) צביעת מקטעי לעורק הצוואר נפוץ הוסר 3 ימים לאחר אינפוזיה וקטור, כמו גם מדידה של β-galactosidase mRNA (messenger RNA) עם שרשרת של פולימראז כמותיים שעתוק במהופך התגובה (לרביעיית-PCR), תחשוף יעילות, הפארמצבטית ומיקום של תאי transduced. לניסויים לחקור את ההשפעות של הביטוי transgene או למדוד את הפעילות של אלמנטים תעתיק cis אקטינג, אנו בדרך כלל מודדים transgene mRNA וגם אינדיקציה ראשונית של רמת הפארמצבטית של העברה גנטית.
מפעיל חדש במעבדה שלנו ביקשה להקים מיומנות בשיטה זו על-ידי transducing הארנב נפוצות עורק עם וקטור adenoviral (2 x 1011 סמנכ ל/mL) לבטא את transgene β-galactosidase, מונע על ידי cytomegalovirus (CMV) יזם. העורקים transduced שנקטפו 3 ימים לאחר מכן, נחתכו באופן רוחבי למקטעים. מקטעים בודדים היו אז גם החלק הפתוח axially או שמאלה כמו טבעות ללא פגע. כל המקטעים היו X-גל צבעונית microcentrifuge צינורות. חלקי נחתכו פתוח axially הונחו על משטח אופקי ועל פני השטח luminal מקסימאלית נחשף, באמצעות סיכות לפי הצורך כדי למנוע על הקטע של תבוסתנות. תמונות פנים en של משטחים luminal הראה מכתים אנדותל חזקים עם X-גל (דמויות 3A ו- 3B). תמונות ההדמיה של משטחים luminal של טבעות לעורק הצוואר ללא פגע הראה X-גל להכתים רק על פני השטח luminal (דמויות 3C ו- 3D). הקטעים זה נפתחה axially היו מעובד פרפין, למחלקה, נגד מוכתם או hematoxylin ואאוזין או הגרעין האדום מהר. תמונות הצג X-גל מכתים בעיקר בתחום אנדותל, למרות שיש כמות קטנה של צביעת שכבה adventitial (דמויות 3E , 3F). התמרה חושית של תאים adventitial יכול להתרחש באמצעות דליפה של וקטור דרך האתר arteriotomy או על ידי דליפה באמצעות סניפים קטן proximal לאתרים של צד סניף מצדו. 29
בניסוי נפרדים, מפעיל חדש ביקשה להקים מיומנות בהשגת רמות לשחזור ביטוי transgene, כהקדמה ניסויים שמטרתם לחקור פעילות ביולוגית של transgenes. ארנב בעורקים הנפוצים היו transduced עם העוזר תלוית אדנו (2 x 1011 סמנכ ל/mL) המכיל גם אפו של A-I (HDAdApoAI) או transgene IL-10 (HDAdIL10), שניהם תחת שליטה של מקדם CMV. העורקים transduced היו שנקטפו 3 ימים לאחר התמרה חושית וחותכים באופן רוחבי למקטעים. RNA שהופק מתוך כלי השיט מקטעים ולאחר apo א- ו -IL-10 mRNA ביטויים היו לכמת על ידי לרביעיית-PCR, עם נורמליזציה כדי גליצראלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) mRNA של אותה תמציות (איור 4). ב- HDAdIL10-transduced העורקים, רק 1 מתוך 6 העורקים היה נמוך מאוד, אבל לזיהוי apo A-אני אות ה-mRNA. כלומר הביטוי של apo A-אני mRNA היה גדול 700-fold של כלי transduced עם HDAdApoAI יותר בכלי transduced עם HDAdIL10. רמות נמוכות של mRNA IL-10 אנדוגני אותרו העורקים HDAdApoAI-transduced, עם ממוצע ביטוי מוגבר 6-fold בתוך העורקים HDAdIL10-transduced. ראוי לציין, אין ניכר artery אינטרה בין השתנות התמרה חושית ויעילות ביטוי transgene, כפי שמוצג דמויות 3 ו- 4, בהתאמה. אנו מוצאים ההשתנות אפילו עם נהגים מנוסים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56982/56982fig1.jpg"> איור 1 . Arteriotomy של עורק תרדמני. מלקחיים בסדר משמשים כדי לתפוס את העורק הראשי adventitia ולהחיל גרירה כלפי מעלה על העורק. זה תמרון מרחיבה את כלי השיט לומן ומייצר משטח אנכי שלתוכו כפופות 19 ז המחט מוחדרת, ובכך מפחיתים את הסיכון של תקר הקיר האחורי של העורק. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56982/56982fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56982/56982fig2.jpg"> איור 2 . סגירת arteriotomy תרדמני נפוצות. Arteriotomy נסגר בתפר פוליפרופילן 7-0, באמצעות X-דוגמת מילוי. המעבר הראשון של המחט, תפר נכנס לומן עורק בתחתית נכון arteriotomy (אתר 1) ויוצא לומן בפינה השמאלית התחתונה (אתר 2). מחט תפר לחצות את arteriotomy ואת הזן מחדש לומן בפינה הימנית העליונה (אתר 3). המחט ואז ייסגר לומן בפינה השמאלית העליונה (אתר 4). המתיחה עדין בשני קצוות התפר סוגר את arteriotomy. הקצוות תפר (יציאה מן האתר 1 והאתר 4) קשורות עם 2 קשרים כיכר. עיגולים אפורים מייצגים באתרים של התפרים עובר דרך הקיר כלי. כקווים כחולים מלאים מציינים אזורים מחוץ הקיר כלי איפה התפר. קווים כחולים מנוקדים מציינים אזורים איפה התפר בתוך לומן. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56982/56982fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56982/56982fig3.jpg"> איור 3 . הביטוי transgene אנדותל יעיל. ארנב נפוצות עורק היו transduced עם וקטור adenoviral לבטא transgene β-galactosidase ושנקטפו 3 ימים מאוחר יותר. עורק transduced מקטעים היו מוכתמים טבעות שלם או לאחר שנפתח עם החתך צירית X-גל. (A-B) En תמונות פנים של משטחים luminal של טבעות העורק נחתכו פתוח axially. (C-D) תצוגות מפוח לחלל luminal של טבעות לעורק הצוואר ללא פגע. (E-F) X-גל צבעונית, פרפין-מוטבע מקטעי העורק היו למחלקה, נגד מוכתם או hematoxylin (E) ואאוזין או אדום מהיר גרעינית (F). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אני = אינטימה; M = מדיה; ו- A = adventitia. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56982/56982fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56982/56982fig4.jpg"> איור 4 . כימות של הביטוי mRNA transgene. ארנב נפוצות עורק היו transduced עם אדנו תלויי-המסייע לבטא גם apo A-I (HDAdApoAI) או IL-10 (HDAdIL10) תחת שליטה של מקדם CMV. העורקים נקטפו שלושה ימים לאחר מכן. הביטוי mRNA של A Apo (A)-אני ואת (B) IL-10 היו לכמת על ידי לרביעיית-PCR מנורמל ל mRNA GAPDH בעורק אותו, המבוטא ביחידות שרירותי (AU). בר מציין הערך הממוצע; ערך P הוא סכום-דרגה במבחן. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56982/56982fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>יתרונות</td>
			<td>חסרונות</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">לעומת מודלים מכרסמים</td>
			<td>קרוב phylogenetically פרימטים</td>
			<td>יקר יותר לרכוש בית</td>
		</tr>
<tr>
<td>מגוון גנטי גדול, הקלות תרגום קליני</td>
			<td>יותר קשה לגדל ולטפל</td>
		</tr>
<tr>
<td>ספינות גדולות יותר לאפשר מניפולציה כירורגי קל ומספקת יותר רקמות עבור ניתוח כמותי</td>
			<td>דרישות רגולטוריות מקיפה יותר</td>
		</tr>
<tr>
<td>מאפשר שימוש של endovascular התקנים שנועדו עבור בני אדם</td>
			<td>רקעים מהונדסים פחות</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>מבחר פחות-נרחב של נוגדנים ארנב חלבונים</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">לעומת דגמים בעלי חיים גדולים</td>
			<td>זול יחסית לרכוש בית</td>
			<td>יכול להיות רלוונטי פחות קלינית מאשר דגמים אחרים בעלי חיים גדולים עבור כמה מחלות כלי דם</td>
		</tr>
<tr>
<td>קל יותר לגדל ולטפל</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">בהשוואה נבט-קו Transgenesis</td>
			<td>Transgene באה לידי ביטוי רק בעורק גדול; ההשפעה של transgene במיוחד באתר עניין יכול להיקבע</td>
			<td>יישום השיטה לתאים חוץ אנדותל קשה</td>
		</tr>
<tr>
<td>באפשרותך להשתמש בעורק contralateral כפקד מזווג; מבטל פרמטרים מערכתית (למשל., לחץ דם, רמת כולסטרול) כמשתנים בלתי מבוקרת</td>
			<td>חדר הניתוח ומומחיות כירורגי חובה; ליבה של מתקנים סביר לא זמין</td>
		</tr>
<tr>
<td>תפוקה גבוהה יותר עבור בדיקות DNA רצף רגולטורי פעילות אנדותל קיבול גדול</td>
			<td>Transgene לא יכול להתבטא רוב המיטות כלי דם</td>
		</tr>
<tr>
<td>שעשויות להיות מהיר יותר ויקרים פחות</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>חשיפה מערכתית לא סביר הטרנסגניים חלבון – מזעור תופעות את המטרה</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">לעומת גישות ריפוי גנטי מערכתית (למשל. התמרה חושית הכבד דרך הווריד היקפיים הזרקה)</td>
			<td>הביטוי transgene היציבה יותר מאשר טיפול מערכתי גנטי (כבד)</td>
			<td>וקטור, משלוחים דורשים התערבות כירורגית</td>
		</tr>
<tr>
<td>Transgene הביע בדופן העורק, המאפשר משלוח מקומי של רמות גבוהות של חלבון מהונדס</td>
			<td>חדר הניתוח ומומחיות כירורגי נדרש</td>
		</tr>
<tr>
<td>חשיפה מערכתית לא סביר הטרנסגניים חלבון – מזעור תופעות את המטרה</td>
			<td>הטיפול מוגבל העורקים המיועדים באופן ספציפי עבור התערבות; אינה מתייחסת גורמים מערכתית (למשל., שומנים)</td>
		</tr>
<tr>
<td>באפשרותך להשתמש בעורק contralateral כפקד מזווג; מבטל פרמטרים מערכתית (למשל, לחץ דם, רמת כולסטרול) כמשתנים בלתי מבוקרת</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>נמוך בהרבה וקטור במינון הנדרש</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1. יתרונות וחסרונות של הארנב העורק נפוצות ג'ין אנדותל סלקטיבית העברה מודל.

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium at JoVE.com

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

שיטה זו היא להציג את transgene לתוך אנדותל עורקי התרדמה ארנב. הקדמה של transgene מאפשר את ההערכה של תפקיד ביולוגי של המוצר transgene העורקים נורמלי או מחלת מודלים. השיטה שימושית גם למדידת פעילות של רצפי DNA תקינה.

אין ויוו העברה גנטית כדי אנדותל העורק נפוצות הארנב

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

in-vivo-gene-transfer-to-the-rabbit-common-carotid-artery-endothelium

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

9.1K Views.  University of Washington. שיטה זו היא להציג את transgene לתוך אנדותל עורקי התרדמה ארנב. הקדמה של transgene מאפשר את ההערכה של תפקיד ביולוגי של המוצר transgene העורקים נורמלי או מחלת מודלים. השיטה שימושית גם למדידת פעילות של רצפי DNA תקינה.

Video: In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified version of carotid partial ligation methods [1,2] to show that it acutely induces low and oscillatory flow conditions, two key characteristics of disturbed flow, in the mouse common carotid artery. Using this model, we have provided direct evidence that disturbed flow indeed leads to rapid and robust atherosclerosis development in Apolipoprotein E knockout mouse [3]. We also developed a method of endothelial RNA preparation with high purity from the mouse carotid intima [3]. Using this mouse model and method, we found that partial ligation causes endothelial dysfunction in a week, followed by robust and rapid atheroma formation in two weeks in a hyperlipidemic mouse model along with features of complex lesion formation such as intraplaque neovascularization by four weeks. This rapid in vivo model and the endothelial RNA preparation method could be used to determine molecular mechanisms underlying flow-dependent regulation of vascular biology and diseases. Also, it could be used to test various therapeutic interventions targeting endothelial dysfunction and atherosclerosis in considerably reduced study duration.

This describes a partial carotid ligation surgery, which causes disturbed flow conditions and subsequent atherosclerosis development (in two weeks) with intraplaque neo-vascularization (in four weeks) in the mouse common carotid artery. We also describe a novel method of RNA isolation from the carotid intima, providing high purity endothelial RNA.

המודל של טרשת עורקים Flow-induced מופרע על העורק הראשי עכבר ידי קשירת חלקי שיטה פשוטה של ​​בידוד RNA מן התרדמה האנדותל

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine their efficacy and safety.
Gene therapy using viral vectors is one of the most promising approaches for treating cardiac diseases. Viral delivery of various different genes by changing the carrier gene has immeasurable therapeutic potential.
In this video, the full process of an animal model of heart failure creation followed by gene transfer is presented using a swine model. First, myocardial infarction is created by occluding the proximal left anterior descending coronary artery. Heart remodeling results in chronic heart failure. Unique to our model is a fairly large scar which truly reflects patients with severe heart failure who require aggressive therapy for positive outcomes. After myocardial infarct creation and development of scar tissue, an intracoronary injection of virus is demonstrated with simultaneous nitroglycerine infusion. Our injection method provides simple and efficient gene transfer with enhanced gene expression. This combination of a myocardial infarct swine model with intracoronary virus delivery has proven to be a consistent and reproducible methodology, which helps not only to test the effect of individual gene, but also compare the efficacy of many genes as therapeutic candidates.

A method of gene transfer for the treatment of ischemic heart failure is described using a swine model of myocardial infarction. Our simple and reproducible method enables us to readily evaluate the efficacy of various gene transfers with a very simple and reproducible way.

Gene Transfer לאי ספיקת לב איסכמי במודל פרה

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine ...

Vascular Gene Transfer from Metallic Stent Surfaces Using Adenoviral Vectors Tethered through Hydrolysable Cross-linkers

In-stent restenosis presents a major complication of stent-based revascularization procedures widely used to re-establish blood flow through critically narrowed segments of coronary and peripheral arteries. Endovascular stents capable of tunable release of genes with anti-restenotic activity may present an alternative strategy to presently used drug-eluting stents. In order to attain clinical translation, gene-eluting stents must exhibit predictable kinetics of stent-immobilized gene vector release and site-specific transduction of vasculature, while avoiding an excessive inflammatory response typically associated with the polymer coatings used for physical entrapment of the vector. This paper describes a detailed methodology for coatless tethering of adenoviral gene vectors to stents based on a reversible binding of the adenoviral particles to polyallylamine bisphosphonate (PABT)-modified stainless steel surface via hydrolysable cross-linkers (HC). A family of bifunctional (amine- and thiol-reactive) HC with an average t1/2 of the in-chain ester hydrolysis ranging between 5 and 50 days were used to link the vector with the stent. The vector immobilization procedure is typically carried out within 9 hr&#160;and consists of several steps: 1) incubation of the metal samples in an aqueous solution of PABT (4 hr); 2) deprotection of thiol groups installed in PABT with tris(2-carboxyethyl) phosphine (20 min); 3) expansion of thiol reactive capacity of the metal surface by reacting the samples with polyethyleneimine derivatized with pyridyldithio (PDT) groups (2 hr); 4) conversion of PDT groups to thiols with dithiothreitol (10 min); 5) modification of adenoviruses with HC (1 hr); 6) purification of modified adenoviral particles by size-exclusion column chromatography (15 min) and 7) immobilization of thiol-reactive adenoviral particles on the thiolated steel surface (1 hr). This technique has wide potential applicability beyond stents, by facilitating surface engineering of bioprosthetic devices to enhance their biocompatibility through the substrate-mediated gene delivery to the cells interfacing the implanted foreign material.

These studies report on reversible attachment of adenoviral gene vectors to coatless metal surfaces of stents and model mesh disks. Sustained release of transduction-competent viral particles contingent upon hydrolysis of cross-linkers used for vector immobilization results in a durable site-specific transgene expression in vascular cells and in stented arteries.

העברת כלי דם ג&#39;ין ממתכת סטנט משטחים באמצעות adenoviral וקטורי Tethered דרך Hydrolysable חוצה linkers

In-stent restenosis presents a major complication of stent-based revascularization procedures widely used to re-establish blood flow through critically ...

Vascular Balloon Injury and Intraluminal Administration in Rat Carotid Artery

The carotid artery balloon injury model in rats has been well established for over two decades. It remains an important method to study the molecular and cellular mechanisms involved in vascular smooth muscle dedifferentiation, neointima formation and vascular remodeling. Male Sprague-Dawley rats are the most frequently employed animals for this model. Female rats are not preferred as female hormones are protective against vascular diseases and thus introduce a variation into this procedure. The left carotid is typically injured with the right carotid serving as a negative control. Left carotid injury is caused by the inflated balloon that denudes the endothelium and distends the vessel wall. Following injury, potential therapeutic strategies such as the use of pharmacological compounds and either gene or shRNA transfer can be evaluated. Typically for gene or shRNA transfer, the injured section of the vessel lumen is locally transduced for 30 min with viral particles encoding either a protein or shRNA for delivery and expression in the injured vessel wall. Neointimal thickening representing proliferative vascular smooth muscle cells usually peaks at 2 weeks after injury. Vessels are mostly harvested at this time point for cellular and molecular analysis of cell signaling pathways as well as gene and protein expression. Vessels can also be harvested at earlier time points to determine the onset of expression and/or activation of a specific protein or pathway, depending on the experimental aims intended. Vessels can be characterized and evaluated using histological staining, immunohistochemistry, protein/mRNA assays, and activity assays. The intact right carotid artery from the same animal is an ideal internal control. Injury-induced changes in molecular and cellular parameters can be evaluated by comparing the injured artery to the internal right control artery. Likewise, therapeutic modalities can be evaluated by comparing the injured and treated artery to the control injured only artery.

This protocol uses a balloon catheter to cause an intraluminal injury on the rat carotid artery and henceforth elicit neointimal hyperplasia. This is a well-established model for studying the mechanisms of vascular remodeling in response to injury. It is also widely used to determine the validity of potential therapeutic approaches.

כלי דם בלון פגיעה וIntraluminal מנהל בעורקי תרדמת העכברוש

The carotid artery balloon injury model in rats has been well established for over two decades. It remains an important method to study the molecular and ...

The Rabbit Model of Accelerated Atherosclerosis: A Methodological Perspective of the Iliac Artery Balloon Injury

Acute coronary syndrome resulting from coronary occlusion following atherosclerotic plaque development and rupture is the leading cause of death in the industrialized world. New Zealand White (NZW) rabbits are widely used as an animal model for the study of atherosclerosis. They develop spontaneous lesions when fed with atherogenic diet; however, this requires long time of 4 - 8 months. To further enhance and accelerate atherogenesis, a combination of atherogenic diet and mechanical endothelial injury is often employed. The presented procedure for inducing atherosclerotic plaques in rabbits uses a balloon catheter to disrupt the endothelium in the left iliac artery of NZW rabbits fed with atherogenic diet. Such mechanical damage caused by the balloon catheter induces a chain of inflammatory reactions initiating neointimal lipid accumulation in a time dependent fashion. Atherosclerotic plaque following balloon injury show neointimal thickening with extensive lipid infiltration, high smooth muscle cell content and presence of macrophage derived foam cells. This technique is simple, reproducible and produces plaque of controlled length within the iliac artery. The whole procedure is completed within 20 - 30 min. The procedure is safe with low mortality and also offers high success in obtaining substantial intimal lesions. The procedure of balloon catheter induced arterial injury results in atherosclerosis within two weeks. This model can be used for investigating the disease pathology, diagnostic imaging and to evaluate new therapeutic strategies.

Animal models of atherosclerosis are essential to understand the mechanism and to investigate newer approaches to prevent plaque development or rupture, a leading cause of death in the industrialized world. This protocol uses a combination of balloon injury and cholesterol rich diet to induce atherosclerotic plaques in rabbit iliac artery.

הדגם הארנב של טרשת עורקים מואצת: מבט מתודולוגי הפגיעה בעורק Iliac בלון

Acute coronary syndrome resulting from coronary occlusion following atherosclerotic plaque development and rupture is the leading cause of death in the ...

A Rabbit Model of Durable Transgene Expression in Jugular Vein to Common Carotid Artery Interposition Grafts

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, intimal hyperplasia, and atherosclerosis. The goal of this article is to demonstrate a method for placing bilateral venous interposition grafts in a rabbit, then transducing the grafts with a gene transfer vector that achieves durable transgene expression. The method allows the investigation of the biological roles of genes and their protein products in normal vein graft homeostasis. It also allows the testing of transgenes for the activities that could prevent vein graft failure, e.g., whether the expression of a transgene prevents the neointimal growth, reduces the vascular inflammation, or reduces atherosclerosis in rabbits fed with a high-fat diet. During an initial survival surgery, the segments of right and left external jugular vein are excised and placed bilaterally as reversed end-to-side common carotid artery interposition grafts. During a second survival surgery, performed 28 days later, each of the grafts is isolated from the circulation with vascular clips and the lumens are filled (via an arteriotomy) with a solution containing a helper-dependent adenoviral (HDAd) vector. After a 20-min incubation, the vector solution is aspirated, the arteriotomy is repaired, and flow is restored. The veins are harvested at time points dictated by individual experimental protocols. The 28-day delay between the graft placement and the transduction is necessary to ensure the adaptation of the vein graft to the arterial circulation. This adaptation avoids rapid loss of transgene expression that occurs in vein grafts transduced before or immediately after grafting. The method is unique in its ability to achieve durable, stable transgene expression in grafted veins. Compared to other large animal vein graft models, rabbits have advantages of low cost and easy handling. Compared to rodent vein graft models, rabbits have larger and easier-to-manipulate blood vessels that provide abundant tissue for analysis.

This method describes the placement of interposition vein grafts in rabbits, the transduction of the grafts, and the achievement of durable transgene expression. This allows the investigation of physiological and pathological roles of transgenes and their protein products in grafted veins, and testing of gene therapies for vein graft disease.

דגם ארנב של ביטוי Transgene עמיד ומוחלף כדי שתלי Interposition נפוצים של העורק הראשי

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, ...

Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular disease is the development of ischemia. In severe cases, patients can develop critical limb ischemia in which they experience constant pain and an increased risk of limb amputation. Current therapies for peripheral ischemia include bypass surgery or percutaneous interventions such as angioplasty with stenting or atherectomy to restore blood flow. However, these treatments often fail to the continued progression of vascular disease or restenosis or are contraindicated due to the overall poor health of the patient. A promising potential approach to treat peripheral ischemia involves the induction of therapeutic neovascularization to allow the patient to develop collateral vasculature. This newly formed network alleviates peripheral ischemia by restoring perfusion to the affected area. The most frequently employed preclinical model for peripheral ischemia utilizes the creation of hind limb ischemia in healthy rabbits through femoral artery ligation. In the past, however, there has been a strong disconnect between the success of preclinical studies and the failure of clinical trials regarding treatments for peripheral ischemia. Healthy animals typically have robust vascular regeneration in response to surgically induced ischemia, in contrast to the reduced vascularity and regeneration in patients with chronic peripheral ischemia. Here, we describe an optimized animal model for peripheral ischemia in rabbits that includes hyperlipidemia and diabetes. This model has reduced collateral formation and blood pressure recovery in comparison to a model with a higher cholesterol diet. Thus, the model may provide better correlation with human patients with compromised angiogenesis from the common co-morbidities that accompany peripheral vascular disease.

We describe a surgical procedure used to induce peripheral ischemia in rabbits with hyperlipidemia and diabetes. This surgery acts as a preclinical model for conditions experienced in peripheral artery disease in patients. Angiography is also described as a means to measure the extent of introduced ischemia and recovery of perfusion.

המודל הקליני של איסכמיה הגפיים האחוריות בארנבים סוכרתית

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular ...

A Rabbit Venous Interposition Model Mimicking Revascularization Surgery using Vein Grafts to Assess Intimal Hyperplasia under Arterial Blood Pressure

Although vein grafts have been commonly used as autologous grafts in revascularization surgeries for ischemic diseases, the long-term patency remains poor because of the acceleration of intimal hyperplasia due to the exposure to arterial blood pressure. The present protocol is designed for the establishment of experimental venous intimal hyperplasia by interposing rabbit jugular veins to the ipsilateral carotid arteries. The protocol does not require surgical procedures deep in the body trunk and the extent of the incision is limited, which is less invasive for the animals, allowing long-term observation after implantation. This simple procedure enables researchers to investigate strategies to attenuate the progression of intimal hyperplasia of the implanted vein grafts. Using this protocol, we reported the effects transduction of microRNA-145 (miR-145), which is known to control the phenotype of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the proliferative to the contractile state, into harvested vein grafts. We confirmed the attenuation of intimal hyperplasia of vein grafts by transducing miR-145 before implantation surgery through the phenotype change of the VSMCs. Here we report a less invasive experimental platform to investigate the strategies that can be used to attenuate intimal hyperplasia of vein grafts in revascularization surgeries.

The present protocol aims to experimentally create venous intimal hyperplasia by subjecting veins to arterial blood pressure for developing strategies to attenuate venous intimal hyperplasia following revascularization surgery using vein grafts.

ורידי ארנב מודל האינטרפוזיציה מחקה ניתוח מחדש באמצעות שתלי וריד כדי להעריך את היפרפלזיה באמצעות לחץ דם עורקי

Although vein grafts have been commonly used as autologous grafts in revascularization surgeries for ischemic diseases, the long-term patency remains poor ...

Implantation of Tissue-Engineered Vascular Graft in Mouse Carotid Artery via Cuff Technique

The development of small-diameter vascular grafts has been a global endeavor, with numerous research groups contributing to this field. Animal experimentation plays a pivotal role in assessing the efficacy and safety of vascular grafts, particularly in the absence of clinical applications. Compared to alternative animal models, the mouse implantation model offers several advantages, including a well-defined genetic background, a mature method for disease model construction, and a straightforward surgical procedure. Based on these advantages, the present study devised a simple cuff technique for the implantation of tissue-engineered vascular grafts in the mouse carotid artery. This technique began with the fabrication of polycaprolactone (PCL) small-diameter vascular grafts via electrostatic spinning, followed by the seeding of macrophages onto the grafts through perfusion adsorption. Subsequently,&#160;the cellularized tissue-engineered vascular grafts were transplanted into the mouse carotid artery using the cuff technique to evaluate patency and regenerative capability. After 30 days of in vivo implantation, vascular patency was found to be satisfactory, with evidence of neo-tissue regeneration and the formation of an endothelial layer within the lumen of the grafts. All data were analyzed using statistical and graphing software. This study successfully established a mouse carotid artery implantation model that can be used to explore the cellular sources of vascular regeneration and the mechanisms of action of active substances. Furthermore, it provides theoretical support for the development of novel small-diameter vascular grafts.

Here, a protocol is presented for the implantation of a tissue-engineered vascular graft into the mouse carotid artery using the cuff technique, providing a suitable animal model for investigating vascular tissue regeneration mechanisms.

השתלת שתל כלי דם מהונדס רקמות בעורק הצוואר של העכבר בטכניקת שרוול

The development of small-diameter vascular grafts has been a global endeavor, with numerous research groups contributing to this field. Animal ...

Bioengineering

Carotid Artery and Jugular Vein Interposition: A Technique to Induce Venous Intimal Hyperplasia in Rabbit Model

Source: Nishio, H., et al. <a href="https://www.jove.com/v/60931">A Rabbit Venous Interposition Model Mimicking Revascularization Surgery using Vein Grafts to Assess Intimal Hyperplasia under Arterial Blood Pressure</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates the interposition of the rabbit carotid artery with the jugular vein to induce venous intimal hyperplasia by subjecting the veins to arterial pressure. This model will help investigate molecular and genetic interventions to attenuate the progression of intimal hyperplasia after revascularization surgeries.

עורק התרדמה והווריד הצווארי: טכניקה לגרימת היפרפלזיה אינטימית ורידית במודל ארנב

Source: Nishio, H., et al. A Rabbit Venous Interposition Model Mimicking Revascularization Surgery using Vein Grafts to Assess Intimal Hyperplasia under ...

אין ויוו העברה גנטית כדי אנדותל העורק נפוצות הארנב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

המודל של טרשת עורקים Flow-induced מופרע על העורק הראשי עכבר ידי קשירת חלקי שיטה פשוטה של בידוד RNA מן התרדמה האנדותל

Gene Transfer לאי ספיקת לב איסכמי במודל פרה

העברת כלי דם ג'ין ממתכת סטנט משטחים באמצעות adenoviral וקטורי Tethered דרך Hydrolysable חוצה linkers

כלי דם בלון פגיעה וIntraluminal מנהל בעורקי תרדמת העכברוש

הדגם הארנב של טרשת עורקים מואצת: מבט מתודולוגי הפגיעה בעורק Iliac בלון

דגם ארנב של ביטוי Transgene עמיד ומוחלף כדי שתלי Interposition נפוצים של העורק הראשי

המודל הקליני של איסכמיה הגפיים האחוריות בארנבים סוכרתית

ורידי ארנב מודל האינטרפוזיציה מחקה ניתוח מחדש באמצעות שתלי וריד כדי להעריך את היפרפלזיה באמצעות לחץ דם עורקי

השתלת שתל כלי דם מהונדס רקמות בעורק הצוואר של העכבר בטכניקת שרוול

עורק התרדמה והווריד הצווארי: טכניקה לגרימת היפרפלזיה אינטימית ורידית במודל ארנב

אין ויוו העברה גנטית כדי אנדותל העורק נפוצות הארנב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

המודל של טרשת עורקים Flow-induced מופרע על העורק הראשי עכבר ידי קשירת חלקי שיטה פשוטה של ​​בידוד RNA מן התרדמה האנדותל

Gene Transfer לאי ספיקת לב איסכמי במודל פרה

העברת כלי דם ג'ין ממתכת סטנט משטחים באמצעות adenoviral וקטורי Tethered דרך Hydrolysable חוצה linkers

כלי דם בלון פגיעה וIntraluminal מנהל בעורקי תרדמת העכברוש

הדגם הארנב של טרשת עורקים מואצת: מבט מתודולוגי הפגיעה בעורק Iliac בלון

דגם ארנב של ביטוי Transgene עמיד ומוחלף כדי שתלי Interposition נפוצים של העורק הראשי

המודל הקליני של איסכמיה הגפיים האחוריות בארנבים סוכרתית

ורידי ארנב מודל האינטרפוזיציה מחקה ניתוח מחדש באמצעות שתלי וריד כדי להעריך את היפרפלזיה באמצעות לחץ דם עורקי

השתלת שתל כלי דם מהונדס רקמות בעורק הצוואר של העכבר בטכניקת שרוול

עורק התרדמה והווריד הצווארי: טכניקה לגרימת היפרפלזיה אינטימית ורידית במודל ארנב

המודל של טרשת עורקים Flow-induced מופרע על העורק הראשי עכבר ידי קשירת חלקי שיטה פשוטה של בידוד RNA מן התרדמה האנדותל