עבודה זו נתמכה על ידי NIH (RO1-NS090390). כן נרצה להודות דיון במהלך פיתוח assay זה וסיוע טכני ד ר ג'ואן Steffanfor.

דוח אתיקה בעלי חיים - ניסויים בוצעו בהתאמה קפדנית עם המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של מכוני הבריאות הלאומיים, פרוטוקול מחקר בבעלי חיים שאושרו על-ידי (אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש IACUC) ב אוניברסיטת קליפורניה, אירווין, מוכר AAALAC המוסד. כל המאמצים נעשו כדי למזער את סבלם של בעלי החיים.
1. הכנה של פירוק מאגרי
<ol><li>להכין "מסיסים" פירוק מאגר (10 מ מ טריס pH 7.4, 1% טריטון-X 100, 150 מ מ NaCl, 10% גליצרול) וסינון סטרילי דרך מסנן מיקרומטר 0.22.<ol>
<li>עבור עבודה "מסיסים" מאגר פירוק, N-Ethylmaleimide (NEM) וכולן ביסודיות להמיס 100 מ מ phenylmethysulfonyl flouride (PMSF) מומס 100% EtOH. הערה: פירוק מאגר מעכבי: (i) 20 מ מ N-ethylmaleimide (NEM); (ii) 0.2 מ מ PMSF; (iii) 1 מ"מ orthovanadate נתרן (Na3VO4); (iv) leupeptin µg/mL 1; (v) aprotinin µg/mL 1; (vi) 20 מ מ סודיום פלואוריד (NaF). התראה: תלבש מסיכת פנים בעת עבודה עם NEM לאורך כל הפרוטוקול. עובד פירוק מאגר להתבצע טריים כדי להבטיח מעכבי פעיל.</li>
		<li>עבור מאגר פירוק מסיס עם מעכבי פרוטאז, הוסף מעכבי לפי הסדר הבא: סודיום פלואוריד (NaF), עד נפח עם מאגר פירוק קר, orthovanadate נתרן (Na3VO4), Aprotinin Leupeptin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור מאגר פירוק "מסיסים", מוסף 4% מרחביות על-ידי הוספת µL 500 למען חברה דמוקרטית 20% 2 מ של מאגר פירוק "Soluble". יוצאים בטמפרטורת החדר. הערה: למען חברה דמוקרטית לזרז את כאשר שמרו ב 4 ° C; . לשמור את זה אווריריות. קומפוזיציה פירוק מאגר הסופי: 10 מ מ טריס (pH 7.4); 1% טריטון X-100; 150 מ מ NaCl; 10% גליצרול; 4% מרחביות (לא מסיס בלבד).</li>
</ol>2. מסיסים/לא מסיס Fractionation פרוטוקול
הערה: ראה איור 1 מפרטים טכניים.
<ol><li>תווית שתי ערכות של צינורות עבור כל דגימה: "Soluble" ו- "לא מסיסים."</li>
	<li>להוסיף X-µL קר כקרח מאגר פירוק מסיסים לעבוד עם מעכבי פרוטאז (ראה 1.1.1) לרקמה. הערה: X = אמצעי האחסון משתנה בהתאם כמות רקמת; ראה טבלה 1.</li>
	<li>עבור העכבר רקמת מוח (קרי, סטריאטום), דאונס לאט 30 פעמים זכוכית 1 מ"ל douncer ו pipet לתוך"לא מסיס"הנקרא צינור (לשמור בקירור). הערה: יש להיזהר לא לשבור את פני השטח של הנוזל לאחר הפעלת douncing, כמו בועות יהיה טופס תניב המגון לא שלם.</li>
	<li>עבור תאים (קרי, הלה, HEK293T), לשטוף תאים פעם אחת עם קר, 1 x PBS. להסיר PBS חלות נפח מינימלי של מאגר פירוק תאים, תרים עם תא המגרד. הערה: עבור מעל שורות תאים, התאים היו מצופה ב 5 x 105 תאים לכל צלחת טוב 6, גדל ליד confluency. אחד טוב הוא דומה לאמצעי אחסון המשמש סטריאטום העכבר.</li>
	<li>העברת homogenate או lysate לתוך התא הנקרא, צינורות "מסיסים" ואת lyse על קרח 1 h (התחל שעון לאחר עיבוד סופי צינור). הערה: עבור תא lysates, triturate מספר פעמים כדי לשבור את התא הגושים לפני מתחיל אינקובציה. למנוע היווצרות בועות. בקצרה מערבולת דופק כל דגימה עבור 1 s בחצי הדרך lysing.</li>
	<li>צנטריפוגה דגימות ב 4 ° C-g x 15,000 עבור 20 דקות.</li>
	<li>לשחזר תגובת שיקוע כמו השבר "Soluble".<ol>
<li>להסיר עם pipet, להיזהר שלא להפריע שכבה גלולה/מעונן כמו זה לזהם את השבר. Pipet שבר מסיסים לתוך "Soluble" תוויות שפופרת. לשמור על הקרח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לרחוץ גלולה עם 500 µL של פירוק מאגר (x2), צנטריפוגה ב 4 ° C-g x 15,000 עבור 5 דקות אחרי זה לשטוף; זה בסדר אם חלק השכבה מעונן הוא pipetted.</li>
	<li>לאחר השטיפה הסופית להסיר כל מאגר שטיפת הנותרים עוזב רק בגדר רקמות. הערה: מנקודה זו, דגימות לא מסיסים יש עכשיו לשמור בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>Resuspend גלולה עם מאגר פירוק X-µL בתוספת 4% מרחביות (אמצעי אחסון ניתן להתאים בהתאם לגודל צניפה; ראה טבלה 1).</li>
	<li>Sonicate כל דגימה ל 30 s בטמפרטורת החדר עם sonicator המכשיר (125 וואט, 20 kHz, הדופק, משרעת ב-40%, ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>להרתיח דגימות (מתגלגל לרתיחה) במשך 30 דקות; צנטריפוגה בקצרה (15 s) ב 6,000 g x כדי לא לאבד את דוגמה.</li>
	<li>לבצע DC (דטרגנט תואם) חלבון assay (ראה טבלה של חומרים) או שיטת לאורי למדידת ריכוז חלבון (מומלץ דילולים התחיל של 1/5 מדגם במאגר פירוק בהתאמה לתרבות תא, 10/1 lysates רקמות). הערה: ריכוז חלבון יהיה ניתן לקריאה באמצעות וזמינותו של DC או לאורי בשל ריכוז גבוה של דטרגנט.</li>
	<li>דוגמאות aliquot 50 µL אצוות כדי למנוע בעיות ההקפאה-הפשרה. הערה: פרוטוקול ניתן להשהות כאן לפני ניתוח ביוכימי נוסף על-ידי אחסון שני שברים ב-20 ° C.</li>
</ol>3. תספיג חלבון ו כמת
<ol><li>לבצע שהכלים המערבי כפי שדווח במקום1,13 על ידי המדללת 30 µg מדגם 1:1 בקופסא טעינת מאגר (1.6 x בטעינת צבע, 1 x הפחתת). הערה: 30 µg של חלבון ליום שבר מספיקה, אך ניתן לכוונן את רזולוציה מיטבית. 3 - 8% טריס-אצטט פולי-אקרילאמיד ג'לים אמור לשמש את השבר לא מסיסים. 4 - 12% bis-טריס ג'לים מומלץ עבור השבר מסיסים.</li>
	<li>מרתיחים דגימות (בהרתחה מתגלגל) 5 דק צנטריפוגה בקצרה (15 s) ב 6,000 g x כדי לאסוף דוגמה.</li>
	<li>לנתח שברים על ידי עמודים מרחביות, תספיג חלבון על פי הפרוטוקול של היצרן עבור דגימות מופחת. הערה: שבר לא מסיסים פותר הטוב ביותר כאשר העבירו על גבי הממברנה ניטרוצלולוזה מיקרומטר 0.45. 0.45 או 0.2 µM ניטרוצלולוזה יכול לשמש עבור השבר מסיסים, בהתאם לגודל של החלבון עניין. אופטימיזציה מסוימים עשוי להידרש להעברה הטוב ביותר של חומרים HMW.</li>
	<li>כתם קרום עם חלבון כל כתם (למשל, MEMcode, ראה הטבלה של חומרים) לדמיין חלבון נצילות ההטענה. הערה: ניתן לנתח שהכלים המערבי באינטנסיביות פיקסל רע. אפשרות לנרמל את השברים מסיסים כדי חלבון משק בית הכי מתאים עבור מערכת ניסויית. שבר לא מסיסים כמו חלבון יחסית שפע אומתה על ידי חלבון הפיך להכתים או 3 היסטון נורמליזציה על כתם נפרדים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ochaba, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIAS1+Regulates+Mutant+Huntingtin+Accumulation+and+Huntington's+Disease-Associated+Phenotypes+In+Vivo.">PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo.</a> Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).</li><li>La Spada, A. R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat+expansion+disease:+progress+and+puzzles+in+disease+pathogenesis.">Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis.</a> Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).</li><li>Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+neuropathology+of+Huntington's+disease.">Genetics and neuropathology of Huntington's disease.</a> Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).</li><li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington's+disease+chromosomes.">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li><li>Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease:+the+current+state+of+research+with+peripheral+tissues.">Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues.</a> Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).</li><li>Weydt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoregulatory+and+metabolic+defects+in+Huntington's+disease+transgenic+mice+implicate+PGC-1alpha+in+Huntington's+disease+neurodegeneration.">Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration.</a> Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).</li><li>Schulte, J., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biological+function+of+the+Huntingtin+protein+and+its+relevance+to+Huntington's+Disease+pathology.">The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology.</a> Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).</li><li>Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrantly+spliced+HTT,+a+new+player+in+Huntington's+disease+pathogenesis.">Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis.</a> RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).</li><li>Neueder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+exon+1+HTT+protein+is+produced+by+incomplete+splicing+in+Huntington's+disease+patients.">The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients.</a> Sci Rep. 7 (1), 1307 (2017).</li><li>Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+the+first+17+amino+acids+of+huntingtin+in+Huntington's+disease.">The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease.</a> Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).</li><li>Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin+acts+in+the+nucleus+to+induce+apoptosis+but+death+does+not+correlate+with+the+formation+of+intranuclear+inclusions.">Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions.</a> Cell. 95 (1), 55-66 (1998).</li><li>Kim, S., Kim, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Approaches+for+Inhibition+of+Protein+Aggregation+in+Huntington's+Disease.">Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease.</a> Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).</li><li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-2+and+PIAS1+modulate+insoluble+mutant+huntingtin+protein+accumulation.">SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation.</a> Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).</li><li>Shibata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+intracellular+accumulation+of+mutant+Huntingtin+by+Beclin+1.">Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1.</a> J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).</li><li>Apostol, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+assay+for+aggregation+inhibitors+as+therapeutics+of+polyglutamine-repeat+disease+and+validation+in+Drosophila.">A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).</li><li>Wanker, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+filter+assay+for+detection+of+amyloid-like+polyglutamine-containing+protein+aggregates.">Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates.</a> Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).</li><li>Sontag, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Mutant+Huntingtin+Aggregation+Conformers+and+Modulation+of+SDS-Soluble+Fibrillar+Oligomers+by+Small+Molecules.">Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules.</a> J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).</li><li>Grima, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+Huntingtin+Disrupts+the+Nuclear+Pore+Complex.">Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex.</a> Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).</li><li>Sontag, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylene+blue+modulates+huntingtin+aggregation+intermediates+and+is+protective+in+Huntington's+disease+models.">Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models.</a> J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).</li><li>Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricyclic+pyrone+compounds+prevent+aggregation+and+reverse+cellular+phenotypes+caused+by+expression+of+mutant+huntingtin+protein+in+striatal+neurons.">Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons.</a> BMC Neurosci. 10, 73 (2009).</li><li>Shahmoradian, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRiC's+tricks+inhibit+huntingtin+aggregation.">TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation.</a> Elife. 2, e00710 (2013).</li><li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+inhibition+induces+alpha-synuclein+SUMOylation+and+aggregate+formation.">Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation.</a> J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).</li><li>Goldberg, N. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Neural+Progenitor+Transplantation+Rescues+Behavior+and+Reduces+alpha-Synuclein+in+a+Transgenic+Model+of+Dementia+with+Lewy+Bodies.">Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies.</a> Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כמה אמצעי זהירות נדרשים עבור הפרוטוקולים לעיל להבטיח תוצאות עקביות, תפוקה. ראשית, mHTT שני שברים באופן ספונטני יהוו אגרגטים לאורך זמן על מחזורי הפשרת ההקפאה מרובים, במיוחד כאשר אתה נמצא ריכוז גבוה. לפיכך חיוני כדי להקפיא aliquots של חלבון preps, ולאחר להפשיר רק את אמצעי האחסון הדרושים לפני הפעלת וז...

שיבוש רשתות בקרת איכות חלבון להבטיח קיפול נאות והשפלות של החלבונים הוא מרכזי סביר פתולוגיה מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD), אחרים "חלבון misfolding" והפרעות2,3. הבנה מפורטת של רכיבי הרשת פרוטוסטאזיס ותרומתם פתולוגיה ולכן הם חיוניים לפיתוח התערבויות טיפוליות משופרת. HD נגרמת על ידי הרחבת חריג שידור חוזר חטיבתי בתוך הגן HD וכתוצאה מכך רצועת המורחב של polyglutamines (polyQ) חלבון huntingtin (HTT)4. תכונה פתולוגית עקבית של פתוגנזה HD היא וכתוצאה מכך misfolding, הצטברות, צבירה של HTT באזורים של המוח, ברקמות היקפיים, אשר הוכח להתערב במספר דרכים עם תאים נורמליים הומאוסטזיס ותפקוד 5 , 6. HTT בזמן מבוטא ubiquitously, בינוני קוצני נוירונים בסטריאטום פגיע באופן סלקטיבי, המושפע ביותר בגלוי עם ניוון קליפתי הבולטים המשויכים גם HD פתוגנזה.
היווצרות של אגרגטים של HTT במוח של חולים HD ומודלים בעלי חיים שימש בדרך כלל proxy סמן התקדמות המחלה ולהשיג דומיננטה-שלילי של פונקציה mHTT7. למרות המנגנון המדויק על ידי שבו חלבון misfolding, צבירת עשוי לתרום רעילות הנגרמת mHTT אינן ברורות, היווצרות של אלה תכלילים במוח של חולי HD, מודלים שונים היא תכונה קבוע ובלתי נמנע. תכלילים מופיעות כמורכבת במידה רבה של קטעים HTT שהצטברו המכיל N-מסוף מורחבת polyQ, המציין את proteolysis, וכן עיבוד של HTT באורך מלא, כמו גם אלטרנטיבה שחבור8,9 עשוי לשחק תפקיד חשוב בפתוגנזה של שברי HD. N-מסוף HTT עלולה להוות צורה פיפטות של HTT יכול לצבור במהירות, nucleate, ו להאיץ או להפיץ את תהליך של צבירת10.
עם זאת, הנוכחות של תכלילים אלה לא בהכרח לתאם עם רעילות HTT-induced או מוות תא11. HTT הוצע לעבור תהליך צבירת מ מונומר מסיסים דרך מינים oligomeric מסיסים ו β-גיליון הסיבים לא מסיסים אגרגטים, תכלילים12. פתרון אלה מינים שונים של חלבון באמצעות מבחני הביוכימי רגיל כבר אתגר בשטח עקב יציבות שלהם במאגר נמוך חומרי פירוק ולקשיי להמחיש באמצעות מבחני הביוכימי סטנדרטי. לפיכך, שיקולים מתודולוגי הם קריטיים באיתור את התואר ואת התבנית של mHTT המצטבר של צבור.
פרוטוקול המובאת כאן מספק שיטה כדי להמחיש כמה intermediates של HTT, במיוחד היווצרות של זן HMW HTT לא מסיסים המופיע לעקוב מקרוב אחר עם HD בפתוגנזה של המחלה התקדמות1,13 ,14. היכולת לזהות ולעקוב אחר מספר מינים של mHTT מספק חוקרים כלי הביוכימי ללמוד בפתוגנזה של המחלה ואף להעריך את פוטנציאל התערבויות טיפוליות דרך שלהם אפנון ואת ההשפעה על המחלה פתוגנזה.

<table><tbody><tr><td>Sterile Filter</td><td>Millipore</td><td>SCGP505RE</td><td>Screw cap, sterile vaccum filter</td></tr><tr><td>1 mL Tissue Grinder, Dounce</td><td>Wheaton</td><td>357538</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Model Q125</td><td></td></tr><tr><td>DC Protein Assay</td><td>Biorad</td><td>5000111</td><td>Comparable to Lowry assay</td></tr><tr><td>Tris 1M buffer solution</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60636</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 5M solution</td><td>Teknova</td><td>S0251</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS solution</td><td>Teknova</td><td>S0295</td><td></td></tr><tr><td>N-ethylmaleimide</td><td>Sigma</td><td>E1271</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfony flouride</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td>Create 0.5M stock solution in water</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td>Create 10mg/ml stock solution in water</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td>Create 10mg/ml stock solution in water</td></tr><tr><td>Sodium Fluoride</td><td>Sigma</td><td>S4504</td><td>Create 500mM stock solution in water</td></tr><tr><td>Anti-HTT</td><td>Millipore</td><td>MAB5492</td><td>Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56875</td><td>Use 1:1000 for soluble western blot</td></tr></tbody></table>

fractionation for resolution of soluble and insoluble huntingtin species

ההצטברות של חלבונים misfolded הוא מרכזי פתולוגיה של מחלת הנטינגטון (HD), רבים הפרעות ניווניות אחרות. באופן ספציפי, מפתח תכונה פתולוגית של HD הוא הצטברות חריגה של מוטציה בחלבון HTT (mHTT) לתוך מתחמי משקל מולקולרי גבוה, גופים הכללה תאיים המורכב מקטעי וחלבונים אחרים. שיטות קונבנציונליות כדי למדוד ולהבין שהתרומות של צורות שונות של אגרגטים המכילות mHTT כוללים קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, ניתוח תספיג מסנן השמנה מבחני.
עם זאת, רוב השיטות האלה הן קונפורמציה ספציפיים, ולכן לא יכול לפתור המדינה מלאה של mHTT השטף חלבון בשל האופי המורכב של צבירה מסיסות והרזולוציה.
לצורך זיהוי mHTT צבורים שונים צורות ששונה ואת מתחמי, ההפרדה ואת solubilization של אגרגטים הסלולר ואת שברי הוא חובה. כאן אנו מתארים שיטה כדי לבודד והמחש mHTT מסיסים מונומרים, oligomers, שברים, משקל מולקולרי גבוה (HMW) לא מסיסים שנצבר mHTT מינים. HMW mHTT שירים עם התקדמות המחלה, מתכתב עם העכבר התנהגות הקריאות הבאות, יש כבר מווסת לטובה על ידי התערבויות טיפוליות מסוימת1. גישה זו יכולה לשמש עם מוח העכבר רקמות היקפיים, תרבית תאים אבל שעשוי להיות מותאם דגם מערכות או מחלת בהקשרים אחרים.

רזולוציה של lysates תא מסיסים ובחלקם לא מסיסים בעקבות fractionation ניתן להבחין באמצעות המערבי ניתוח ומסנן פיגור מבחני (איור 2). לדוגמה, תאים HEK293T היו transfected באמצעות ריאגנט תרביות תאים (למשל, lipofectamine 2000), עם HTT אקסון 1 cDNA קידוד המכילים גלוטמין 97 חוזר15 ו...

Watch this Scientific Journal Video about Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species at JoVE.com

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

שיטה מתוארת עבור fractionation של מינים huntingtin מוטציה לא מסיסים ולא מסיסים מתרבות המוח ותא העכבר. השיטה המתוארת שימושית עבור כימות של huntingtin חלבון השטף ועזרי בניתוח הומאוסטזיס חלבון בפתוגנזה של המחלה, בנוכחות לפליטת ואפיון

Fractionation רזולוציה של מינים Huntingtin מסיסים ובחלקם לא מסיסים

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

fractionation-for-resolution-soluble-insoluble-huntingtin

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.5K Views.  University of California Irvine. שיטה מתוארת עבור fractionation של מינים huntingtin מוטציה לא מסיסים ולא מסיסים מתרבות המוח ותא העכבר. השיטה המתוארת שימושית עבור כימות של huntingtin חלבון השטף ועזרי בניתוח הומאוסטזיס חלבון בפתוגנזה של המחלה, בנוכחות לפליטת ואפיון

Video: Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate neurotransmission that occurs within synapses because it is highly regulated by dynamic protein-protein interactions and phosphorylation events. Accordingly, when any method is used to study synaptic transmission, a major goal is to preserve these transient physiological modifications. Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments. In other words, the protocol describes a biochemical methodology to carry out protein enrichment from presynaptic, postsynaptic, and extrasynaptic compartments. First, synaptosomes, or synaptic terminals, are obtained from neurons that contain all synaptic compartments by means of a discontinuous sucrose gradient. Of note, the quality of this initial synaptic membrane preparation is critical. Subsequently, the isolation of the different subsynaptic compartments is achieved with light solubilization using mild detergents at differential pH conditions. This allows for separation by gradient and isopycnic centrifugations. Finally, protein enrichment at the different subsynaptic compartments (i.e., pre-, post- and extrasynaptic membrane fractions) is validated by means of immunoblot analysis using well-characterized synaptic protein markers (i.e., SNAP-25, PSD-95, and synaptophysin, respectively), thus enabling a direct assessment of the synaptic distribution of any particular neuronal protein.

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments.

קרום המוח Fractation: An<em&gt; אקס ויוו</em&gt; גישה כדי להעריך לוקליזציה חלבון subsynaptic

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain. The ionic detergent N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) effectively solubilizes natively folded proteins in brain tissue allowing the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from a wide range of neurodegenerative proteinopathies, such as Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease and amyotrophic lateral sclerosis, and prion diseases. Human control and AD postmortem brain tissues were homogenized and sedimented by ultracentrifugation in the presence of sarkosyl to enrich detergent-insoluble protein aggregates including pathologic phosphorylated tau, the core component of neurofibrillary tangles in AD. Western blotting demonstrated the differential solubility of aggregated phosphorylated-tau and the detergent-soluble protein, Early Endosome Antigen 1 (EEA1) in control and AD brain. Proteomic analysis also revealed enrichment of &#946;-amyloid (A&#946;), tau, snRNP70 (U1-70K), and apolipoprotein E (APOE) in the sarkosyl-insoluble fractions of AD brain compared to those of control, consistent with previous tissue fractionation strategies. Thus, this simple enrichment protocol is ideal for a wide range of experimental applications ranging from Western blotting and functional protein co-aggregation assays to mass spectrometry-based proteomics.

An abbreviated fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain is described.

העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

שיטת Refolding יעילה וטיהור של ליגנד Chemoreceptor מחייב תחום

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, resulting in the expression of the Huntingtin protein (Htt) or N-terminal fragments thereof with an expanded polyglutamine (polyQ) stretch.
The exon1 of the Huntingtin protein (Httex1) is the smallest Htt fragment that recapitulates many of the features of HD in cellular and animal models and is one of the most widely studied fragments of Htt. The small size of Httex1 makes it experimentally more amenable to biophysical characterization using standard and high-resolution techniques in comparison to longer fragments or full-length Htt. However, the high aggregation propensity of mutant Httex1 (mHttex1) with increased polyQ content (&#8805;42) has made it difficult to develop efficient expression and purification systems to produce these proteins in sufficient quantities and make them accessible to scientists from different disciplines without the use of fusion proteins or other strategies that alter the native sequence of the protein. We present here a robust and optimized method for the production of milligram quantities of native, tag-free Httex1 based on the transient fusion of small ubiquitin related modifier (SUMO). The simplicity and efficiency of the strategy will eliminate the need to use non-native sequences of Httex1, thus making this protein more accessible to researchers and improving the reproducibility of experiments across different laboratories. We believe that these advances will also facilitate future studies aimed at elucidating the structure-function relationship of Htt as well as developing novel diagnostic tools and therapies to treat or slow the progression of HD.

Here, we present a robust and optimized protocol for the production of milligram quantities of native, tag-free monomers and fibrils of the exon1 of the Huntingtin protein (Httex1) based on the transient fusion of small ubiquitin related modifier (SUMO).

דור של Huntingtin Exon1 טבעית, לא מתויגות מונומר, הסיבים משתמש באסטרטגיה פיוז'ן סומו

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium homeostasis, particularly store-operated calcium entry, which is critical to maintaining proper function of synaptic vesicle release and intracellular signaling pathways. Accordingly, TRPC channels have been implicated in a variety of human diseases including cardiovascular disorders such as cardiac hypertrophy, neurodegenerative disorders such as Parkinson&#39;s disease, and neurologic disorders such as spinocerebellar ataxia. Therefore, TRPC channels represent a potential pharmacologic target in human diseases. However, the molecular mechanisms of gating in these channels are still unclear. The difficulty in obtaining large quantities of stable, homogeneous, and purified protein has been a limiting factor in structure determination studies, particularly for mammalian membrane proteins such as the TRPC ion channels. Here, we present a protocol for the large-scale expression of mammalian ion channel membrane proteins using a modified baculovirus gene transfer system and the purification of these proteins by affinity and size-exclusion chromatography. We further present a protocol to collect single-particle cryo-electron microscopy images from purified protein and to use these images to determine the protein structure. Structure determination is a powerful method for understanding the mechanisms of gating and function in ion channels.

This protocol describes techniques used to determine ion channel structures by cryo-electron microscopy, including a baculovirus system used to efficiently express genes in mammalian cells with minimum effort and toxicity, protein extraction, purification, and quality checking, sample grid preparation and screening, as well as data collection and processing.

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

ביטוי, טיהור, התגבשות ואנזים אנזימים המכילים חלבונים בתחום הידרוקלז

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 kDa. While the cellular function of FL HTT is not entirely understood, a mutant expansion of the polyQ tract above ~36 repeats is associated with Huntington's disease (HD), with the polyQ length correlating roughly with the age of onset. To better understand the effect of structure on the function of mutant HTT (mHTT), large quantities of the protein are required. Submilligram production of FL HTT in mammalian cells was achieved using doxycycline-inducible stable cell line expression. However, protein production from stable cell lines has limitations that can be overcome with transient transfection methods. 
This paper presents a robust method for low-milligram quantity production of FL HTT and its variants from codon-optimized plasmids by transient transfection using polyethylenimine (PEI). The method is scalable (&gt;10 mg) and consistently yields 1-2 mg/L of cell culture of highly purified FL HTT. Consistent with previous reports, the purified solution state of FL HTT was found to be highly dynamic; the protein has a propensity to form dimers and high-order oligomers. A key to slowing oligomer formation is working quickly to isolate the monomeric fractions from the dimeric and high-order oligomeric fractions during size exclusion chromatography. 
Size exclusion chromatography with multiangle light scattering (SEC-MALS) was used to analyze the dimer and higher-order oligomeric content of purified HTT. No correlation was observed between FL HTT polyQ length (Q23, Q48, and Q73) and oligomer content. The exon1-deleted construct (aa 91-3,144) showed comparable oligomerization propensity to FL HTT (aa 1-3,144). Production, purification, and characterization methods by SEC/MALS-refractive index (RI), sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), western blot, Native PAGE, and Blue Native PAGE are described herein.

We provide scalable protocols covering construct design, transient transfection, and expression and purification of full-length human huntingtin protein variants in HEK293 cells.

ייצור יעיל וניתן להרחבה של גרסאות ציד אנושיות באורך מלא בתאי יונקים באמצעות מערכת ביטוי חולפת

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as oxaloacetate decarboxylase in mitochondria. This article presents a series of methods for the extraction and purification of FAHD1 from swine kidney and mouse liver. Covered methods are ionic exchange chromatography with fast protein liquid chromatography (FPLC), preparative and analytical gel filtration with FPLC, and proteomic approaches. After total protein extraction, ammonium sulfate precipitation and ionic exchange chromatography were explored, and FAHD1 was extracted via a sequential strategy using ionic exchange and size-exclusion chromatography. This representative approach may be adapted to other proteins of interest (expressed at significant levels) and modified for other tissues. Purified protein from tissue may support the development of high-quality antibodies, and/or potent and specific pharmacological inhibitors.

This protocol describes how to extract fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) from swine kidney and mouse liver. The listed methods may be adapted to other proteins of interest and modified for other tissues.

מיצוי וטיהור של חלבון FAHD1 מכבד כליות ועכבר חזירים

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

טיהור Hsp104, Disaggregase חלבון

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Biology

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

קיבוע מהיר ב- Vivo ובידוד מתחמים תרגומיים מתאי אוקריוטיים

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...