טיהור של חלבון רקומביננטי מחיידקים היא שיטה מבוססת היטב. עם זאת, מספר בעיות עלולות להתרחש בעת שימוש בטכניקות אלה. לאחר שיטות לחלץ חלבון מן הרקמה הוא בהחלט מושך.
היתרון העיקרי בשיטה זו הוא שניתן לחלץ את החלבון בצורתו הפיזיולוגית, כולל כל ההשפעות ההדדיות שעשויות להשפיע על פעילותו המתקפלת והקטליטית. גישה זו עשויה להיות מותאמת לחלבונים אחרים בעלי עניין ולשנות אותה עבור רקמות אחרות. חלבון מטוהר מרקמה עשוי לתמוך בפיתוח נוגדנים איכותיים ומעכבים פרמקולוגיים.
כדי להתחיל, להכין חיץ ליזיס חלבון על ידי ערבוב 250 מיליליטרים של PBS עם 50 מילימולר נתרן פלואוריד, אחד millimolar phenylmethylsulfonyl fluoride, שני מיקרוגרם לכל מיליליטר אפרוטינין, ואחד millimolar מופעל אורתובנדט. סנן את הפתרון באמצעות יחידת מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. מכינים צינורות עם שני מיליליטרים של חיץ ליזיס לגרם רקמה ומניחים אותם על קרח.
כדי להכין את דגימת הרקמה, נתחו את הרקמה של כ-100 מיליגרם כל אחת על צלחת זכוכית מנוקה מראש שהונחה על קרח בקופסת קצף פוליסטירן. להעביר את חתיכות הרקמות לתוך צינורות מוכנים עבור lysis לאחר מכן. כדי להכין תמיסת אמוניום סולפט רוויה, מחממים 500 מיליליטרים של מים מזוקקים כפולים ל -70 מעלות צלזיוס.
תוך כדי ערבוב, מוסיפים בהדרגה אבקת אמוניום גופרתי עד שלא ממיסים יותר אמוניום סולפט. מצננים את התמיסה הרוויה הזו לטמפרטורת החדר ומאחסנים אותה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. כדי להפוך את רקמות הכליה של החזירים להומוגניזציה, יש לסלול את ההשעיה עדיף על ידי בדיקה קולית תוך שמירה על הדגימה על הקרח.
במקרה של רקמות כבד של עכברים, השתמשו בהומוגנייזר חשמלי ושטפו אותו באופן קבוע ב-PBS כדי למנוע סתימה תוך שמירה על הדגימות על הקרח. קחו 20 מיקרוליטרים מהדגימות ובדקו מתחת למיקרוסקופ אם התאים של הרקמה ההומוגנית מושמדים כראוי. אחרת, חזור על ההומוגניות.
צנטריפוגה הצינורות ב 10, 000 פעמים G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. אספו את חומר העל בצינור טרי והניחו אותו על קרח. לאחר מכן לסנן את הסופרנטנט באמצעות יחידות מסנן מזרקים של 0.45 מיקרומטר ו-0.22 מיקרומטר.
Aliquot את supernatant לתוך 10 אצוות מיליליטר ולהקפיא אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח קצר או במינוס 80 מעלות צלזיוס לאחסון ארוך יותר. הכינו דגימת מיקרוליטר של 50 עבור ניתוח SDS-PAGE או כתם מערבי על ידי הוספת 10 מיקרוליטרים של פי חמישה ממאגר דגימת ה-SDS ל-40 מיקרוליטרים של הסופרנאטנט ולאחר מכן הרתחה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הכינו ג'ל פוליאקרילאמיד SDS-PAGE לא רציף של 12.5% על פי הוראות היצרן.
כדי לבצע ניתוח SDS-PAGE, טען את הבארות של הג'ל לאחר מכן עם סולם סמן חלבון, חמישה ננוגרמים של חלבון רקומביננטי FAHD1 אנושי כבקרה חיובית, 20 מיקרוליטרים של הדגימה שיש לנתח, ואת הבארות הנותרות עם 20 מיקרוליטרים של מאגר דגימות SDS-PAGE מוכן. הפעל את הג'לים של SDS-PAGE ב- 125 וולט באמצעות מאגר הריצה SDS. לאחר השלמת SDS-PAGE, בצע ניתוח כתם מערבי, בדוק את הממברנות באמצעות הנוגדן הזמין שהועלה כנגד FAHD1.
לאחר הכנת אליקוטים סופרנאטנטיים כפי שתואר קודם לכן, או לעבד לאחר הפשרה או לעבד ישירות לאחר מיצוי חלבון מבלי להקפיא את הדגימה. סנן את הדגימה באמצעות יחידת מסנן של 0.22 מיקרומטר כדי לא לכלול משקעים אפשריים לאחר ההפשרה. מכינים שישה צינורות 1.5 מיליליטר על קרח, ואז מעבירים 250 מיקרוליטרים של דגימה לכל צינור.
הכינו סדרת דילול של אמוניום גופרתי בצינורות המוכנים והרכיבו את הנפח הסופי ל-1, 000 מיקרוליטר עם מאגר ליזה חלבונית. הדגירה של הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה על מסובב צינור. באמצעות צנטריפוגה שולחנית, צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהעביר בזהירות את כל הסופרנאטורים לצינורות נפרדים.
אוויר מייבש את הכדורים המתקבלים ומחזיר כל אחד מהם ב-1, 000 מיקרוליטר של מים מזוקקים כפולים. עבור כל זוג של כדוריות וסופר-ננטנטים מהשלב הקודם, יש לערבב 40 מיקרוליטרים עם 10 מיקרוליטרים של פי חמישה ממאגר דגימת ה-SDS ולרתוח ב-95 מעלות צלזיוס עם מכסים פתוחים עד שרוב הנוזלים התאדו. לאחר מכן יש להחיות את הכדור בתערובת של 50% דימתיל סולפוקסיד במים מזוקקים כפולים.
בצע את SDS-PAGE על ידי טעינת הדגימות הנגזרות מהכדורים המחודשים והסופרנטנטים בזוגות, ולאחר מכן ניתוח כתמים מערביים. עם זאת, הפעל את הג'לים ב 80 וולט במשך שלוש שעות. הגדר את מערכת FPLC עם עמודת החליפין האניונית או הקטיונית.
שטפו את העמוד בחמישה נפחי עמודים של 20% אתנול במים מזוקקים כפולים, ואחריהם חמישה נפחי עמודים של מים מזוקקים כפולים. החל את הדגימה על העמודה בהזרקה או באמצעות משאבת דגימה ואסוף את הזרימה.דרך. שטפו את העמודה בנפח עמוד אחד של מאגר המלח הנמוך.
הגדר אלוטציה הדרגתית ליניארית מ-100% מאגר מלח נמוך ל-100% מאגר מלח גבוה בתוך שלושה נפחי עמודים. לאסוף ברציפות שברים מיליליטר אחד. לאחר סיום השיפוע, המשיכו לפעול עם מאגר מלח גבוה עד שלא יזוהו עוד פסגות הקשורות לחלבון בכרומטוגרמה בטווח של נפח עמודה אחד.
יש למרוח מיליליטר אחד של 25% SDS המומס ב-0.5 נתרן הידרוקסיד טוחן ומים מזוקקים כפולים לניקוי העמודה. ברצף לשטוף את העמוד עם שלושה נפחי עמודים של מים מזוקקים כפולים ושלושה נפחי עמודים של 20% אתנול במים מזוקקים כפולים. אסוף את דגימות ה- SDS-PAGE של כל שברי השיא והזרימה- דרך.
הצמד מקפיא את השברים שנאספו בחנקן נוזלי ומאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר בדיקתם באמצעות כתם מערבי, להפשיר ולאחם את השברים המכילים את החלבונים המעניינים ולהשליך את האחרים. כדי לבצע את שלב הטיהור, הפחיתו את נפח תמיסת החלבון לשני מיליליטרים באמצעות יחידות מסנן אולטרה צנטריפוגה.
סנן ברצף את הפתרון עם יחידות מסנן מזרקים של 0.45 מיקרומטר ו-0.22 מיקרומטר כדי להסיר כל מיקרו-קירור. שיווי המשקל של עמודת הכרומטוגרפיה של אי-הכללת הגודל עם נפח עמודה אחד של מאגר רץ המכיל דיתיותריאטול מילימולרי אחד. טען את הדגימה על העמודה והפעל את יחידת הכרומטוגרפיה עד שכל החלבונים יתחמקו כפי שתואר קודם לכן.
הכינו 50 דגימות מיקרוליטר לניתוח SDS-PAGE וכתמים מערביים שתוארו קודם לכן. יש לשטוף את העמוד ברצף עם נפח עמוד אחד של מים מזוקקים כפולים ונפח עמודה אחד של 20% אתנול במים מזוקקים כפולים. לאחר ביצוע ניתוח כתמים מערביים, אסוף את כל FAHD1 המכיל שברים.
הפחיתו את נפח תמיסת החלבון לשני מיליליטרים באמצעות יחידות מסנן אולטרה צנטריפוגה. הקרנת כתם מערבית מראה את נוכחותם של החזירים FAHD1 בסופרנטנט עם רצועה של 25 קילודלטון בעוד השליטה החיובית המתויגת פועלת על 34 קילודלטון. החזיר FAHD1 מליזאט טוהר על ידי כרומטוגרפיית חילופי אניונים והחלבונים הקושרים הוסרו על ידי אלוטיון.
שברים המכילים חזירים FAHD1 זוהו על ידי ניתוח כתמים מערביים, מאוגדים ומרוכזים. דגימות חלבון טוהרו על ידי SEC וזוהו על ידי ניתוח כתמים מערביים. התשואה של חלבון FAHD1 חזירי הייתה בערך מיליגרם אחד עם רמת טוהר של 80%.
ניתוח כתמים מערבי זיהה את חלבון FAHD1 של העכבר בזרימה-דרך יחד עם חלבונים אחרים. הזרימה-דרך הוחלה על כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל. שברים המכילים FAHD1 רוכזו, רוכזו ויושמו על ניתוח SDS-PAGE.
עם זאת, התשואה של חלבון לא היה גבוה מאוד. הפעילות האנזימטית הספציפית של החזיר FAHD1 עולה עם רמת הטוהר עם הגדלת הכמות היחסית של FAHD1 לכל סך החלבון. ריכוזים גבוהים יותר של אמוניום סולפט גורמים לאפקט החיוך, אשר ניתן לפתור במתח נמוך יותר.
חלבון נוסף נמצא בליזאט ובסופרנט בריכוז של 15%. עם זאת, בריכוזים גבוהים יותר, דגימות עשויות לזרז ולא ניתן לזהות אותן. הפרוטוקול המוצג כאן דורש שהחלבון יהיה פתיר.
יש לבדוק ולהגדיר תנאים אופטימליים למשקעים ו- pH או התאמת גודל לכרומטוגרפיה. חקר התפקוד האנזימטי, חקירת מבנה החלבון והתפתחות הנוגדן נתמכים מאוד כאשר חלבון מופק מרקמה ולא מופק מחיידקים.
