עבודה זו נתמכה על ידי Ministerio de EconomÃ ¢ â, ¬ â &quot;¢ â, ¬ â&quot; ¢ DE / Salud קרלוס השלישי (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 ו- PIE14 / 00034), המכון לאקדמיה של אוניברסיטת אקרה ), ובדוקטורט ו - FC שייכים לקבוצת המחקר &quot;נוירופרמקולוגיה וכאב&quot; (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251). . היצירה נתמכה גם על ידי &quot;תוכנית הפיסכיאדאריות ביקור בקרנות מיוחדות&quot; מ - CAPES (ברזיל) ל FC

כל ההליכים הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת ברצלונה לשימוש בבעלי חיים וטיפול בבעלי חיים (CEEA), בהתאם לקווים המנחים המתוארים במדריך לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה 11 ובעקבות הקהילה האירופית, חוק 86/609 / CCE, FELASA ו- ARRIVE. לפיכך, עכברים שוכנים בכלובים סטנדרטיים, עם גישה למודעה libitum למזון ומים, והם נשמרים בתנאים סטנדרטיים מבוקרים (12 שעות כהה / אור מחזור החל בשעה 7:30 בבוקר, 22 ° C טמפרטורה, ו 66% לחות). 1. קבלת עכבר Synaptosomes המוח באמצעות מעבר Surorose רציפה הערה: שיטה זו דווחה בעבר 10 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ בידוד טרי (IB), pH 7.4; 2 סוכרוז M; 1 סוכרוז M / 0.1 מ&quot;מ CaCl 2 ; ו 0.1 מ&quot;מ CaCl 2 (ראה טבלה 1 ). צינת הפתרונות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Saלהקריב חמישה עכברים על ידי נקע צוואר הרחם. לערוף במהירות להסיר את המוח של כל חיה. לנתח את האזור המוח של עניין (כלומר, את ההיפוקמפוס, 0.25-0.35 גרם של רקמות טריות) ומניחים אותו 5 מ&quot;ל פוטר- Elvehjem צינור זכוכית על קרח עם 1 מ&quot;ל של IB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize הרקמה באמצעות stogener homogenizing (10 משיכות ב 700-900 סיבובים לדקה), מועדף באמבט קרח כדי למנוע התחממות המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הרקמה homogenized (1 מ&quot;ל) לתוך צינור 15 מ&quot;ל המכיל 6 מ&quot;ל של סוכרוז M 2 ו 2.5 מ&quot;ל של 0.1 מ&quot;מ CaCl 2 ב 4 מעלות צלזיוס. מערבבים לאט על ידי הפניית הצינור. הערה: תוספת סידן חיונית לשמירה על יחסי הגומלין בין האברונים ובכך לשמר את המבנה של &quot;הצפיפויות&quot; השונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הפתרון בצינור 12 צנטריפוגות מ&quot;ל ולאט לאט להוסיף 2.5 מ&quot;ל של 1 סוכרוז M / 0.1 מ&quot;מ CaCl 2 על גבי כל צינור כדי ליצור את שיפוע סוכרוז. הערה: תווית את המיקום oF ממשק שיפוע על צינור צנטריפוגה באמצעות סמן קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול ולאזן את צינורות צנטריפוגה עם פתרון IB בתוך תומכת הפלדה המקביל שלהם עם העפעפיים הסגירה שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות במשך 3 שעות ב 100,000 x גרם ו 4 ° C באמצעות צנטריפוגה דלי נדנדה נדנדה. מלא לחלוטין את הרוטור עם כל תומך פלדה (אפילו ריק, אם נדרש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את השכבה העליונה המכילה myelin. עם פיפטה פסטר, לאסוף את הטבעת הלבנה בין 1.25-M ו 1-M סוכרוז interfase המקביל לחלק synaptosome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את synaptosomes עם 9X נפח שלהם באמצעות IB בצינור צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול ולאזן את צינורות צנטריפוגה עם פתרון IB בתוך תומכת הפלדה המקביל שלהם עם העפעפיים הסגירה שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות במשך 30 דקות ב 15,000 x גרם ו 4 ° C באמצעות צנטריפוגה דלי נדנדה נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את supernatant ו resuspend thE גלולה עם 1.1 מ&quot;ל של פתרון IB. איסוף 100 μL של פתרון זה צנטריפוגלי צנטריפוגה 5 דקות ב 11,000 x ו 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה synaptosomal 5% נתרן dodecyl סולפט (SDS) ולאחסן את המדגם ב -20 מעלות צלזיוס. הערה: מדגם זה יתאים את החלק השלם synaptosome לניתוח נוסף כתם המערבי. את החלק הנותר synaptosomal (~ 1 מ&quot;ל) יכול להיות מוקפא ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש או מעובד עבור שבירה subsynaptic הבאים. סינפוזומים או סינפסות מטוהרים מייצגים בין 1 ל 2% מכלל נפח ההיפוקמפוס 12 . </li></ol> 2. בידוד, post- ו extrasynaptic- בידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2x חיץ טרי solubilization, pH 6.0; 1x חיץ solubilization, pH 6.0; חיץ solubilization, pH 8.0; ו 0.1 מ&quot;מ CaCl 2 (ראה טבלה 1 ). צינת הפתרונות על הקרח. הערה: ה- pH של פתרונות אלה צריך להיות מדויקY מותאם כדי להשיג פיצול subsynaptic טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לדלל את החלק 1 מ&quot;ל resuspended חלק סינפטוזומלי (ראה שלב 1.12) עם 5 מ&quot;ל של 0.1 מ&quot;מ CaCl 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את אותו נפח (5 מ&quot;ל) של חיץ קר 2x קר solubilization, pH 6.0, ו דגירה של 50 דקות על הקרח תחת תסיסה גבוהה בכוס על הקרח. הערה: בעוד 1% של Triton X-100 ב pH 6.0 solubilizes כל חלבונים ממברנה פלזמה, הוא משמר חלבונים בתוך אנשי קשר או צמתים סינפטיים ( כלומר, מבנים preysynaptic מראש) 4 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הפתרון בצינור צנטריפוגות. לשקול ולאזן את צינורות עם כרכים שווה של 0.1 מ&quot;מ CaCl 2 ו 2x פתרון חיץ solubilization, pH 6.0, בתוך תומך פלדה המתאימים שלהם עם העפעפיים הסגירה שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות במשך 30 דקות ב 40,000 x גרם ו 4 ° C באמצעות צנטריפוגה דלי נדנדה נדנדה. התוצאה supernatant מייצג את החלק extrasynaptic,ואת גלולה תואמת את צמתים סינפטיים ( כלומר, שברים מראש ו postsynaptic). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכז את supernatant המכיל את החלק extrasynaptic ל 200 נפח μL הסופי באמצעות צינור 15 מ&quot;ל 10K מסנן צנטריפוגה ב XG 4,000 ו 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרז את החלק הנוסף extrasynaptic מרוכזת (200 μL) עם 5 כרכים (1 מ&quot;ל) של אצטון מראש (-20 מעלות צלזיוס) לילה ב -20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, צנטריפוגות שבר extrasynaptic במשך 30 דקות ב 18,000 x ו -15 ° C. לאחר צנטריפוגה, להשמיד את אצטון supernatant ויבש את גלולה כדי להסיר כל עקבות של אצטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, resuspend גלולה המכילה את החלבונים extrasynaptic עם μL 200 של 5% SDS. Sonicate גלולה, אם נדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבלי לשבש את זה, בזהירות לשטוף את גלולה המכילה את שברים מראש ו postsynaptic עם 2 מ&quot;ל של חיץ solubilization 1x, pH 6.0. מחק את המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspendגלולה עם 10 מ&quot;ל של חיץ solubilization 1x, pH 8.0, באמצעות פיפטה זכוכית פסטר. הערה: בעוד 1% של Triton X-100 ב pH 8.0 solubilizes ההתמחות presynaptic, זה משמר את הצפיפות postsynaptic מסיס 4 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ההשעיה במשך 50 דקות על הקרח תחת תסיסה גבוהה בכוס על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הפתרון בצינור צנטריפוגות. לשקול ולאזן את צינורות עם תמיסה 1x solubilization חיץ, pH 8.0, בתוך תומך פלדה המתאימים שלהם עם העפעפיים הסגירה שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות במשך 30 דקות ב 40,000 x גרם ו 4 ° C באמצעות צנטריפוגה דלי נדנדה נדנדה; וכתוצאה מכך supernatant מתאים את שבר presynaptic ואת גלולה לחלק postsynaptic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך supernatant המכיל את שבר presynaptic, כמתואר צעדים 2.6-2.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את גלולה המכילה חלק postsynaptic עם μL 200 של 5% SDS. Sonicate גלולה, אניF נדרש. </li></ol> 3. לנתח את הדגימות על ידי immunoblot כדי לאמת את החלוקה הממברנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את כמות החלבון בכל חלק ( כלומר, השברים הכולל, תוספת, לפני ואחרי סינפטית) באמצעות assay חומצה bicinchoninic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 20 מיקרוגרם של חלבון מכל חלק לדלל אותו לנפח הסופי של μL 50 ב SDS-polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) חיץ מדגם. מרתיחים במשך 5 דקות ב 100 מעלות צלסיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפריד את החלבונים על ידי SDS-PAGE אלקטרופורזה 10%, עם ג&#39;ל ריכוז 4% תחת צמצום התנאים. Electrophorese במתח קבוע של 80 V עד הצבע נכנס ג&#39;ל התחתון ולאחר מכן להגביר את המתח 120 V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את החלבונים לקרום PVDF לחסום עם פתרון חסימת IB למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר תחת רעידות מתמשך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של קרום לילה ב 4 מעלות צלזיוס עם הנוגדן העיקרי המצוין ( כלומר, נגד SNAP-25,אנטי PSD-95, anti-synaptophysin, או אנטי GPR37) מדולל פתרון חסימת IB תחת רעידות מתמשכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה שלוש פעמים (10 דקות כל אחד) עם פתרון כביסה IB לחסל נוגדן ראשוני מאוגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם הנוגדן המשני המצוין במשך 90 דקות בתנאים כהים בטמפרטורת החדר תחת רעד מתמשך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה שלוש פעמים (10 דקות כל אחד) עם פתרון כביסה IB לחסל נוגדנים משני לא מאוגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הממברנה עם המצע chemiluminescent (להכין את התערובת בתנאים חשוכים בעקבות 1: 1 פרופורציה של פתרון A ו- B המסופק על ידי היצרן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הממברנה במכשיר זיהוי chemiluminescent. </li></ol>

<ol>
	<li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Part+III:+The+Central+Nervous+System.">Part III: The Central Nervous System.</a> A Text Book of Physiology. , (1897).</li><li>Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The fine structure of the nervous system. , (1991).</li><li>Harris, K. M., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+Synapses+in+the+Mammalian+Brain.">Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).</li><li>Phillips, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presynaptic+particle+web:+ultrastructure,+composition,+dissolution,+and+reconstitution.">The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution.</a> Neuron. 32, 63-77 (2001).</li><li>Pinheiro, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+and+immunological+identification+of+presynaptic+alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic+acid+receptors+in+the+rat+hippocampus.">Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus.</a> Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).</li><li>Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+adenosine+A(1)+receptors+in+nerve+terminals+and+synapses+of+the+rat+hippocampus.">Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus.</a> Brain Res. 987, 49-58 (2003).</li><li>Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+synaptic+and+subsynaptic+localization+of+adenosine+A2A+receptors+in+the+hippocampus+and+striatum+of+the+rat.">Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat.</a> Neuroscience. 132, 893-903 (2005).</li><li>Rodrigues, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Presynaptic+Control+by+ATP+of+Glutamate+Release+via+Facilitatory+P2X1,+P2X2/3,+and+P2X3+and+Inhibitory+P2Y1,+P2Y2,+and/or+P2Y4+Receptors+in+the+Rat.">Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat.</a> J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).</li><li>Gar&#231;&#227;o, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsynaptic+localization+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunits:+a+comparative+study+in+the+mouse+and+rat+striatum.">Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum.</a> Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).</li><li>Lopes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+parkinson's+disease-associated+receptor+GPR37+in+the+hippocampus:+functional+interplay+with+the+adenosinergic+system.">The role of parkinson's disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system.</a> J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).</li><li>Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Special+Report:+The+1996+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.">Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> ILAR J. 38, 41-48 (1997).</li><li>Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapses+in+hippocampus+occupy+only+1-2%+of+cell+membranes+and+are+spaced+less+than+half-micron+apart:+a+quantitative+ultrastructural+analysis+with+discussion+of+physiological+implications.">Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications.</a> Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).</li><li>Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+endothelin+receptor+type-B-like+gene+enriched+in+the+brain.">A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).</li><li>Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropeptide+head+activator+loses+its+biological+acitivity+by+dimerization.">The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization.</a> EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).</li><li>Rezgaoui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropeptide+head+activator+is+a+high-affinity+ligand+for+the+orphan+G-protein-coupled+receptor+GPR37.">The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37.</a> J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).</li><li>Gand&#236;a, J., Fern&#225;ndez-Due&#241;as, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease-associated+GPR37+receptor-mediated+cytotoxicity+is+controlled+by+its+intracellular+cysteine-rich+domain.">The Parkinson's disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain.</a> J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).</li><li>Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPR37+and+GPR37L1+are+receptors+for+the+neuroprotective+and+glioprotective+factors+prosaptide+and+prosaposin.">GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).</li><li>Takahashi, R., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pael+receptor,+endoplasmic+reticulum+stress,+and+Parkinson's+disease.">Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson's disease.</a> J. Neurol. 250, 9 (2003).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

The protocol presented here constitutes a powerful biochemical tool for the study of the subsynaptic distribution of specific proteins within any brain region. However, there are some drawbacks inherent to the technique that deserve to be highlighted here. For instance, one of the main limitations is the relatively large amount of tissue needed to purify a reasonable amount of protein in order to perform the immunoblot analysis of all subsynaptic fractions. This issue might be related to the fact that synapses (i.e.,...

שידור סינפטית מסתמך על השלמות הפיזית של הסינפסה, מושג שנחזה כבר בתחילת 1897 על ידי פוסטר ו Sherrington 1 . לכן, הבנת התפלגות של מרכיבים ניירוטרנסמיים מרכזיים ( למשל, תעלות יונים, קולטנים וכו &#39; ) חיונית להבהרת הפונקציה הסינפטית, הן בתנאים הנורמליים והן בפתולוגים. מיקרוסקופית אלקטרונים (EM) תרמה רבות לרעיון ultrastructural הנוכחי של סינפסות מערכת העצבים המרכזית (CNS). בדרך זו, EM הקימה היטב את ההבדלים בין צפיפות טרום-פוסטינפטית, אשר מופרדים על ידי סדק של מרחק אחיד למדי (~ 25 ננומטר) 2 . מעניין, את מנגנון postsynaptic מציגה רציפה יחסית, עיבוי צפוף אלקטרונים מתחת קרום הפלזמה שלה, שנקרא צפיפות postsynaptic, או PSD 2 . לעומת זאת, במנגנון presynaptic, הודעה<html> E רשת רציפה cytomatrix מסודרת בדיוק מתחת קרום פלזמה, אשר חיוני היישור ואת עגינה של שלפוחית ​​סינפטי לאזור קרום פלזמה פעיל 3 . לפיכך, EM מהווה את הגישה הניסויית הזהב לסקור את החלוקה של חלבונים בתוך סינפסה CNS נשמר מבנית. עם זאת, המידע שסופק על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הוא סטטי. ואכן, הצטברות הראיות עולה כי סינפסות vivo הם דינמיים מאוד, ובכך חווים שינויים מבניים דרמטי על שידור סינפטי מתמשכת. בנוסף, המורפולוגיה ואת הרכב הסינפסות יכול להשתנות בכל אזורי CNS שונים על התפתחות, התבגרות, הזדקנות, ופיתוח של תנאים נוירופתולוגי. בסך הכל, פרוטוקול התמקד בידוד חלבונים השייכים תאים סינפטי שונים בתנאים פיזיולוגיים מייצג כלי רב ערך עבור מחקר מקיף יותר של תפקוד סינפטי. Lace = &quot;jove_content&quot;&gt; כאן, אנו מתארים סוג זה של גישה ניסויית משלימה, המאפשרת העשרה ביוכימית הכנה של תאים שונים קרום סינפטי, כלומר, תוספת, מראש ו-דפוסי postsynaptic הממברנה. שיטה זו שברירית הממברנה, שתוארה לראשונה על ידי Philips et al . (2001) 4 , מבוסס על שינוי pH כי מחלישה את אינטראקציות דבק המתרחשים בתוך מראש ו postsynaptic המנגנון. ראשית, באמצעות דטרגנטים מתונה ב pH 6.0, ניתן להבחין צומת adherers המחזיקה מראש ו postsynaptic המנגנון וכי נשמר מן תחום קרום extrasynaptic, אשר solubilized ולכן ניתן לחלץ מן אנשי הקשר הסינפטי. לאחר מכן, העלאת ה- pH מ 6.0 ל 8.0 בנוכחות דטרגנטים מתון מחליש את כוח צומת adherens שמחזיק את אזור פעיל presynaptic בחוזקה הצפיפות postsynaptic. לפיכך, התא presynaptic הוא כל כךLubilized ויכול להיות מופרדים צפיפות postsynaptic, אשר נשמר בעיקר בגלל ריכוז של חומר ניקוי בשימוש לא לקדם solubilization שלה 4 . מעניין, יעילות הפיצול, בסופו של דבר גבוה מ -90%, ניתן לאשר על ידי סמנים subsynaptic שונים: i ) synaptosomal הקשורים חלבון 25 (SNAP-25), מן אזור פעיל presynaptic; Ii ) synaptophysin, מן חלק extrasynaptic ( כלומר, מחוץ לאזור פעיל כולל microsomes); ו iii ) postsynaptic צפיפות חלבון 95 (PSD-95), מן צפיפות postsynaptic. יש לציין, שיטה זו שבירת המוח קרום שימש בהצלחה. לפיכך, ניתן היה לקבוע במדויק את לוקליזציה subynaptic של קולטנים שונים, כגון קולטנים שונים של אלפא-אמינו-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (AMPA) 5 , אדנוזין קולטן A 1 (A 1 R) 6 ,אדנוזין קולטן 2A (A 2A R) 7 , אדנוזין טריפוספט (ATP) קולטנים P2 8 , קולטן אצטילכולין ניקוטין 9 , ו קולטן מחלת פרקינסון הקשורים GPR37 10 . עם זאת, מספר מגבלות עלול לעכב את הערכה נכונה של התפלגות הסינפטי של חלבון עצבי מסוים. לכן, בהליך זה, אנו לא רק לתאר באופן מלא את הפרוטוקול כולו, אבל אנחנו גם להדגיש כמה נקודות קריטיות להיחשב, כגון כמות גדולה למדי של רקמות הצורך, התשואה חלבון נמוך, ואת הדרישה המנדטורית כדי לאמת את היעילות של כל הפרדה לפני ביצוע הניסוי מוגדר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="704">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Sucrose</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,316,211,211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">CaCl2</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">2,112,211,210</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,313,961,210</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Protease inhibitor cocktail Set III</td>
			<td style="width:249px;">Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:160px;">535140</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Trizma Base</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">T1503</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,236,541,209</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">X100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">SDS</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">L3771</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Glycerol</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">G5516</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Bromophenol Blue</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,311,651,604</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">D0632</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Tween 20</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">P2287</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Non fat dry milk</td>
			<td style="width:249px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">NaCl</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,216,591,211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">KCl</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,314,941,210</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:249px;">Merck</td>
			<td style="width:160px;">4873</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,316,781,211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Basic 20 pH</td>
			<td style="width:249px;">Crison, Alella, Spain</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer</td>
			<td style="width:249px;">VWR, Radnor, PA, USA.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:128px;">Ultra-Clear Tubes (14x89mm)</td>
			<td style="width:249px;">Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td>
			<td style="width:160px;">344059</td>
			<td style="width:167px;">Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation.</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K</td>
			<td style="width:249px;">Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:160px;">UFC901008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Centrifuge 5430R</td>
			<td style="width:249px;">Eppendorf, Hamburgo, Germany</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:249px;">Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Sonifier 250</td>
			<td style="width:249px;">Branson, Danbury, Connecticut</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Amersham Imager 600</td>
			<td style="width:249px;">GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm</td>
			<td style="width:249px;">VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td style="width:160px;">612-1702</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Compact Balance EK-610</td>
			<td style="width:249px;">A&#38;D, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Pierce&#8482; BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:249px;">Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">SuperSignal west pico chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:249px;">Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">GR 200 Precision Balance</td>
			<td style="width:249px;">A&#38;D, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Anti-GPR37</td>
			<td style="width:249px;">Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Primary antibodies used at a final concentration of 0.250ug/ml</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin</td>
			<td style="width:249px;">Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Primary antibodies diluted 1:10000</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">HRP-conjugated goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:249px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Secondary antibody diluted 1:10000</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:249px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Secondary antibody diluted 1:30000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

brain membrane fractionation: an ex vivo approach to assess subsynaptic protein localization

הערכת הרכב החלבון הסינפטי ותפקודו מהווה אתגר חשוב בתחום מדעי המוח. עם זאת, לא קל להעריך נוירוטרנסמינציה המתרחשת בתוך סינפסות כי זה מוסדר מאוד על ידי אינטראקציות חלבונים דינמי דינמי ואירועים זרחן. לפיכך, כאשר כל שיטה משמשת כדי ללמוד שידור סינפטית, המטרה העיקרית היא לשמור על שינויים אלה פיזיולוגיים חולף. כאן, אנו מציגים פרוטוקול קרום המוח פרוקציה המייצג תהליך חסון לבודד חלבונים השייכים תאים סינפטית שונים. במילים אחרות, פרוטוקול מתאר מתודולוגיה ביוכימי לבצע העשרת חלבון מ presynaptic, postsynaptic, ו extrasynaptic תאים. ראשית, synaptosomes, או מסופים סינפטי, מתקבלים נוירונים המכילים את כל תאים סינפטיים באמצעות שיפוע סוכרוז רציפה. ראוי לציין, את האיכות של ההכנה הראשונית הממברנה הסינפטי הזה הוא גקריטי. לאחר מכן, בידוד של תאים subsynaptic שונים מושגת עם solubilization קל באמצעות דטרגנטים מתונים בתנאים pH דיפרנציאלי. זה מאפשר הפרדה לפי צנטריפוגה ו צנטריפוגות isopycnic. לבסוף, העשרת החלבון בתאים הסובסינפטיים השונים ( כלומר, שברי קרום לפני ואחרי) נבדקה באמצעות ניתוח אימונובלוט תוך שימוש בסמנים חלבונים סינפטיים המאופיינים היטב ( כלומר, SNAP-25, PSD-95 ו- synaptophysin, בהתאמה), ובכך מאפשר הערכה ישירה של התפלגות הסינפטי של כל חלבון נוירונים מסוים.

המתודולוגיה המתוארת שימשה בעיקר לניתוח subsynaptic של חלבונים עצביים בכלל לבידוד אפיון ביוכימי של קולטנים סינפטיים 5 , 6 , 7 , 8 , 9 בפרט. מעניין, התוצאה נציג מוצג כאן לה?...

Watch this Scientific Journal Video about Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization at JoVE.com

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

כאן, אנו מציגים פרוטוקול קרום המוח פרוקציה המייצג תהליך חסון לבודד חלבונים השייכים תאים סינפטית שונים.

קרום המוח Fractation: An<em&gt; אקס ויוו</em&gt; גישה כדי להעריך לוקליזציה חלבון subsynaptic

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

brain-membrane-fractionation-an-ex-vivo-approach-to-assess

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

10.3K Views.  Universitat de Barcelona, L'Hospitalet de Llobregat.  כאן, אנו מציגים פרוטוקול קרום המוח פרוקציה המייצג תהליך חסון לבודד חלבונים השייכים תאים סינפטית שונים. 

Video: Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of diverse cellular functions, including cytoskeletal dynamics, cell motility, cell polarity, axonal guidance, vesicular trafficking, and cell cycle control. Changes in Rho GTPase signaling play an essential regulatory role in many pathological conditions, such as&#160;cancer, central nervous system diseases, and immune system-dependent diseases. The posttranslational modification of Rho GTPases (i.e., prenylation by mevalonate pathway intermediates) and GTP binding are key factors which affect the activation of this protein. In this paper, two essential and simple methods are provided to detect a broad range of Rho GTPase prenylation and GTP binding activities. Details of the technical procedures that have been used are explained step by step in this manuscript.

Here we describe a protocol to investigate the prenylation and guanosine-5'-triphosphate (GTP)-loading of Rho GTPase. This protocol consists of two detailed methods, namely membrane fractionation and a GTPase-linked immunosorbent assay. The protocol can be used for measuring the prenylation and GTP loading of different other small GTPases.

זיהוי של GTPase Prenylation קטן ו GTP איגוד באמצעות ממברנה Fractionation ו GTPase-מקושרים Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

ניתוח של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד מאת כחול מקורי אלקטרופורזה בג'ל

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as well as synthesis of essential metabolites. These organelles consist of the following three key sub-compartments. The envelope, characterized by two membranes, surrounds the organelle and controls the communication of the plastid with other cell compartments. The stroma is the soluble phase of the chloroplast and the main site where carbon dioxide is converted into carbohydrates. The thylakoid membrane is the internal membrane network consisting of grana (flat compressed sacs) and lamellae (less dense structures), where oxygenic photosynthesis takes place. The present protocol describes step by step procedures required for the purification, using differential centrifugations and Percoll gradients, of intact chloroplasts from Arabidopsis, and their fractionation, using sucrose gradients, in three sub-compartments (i.e., envelope, stroma, and thylakoids). This protocol also provides instructions on how to assess the purity of these fractions using markers associated to the various chloroplast sub-compartments. The method described here is valuable for subplastidial localization of proteins using immunoblotting, but also for subcellular and subplastidial proteomics and other studies.

Here, we describe a method to purify intact chloroplasts from Arabidopsis leaves and their three main sub-compartments (envelope, stroma, and thylakoids), using a combination of differential centrifugations, continuous Percoll gradients, and discontinuous sucrose gradients. The method is valuable for subplastidial and subcellular localization of proteins by immunoblotting and proteomics.

הכנת כלורופלסט תאי המשנה של תודרנית לניתוח של חלבון לוקליזציה Immunoblotting או פרוטאומיקס

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis process, which maintains enzymes far from their substrate. Characterization of these complex interactions is thus a challenge in complex substrates such as LB. The method here measures molecular interactions between fluorophore-tagged molecules and native autofluorescent lignin, to be revealed by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). Contrary to FRET measurements in living cells using two exogenous fluorophores, FRET measurements in plants using lignin is not trivial due to its complex autofluorescence. We have developed an original acquisition and analysis pipeline with correlated observation of two complementary properties of fluorescence: fluorescence emission and lifetime. sFLIM (spectral and fluorescent lifetime imaging microscopy) provides the quantification of these interactions with high sensitivity, revealing different interaction levels between biomolecules and lignin.

This protocol describes an original setup combining spectral and fluorescence lifetime measurements to evaluate F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between rhodamine-based fluorescent probes and lignin polymer directly in thick plant sections.

מדידת אינטראקציות בין הפלורסנט לליגנין בסעיפים צמחיים על ידי sFLIM בהתבסס על מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מקורית

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins remains elusive. Here, we describe a robust and effective method for determining the suborganellar localization of yeast mitochondrial proteins, which is considered a fundamental step during mitochondrial protein function elucidation. This method involves an initial step that consists of obtaining highly pure intact mitochondria. These mitochondrial preparations are then subjected to a subfractionation protocol consisting of hypotonic shock (swelling) and incubation with proteinase K (protease). During swelling, the outer mitochondrial membrane is selectively disrupted, allowing the proteinase K to digest proteins of the intermembrane space compartment. In parallel, to obtain information about the topology of membrane proteins, the mitochondrial preparations are initially sonicated, and then subjected to alkaline extraction with sodium carbonate. Finally, after centrifugation, the pellet and supernatant fractions from these different treatments are analyzed by SDS-PAGE and western blot. The submitochondrial localization as well as the membrane topology of the protein of interest is obtained by comparing its western blot profile with known standards.

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances, many yeast mitochondrial proteins still remain with their functions completely unknown. This protocol provides a simple and reliable method to determine the submitochondrial localization of proteins, which has been fundamental for the elucidation of their molecular functions.

הערכה של לוקליזציה של חלבון Submitochondrial ב ניצנים שמרים Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...