Diese Arbeit wurde durch das NIH (RO1-NS090390) unterstützt. Wir möchten auch danke Dr. Joan Steffanfor technische Hilfe und Diskussion während der Entwicklung des Assays.

Tier-Ethik-Anweisung - Experimente wurden durchgeführt in strikter Übereinstimmung mit der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren von den National Institutes of Health und einer genehmigten Tierversuche-Protokoll von der institutionellen Animal Care und Use Committee ( IACUC) an der University of California, Irvine, ein AAALAC akkreditierte Institution. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um die Leiden der Tiere zu minimieren.
1. Vorbereitung der Lyse Puffer
<ol><li>Vorbereiten "Wasserlöslich" Lyse-Puffer (10 mM Tris pH 7.4, 1 % Triton X 100, 150 mM NaCl, 10 % Glycerin) und Sterilfilter durch 0,22 µm-Filter.<ol>
<li>Für eine funktionierende "Wasserlöslich" Lyse Puffer messen N-Ethylmaleimide (NEM) und gründlich lösen sich in 100 mM Phenylmethysulfonyl Fluorid (PMSF) aufgelöst in 100 % EtOH. Hinweis: Lysis Puffer-Hemmer: (i) 20 mM N-Ethylmaleimide (NEM); (Ii) 0,2 mM PMSF; (Iii) 1 mM Natrium Orthovanadate (Na3VO4); (iv) 1 µg/mL Leupeptin; (V) 1 µg/mL Aprotinin; (vi) 20 mM Natriumfluorid (NaF). Achtung: Tragen Sie eine Gesichtsmaske bei der Arbeit mit NEM im gesamten Protokoll. Lyse Puffer arbeiten muss frische, aktive Inhibitoren zu gewährleisten erfolgen.</li>
		<li>Für lösliche Lyse Puffer mit Protease-Inhibitoren, fügen Inhibitoren in der folgenden Reihenfolge: Natriumfluorid (NaF), Volumen mit kalten Lyse Puffer, Natrium Orthovanadate (Na3VO4), Aprotinin und Leupeptin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Für "Unlösbaren" Lyse Puffer Ergänzung zu 4 % SDS durch Zugabe von 500 µL 20 % SDS auf 2 mL "Lösliche" Lyse Puffer. Lassen Sie bei Raumtemperatur. Hinweis: SDS wird sich überstürzen, wenn bei 4 ° C aufbewahrt; Beachten Sie dies bei Raumtemp. Endgültige Lysis Puffer Zusammensetzung: 10 mM Tris (pH 7,4); 1 % Triton x-100; 150 mM NaCl; 10 % Glycerin; 4 % SDS (nur unlösliche).</li>
</ol>(2) lösliche/unlösliche Fraktionierung Protokoll
Hinweis: Siehe Abbildung 1 für einen Schaltplan.
<ol><li>Zwei Sätze von Rohren für jede Probe zu kennzeichnen: "Lösliche" und "Unlöslich."</li>
	<li>Fügen Sie X µL eiskalte arbeiten lösliche Lyse Puffer mit Protease-Inhibitoren (siehe 1.1.1) Gewebe ergänzt hinzu. Hinweis: X = Volumen variiert je nach Gewebe; Siehe Tabelle 1.</li>
	<li>Für die Maus Hirngewebe (d.h. Striatum) beschriftet Dounce langsam 30 Mal in Glas 1 mL Douncer und Pipettieren in "Unlöslich" Rohr (halten auf Eis). Hinweis: Seien Sie vorsichtig, nicht zu brechen Oberfläche der Flüssigkeit nach dem Start von Douncing, wie Luftblasen bilden und möglicherweise unvollständig Homogenisierung führen.</li>
	<li>Zellen (d.h., HeLa, HEK293T) Spülen Sie in Zellen einmal mit kalten, 1 X PBS. Entfernen Sie PBS und minimalem Volumen der Lyse Puffer auf Zellen anwenden und heben mit Zelle Schaber. Hinweis: Für über Zell-Linien, Zellen waren vergoldet 5 x 105 Zellen pro 6-well-Platte und Konfluenz in der Nähe von gewachsen. Man ist gut vergleichbar mit Volumen für Maus Striatum verwendet.</li>
	<li>Transfer Homogenat oder Zelle lysate in beschriftet, "Unlösbaren" Röhren und lyse auf Eis 1 h (Startuhr nach letzten Rohr verarbeitet wird). Hinweis: Für die Zelle Lysates genannte mehrmals Zelle Klumpen vor Beginn der Inkubation aufzubrechen. Vermeidung von Blasenbildung. Vortex Puls kurz jede Probe für 1 s auf halbem Weg durch Lyse.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Proben bei 4 ° C bei 15.000 x g für 20 Minuten.</li>
	<li>Überstand als "Lösliche" Bruch zu erholen.<ol>
<li>Entfernen Sie mit pipettieren, achten Sie darauf, Pellet/trübe Schicht zu stören, da dies den Bruchteil verunreinigen wird. Pipettieren löslichen Anteil in "Lösliche" mit der Bezeichnung Rohr. Halten Sie auf dem Eis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie nach jedem Waschen Pellet mit 500 µL Puffer lyse (x2) und Zentrifuge bei 4 ° C bei 15.000 x g für 5 min; Es ist okay, wenn einige der trübe Schicht ist aus pipettiert.</li>
	<li>Nach dem letzten Waschen entfernen Sie alle verbleibenden Waschpuffer verlassen nur das Gewebe Pellet. Hinweis: Ab diesem Zeitpunkt sind unlösliche Proben jetzt bei Zimmertemperatur aufzubewahren.</li>
	<li>Aufschwemmen Pellet mit X-µL-Lyse-Puffer mit 4 % SDS ergänzt (Lautstärke kann eingestellt werden, je nach Größe der Pellets; siehe Tabelle 1).</li>
	<li>Beschallen Sie jede Probe für 30 s bei Raumtemperatur mit einer Sonde Sonikator (125 Watt, 20 kHz, Puls, Amplitude 40 %, siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Kochen Sie Proben (rollende Kochen) für 30 min; Zentrifugieren Sie kurz (15 s) bei 6.000 x g, jede Probe nicht zu verlieren.</li>
	<li>DC (Reinigungsmittel kompatibel) Protein Assay durchzuführen (siehe Tabelle der Materialien) oder Lowry Protein Assay, Proteinkonzentration (empfohlen begann Verdünnungen von 1/5 der Probe im jeweiligen Lyse Puffer für die Zellkultur und 1/10 für Gewebe Lysates) zu messen. Hinweis: Proteinkonzentrationen müssen mit einen DC oder Lowry-Assay aufgrund der hohen Konzentration Waschmittel gelesen werden.</li>
	<li>Aliquoten Proben in 50 µL Batches, Frost-Tausalz-Probleme zu vermeiden. Hinweis: Protokoll kann hier vor weiteren biochemischen Analyse angehalten werden, indem Sie speichern beide Fraktionen bei-20 ° C.</li>
</ol>3. Western-Blot und Quantifizierung
<ol><li>Führen Sie westliche Flecken wie berichtet an anderer Stelle1,13 durch Verdünnung 30 µg Probe 1:1 im Ladepuffer (1.6 x laden Farbstoff, 1 x Reduzierung). Hinweis: 30 µg Protein pro angebrochene reicht jedoch für optimale Auflösung eingestellt werden. 3 - 8 % Tris-Acetat Poly-Acrylamid Gele sollten für den unlöslichen Anteil verwendet werden. 4 - 12 % Bis-Tris Gele sind für die löslichen Fraktion empfohlen.</li>
	<li>Proben (rollende Kochen) für 5 min. Zentrifuge kurz kochen (15 s) bei 6.000 x g Probe zu sammeln.</li>
	<li>Bruchteile von SDS-PAGE und western-Blot, laut Protokoll des Herstellers für reduzierte Proben zu analysieren. Hinweis: Unlösliche Fraktion löst am besten, wenn auf 0,45 µM Nitrozellulose-Membran übertragen. 0,45 oder 0,2 µM Nitrozellulose einsetzbar für die löslichen Fraktion, abhängig von der Größe des Proteins des Interesses. Einige Optimierungen sein für beste Übertragung der HMW Materialien erforderlich.</li>
	<li>Färben Sie Membran mit ganzen Protein Fleck (z. B.MEMcode, siehe die Tabelle der Materialien), Protein laden Effizienz zu visualisieren. Hinweis: Westliche Flecken können durch mittlere Pixel Intensität analysiert werden. Löslichen Brüche können zu einem Haus-halten Protein am besten geeignet für das experimentelle System normalisiert werden. Unlösliche Bruch als relative Protein Fülle wurde durch reversible Protein beflecken oder Histon 3 Normalisierung auf separaten Blot überprüft.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ochaba, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIAS1+Regulates+Mutant+Huntingtin+Accumulation+and+Huntington's+Disease-Associated+Phenotypes+In+Vivo.">PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo.</a> Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).</li><li>La Spada, A. R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat+expansion+disease:+progress+and+puzzles+in+disease+pathogenesis.">Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis.</a> Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).</li><li>Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+neuropathology+of+Huntington's+disease.">Genetics and neuropathology of Huntington's disease.</a> Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).</li><li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington's+disease+chromosomes.">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li><li>Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease:+the+current+state+of+research+with+peripheral+tissues.">Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues.</a> Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).</li><li>Weydt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoregulatory+and+metabolic+defects+in+Huntington's+disease+transgenic+mice+implicate+PGC-1alpha+in+Huntington's+disease+neurodegeneration.">Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration.</a> Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).</li><li>Schulte, J., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biological+function+of+the+Huntingtin+protein+and+its+relevance+to+Huntington's+Disease+pathology.">The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology.</a> Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).</li><li>Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrantly+spliced+HTT,+a+new+player+in+Huntington's+disease+pathogenesis.">Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis.</a> RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).</li><li>Neueder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+exon+1+HTT+protein+is+produced+by+incomplete+splicing+in+Huntington's+disease+patients.">The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients.</a> Sci Rep. 7 (1), 1307 (2017).</li><li>Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+the+first+17+amino+acids+of+huntingtin+in+Huntington's+disease.">The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease.</a> Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).</li><li>Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin+acts+in+the+nucleus+to+induce+apoptosis+but+death+does+not+correlate+with+the+formation+of+intranuclear+inclusions.">Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions.</a> Cell. 95 (1), 55-66 (1998).</li><li>Kim, S., Kim, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Approaches+for+Inhibition+of+Protein+Aggregation+in+Huntington's+Disease.">Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease.</a> Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).</li><li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-2+and+PIAS1+modulate+insoluble+mutant+huntingtin+protein+accumulation.">SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation.</a> Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).</li><li>Shibata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+intracellular+accumulation+of+mutant+Huntingtin+by+Beclin+1.">Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1.</a> J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).</li><li>Apostol, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+assay+for+aggregation+inhibitors+as+therapeutics+of+polyglutamine-repeat+disease+and+validation+in+Drosophila.">A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).</li><li>Wanker, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+filter+assay+for+detection+of+amyloid-like+polyglutamine-containing+protein+aggregates.">Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates.</a> Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).</li><li>Sontag, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Mutant+Huntingtin+Aggregation+Conformers+and+Modulation+of+SDS-Soluble+Fibrillar+Oligomers+by+Small+Molecules.">Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules.</a> J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).</li><li>Grima, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+Huntingtin+Disrupts+the+Nuclear+Pore+Complex.">Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex.</a> Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).</li><li>Sontag, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylene+blue+modulates+huntingtin+aggregation+intermediates+and+is+protective+in+Huntington's+disease+models.">Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models.</a> J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).</li><li>Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricyclic+pyrone+compounds+prevent+aggregation+and+reverse+cellular+phenotypes+caused+by+expression+of+mutant+huntingtin+protein+in+striatal+neurons.">Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons.</a> BMC Neurosci. 10, 73 (2009).</li><li>Shahmoradian, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRiC's+tricks+inhibit+huntingtin+aggregation.">TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation.</a> Elife. 2, e00710 (2013).</li><li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+inhibition+induces+alpha-synuclein+SUMOylation+and+aggregate+formation.">Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation.</a> J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).</li><li>Goldberg, N. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Neural+Progenitor+Transplantation+Rescues+Behavior+and+Reduces+alpha-Synuclein+in+a+Transgenic+Model+of+Dementia+with+Lewy+Bodies.">Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies.</a> Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Für die oben genannten Protokolle, konsistente und quantitative Ergebnisse zu gewährleisten sind einige Vorsichtsmaßnahmen erforderlich. Erstens mHTT in beiden Fraktionen bilden spontan Aggregate im Laufe der Zeit auf mehrere Einfrieren-Tau-Zyklen, insbesondere in hoher Konzentration. Es ist also entscheidend für Aliquote die Protein-Preps Einfrieren und Auftauen nur das benötigte Volumen vor dem Ausführen des Tests, wie im obigen Protokoll beschrieben. Wenn unlösliche Fraktion weiß Fällungsmittel beim Auftauen ...

Die Unterbrechung der Protein-Qualitätskontrolle-Netzwerke, die korrekte Faltung sicherstellen und Abbau von zellulären Proteinen ist wahrscheinlich im Zentrum Pathologie in der Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Chorea Huntington (HD) und anderen "Protein misfolding" 2,3-Störungen. Ein detailliertes Verständnis der Proteostase-Netzwerk-Komponenten und ihre Beiträge zur Pathologie sind daher entscheidend für verbesserte therapeutische Interventionen zu entwickeln. HD wird durch die abnorme Erweiterung des CAG-Wiederholung innerhalb des Huntington-Gens, wodurch eine erweiterte Strecke der Polyglutamines (PolyQ) im Huntingtin (HTT) Protein4verursacht. Konsequente zeichnet pathologischen HD Pathogenese sich der daraus resultierenden Fehlfaltung, Anhäufung und Aggregation von HTT in Regionen des Gehirns und in peripheren Geweben, die nachweislich in mehrfacher Hinsicht stören normale Zelle Homöostase und Funktion 5 , 6. während HTT drückt sich ubiquitär, mittelgroße bedornten Neuronen im Striatum sind selektiv anfällig und meist offen betroffenen mit bemerkenswerten kortikale Atrophie, die auch im Zusammenhang mit HD Pathogenese.
Die Bildung von Aggregaten des HTT in das Gehirn von Huntington-Patienten und Tiermodellen hat in der Regel als Proxy-Marker für die Progression der Erkrankung und Dominant-Negative Verstärkung der Funktion für mHTT7serviert. Obwohl die genauen Mechanismen, durch welche, die Protein misfolding und Aggregation mHTT-induzierten Toxizität beitragen können, unklar bleiben, ist die Bildung dieser Einschlüsse im Gehirn von Huntington-Patienten und verschiedenen Tiermodellen eine Invariante und unvermeidbare Funktion. Einschlüsse auftreten, besteht weitgehend aus angesammelten HTT-Fragmente mit der N-terminalen erweitert PolyQ, darauf hinweist, dass Proteolyse und Verarbeitung von Full-length HTT sowie Alternative Spleißen8,9 spielen kann eine wichtige Rolle in der Pathogenese der HD. N-terminale HTT Fragmente kann eine pathologische Form der HTT darstellen, die schnell zu aggregieren, Siedelinie, und beschleunigen oder propagieren die Aggregation Prozess10.
Das Vorhandensein dieser Einschlüsse korreliert jedoch nicht unbedingt mit HTT-induzierten Toxizität oder Zelle Tod11. HTT ist vorgeschlagen worden, eine Aggregation von einem löslichen Monomer durch lösliche Oligomere Arten und β-Sheet Fibrillen unlösliche Aggregate und Einschlüsse12durchlaufen. Diese verschiedenen Protein-Arten über standard biochemischen Assays zu lösen ist eine Herausforderung im Bereich aufgrund ihrer Stabilität in niedrig-Reinigungsmittel-Lyse Puffer und Schwierigkeiten bei der Visualisierung mit standard biochemischen Assays gewesen. Somit sind methodische Überlegungen entscheidend bei der Aufdeckung der Grad und die Muster der kumulierten und aggregierte mHTT.
Die hier vorgestellten Protokoll stellt eine Methode zum mehrere Zwischenprodukte der HTT, speziell die Bildung einer unlöslichen HMW HTT-Spezies zu visualisieren, die offenbar eng mit HD Pathogenese und Krankheit Fortschreiten1,13 verfolgen ,14. In der Lage, zu beheben und verfolgen Sie mehrere Arten von mHTT bietet Forschern eine biochemische Tool zur Pathogenese der Krankheit untersuchen und bewerten mögliche therapeutische Interventionen durch Modulation und Auswirkungen auf die Pathogenese der Krankheit.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterile Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP505RE</td>
			<td>Screw cap, sterile vaccum filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Tissue Grinder, Dounce</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Model Q125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Protein Assay</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5000111</td>
			<td>Comparable to Lowry assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris 1M buffer solution</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J60636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 5M solution</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>S0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% SDS solution</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>S0295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfony flouride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td>Create 0.5M stock solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td>Create 10mg/ml stock solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1153</td>
			<td>Create 10mg/ml stock solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4504</td>
			<td>Create 500mM stock solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HTT</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5492</td>
			<td>Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB100-56875</td>
			<td>Use 1:1000 for soluble western blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fractionation for resolution of soluble and insoluble huntingtin species

Die Anhäufung von fehlgefaltete Proteine ist zentral für Pathologie bei Chorea Huntington (HD) und vielen anderen neurodegenerativen Erkrankungen. Insbesondere eine pathologische Hauptmerkmal der Huntington-Krankheit ist die anomale Ansammlung von mutierten HTT (mHTT) Protein in hochmolekularen komplexe und intrazelluläre Einschlusskörperchen bestehend aus Fragmenten und andere Proteine. Herkömmliche Methoden zu messen und zu verstehen, dass die Beiträge der verschiedenen Formen der mHTT-haltige Aggregate Fluoreszenz-Mikroskopie, western-Blot Analyse und Filter enthalten trap Assays.
Die meisten dieser Methoden sind jedoch bestimmte Konformation, und können daher nicht die volle staatliche mHTT Protein Wandel aufgrund der komplexen Natur der aggregierten Löslichkeit und Auflösung lösen.
Für die Identifizierung der aggregierten mHTT und verschiedene modifizierte Formen und komplexe ist Trennung und Solubilisierung der zellulären Aggregate und Fragmente obligatorisch. Hier beschreiben wir eine Methode um zu isolieren und zu visualisieren, lösliche mHTT, Monomere, Oligomere, Fragmente und eine unlösliche hochmolekularen (HMW) angesammelt mHTT Arten. HMW mHTT tracks mit Fortschreiten der Erkrankung mit Maus Verhalten anzeigen entspricht, und hat durch bestimmte therapeutische Interventionen1nutzbringend moduliert wurden. Dieser Ansatz kann mit Mausgehirn, peripheren Geweben und Zellkulturen verwendet werden aber kann auf andere Modellsysteme oder Krankheit zusammenhängen angepasst werden.

Auflösung von löslichen und unlöslichen Zelle Lysates nach Fraktionierung kann mit westlichen Analyse und Filter Retardierung Assays (Abbildung 2) erkannt werden. Als Beispiel HEK293T Zellen wurden transfiziert mit Transfection Reagens (z.B. Lipofectamine 2000), mit HTT Exon 1 Codierung cDNA enthält 97 Glutamin wiederholt15 gefolgt von Poly Prolin reiche Region und durften diese Zellen Express für 44 h. Zellen behandelt w...

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Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Ein Verfahren ist für die Fraktionierung von löslichen und unlöslichen mutierte Huntingtin Arten aus Maus Gehirn und Zelle Kultur beschrieben. Die beschriebene Methode eignet sich zur Charakterisierung und Quantifizierung des Huntingtin-Proteins Flussmittel und hilft bei der Analyse von Protein-Homöostase in der Pathogenese der Krankheit und in Anwesenheit von Störungen

Fraktionierung für Auflösung von löslichen und unlöslichen Huntingtin-Arten

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

fractionation-for-resolution-soluble-insoluble-huntingtin

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.5K Aufrufe.  University of California Irvine. Ein Verfahren ist für die Fraktionierung von löslichen und unlöslichen mutierte Huntingtin Arten aus Maus Gehirn und Zelle Kultur beschrieben. Die beschriebene Methode eignet sich zur Charakterisierung und Quantifizierung des Huntingtin-Proteins Flussmittel und hilft bei der Analyse von Protein-Homöostase in der Pathogenese der Krankheit und in Anwesenheit von Störungen

Serie: Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme's biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.

A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.

Hochdurchsatz-Screening von Kohlenhydrat-abbauenden Enzymen Neuartige Unlöslich chromogenen Assays Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Forschung

Biochemie

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate neurotransmission that occurs within synapses because it is highly regulated by dynamic protein-protein interactions and phosphorylation events. Accordingly, when any method is used to study synaptic transmission, a major goal is to preserve these transient physiological modifications. Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments. In other words, the protocol describes a biochemical methodology to carry out protein enrichment from presynaptic, postsynaptic, and extrasynaptic compartments. First, synaptosomes, or synaptic terminals, are obtained from neurons that contain all synaptic compartments by means of a discontinuous sucrose gradient. Of note, the quality of this initial synaptic membrane preparation is critical. Subsequently, the isolation of the different subsynaptic compartments is achieved with light solubilization using mild detergents at differential pH conditions. This allows for separation by gradient and isopycnic centrifugations. Finally, protein enrichment at the different subsynaptic compartments (i.e., pre-, post- and extrasynaptic membrane fractions) is validated by means of immunoblot analysis using well-characterized synaptic protein markers (i.e., SNAP-25, PSD-95, and synaptophysin, respectively), thus enabling a direct assessment of the synaptic distribution of any particular neuronal protein.

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments.

Gehirn Membran Fraktionierung: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Bewertung der Subsynaptischen Protein-Lokalisierung

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain. The ionic detergent N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) effectively solubilizes natively folded proteins in brain tissue allowing the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from a wide range of neurodegenerative proteinopathies, such as Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease and amyotrophic lateral sclerosis, and prion diseases. Human control and AD postmortem brain tissues were homogenized and sedimented by ultracentrifugation in the presence of sarkosyl to enrich detergent-insoluble protein aggregates including pathologic phosphorylated tau, the core component of neurofibrillary tangles in AD. Western blotting demonstrated the differential solubility of aggregated phosphorylated-tau and the detergent-soluble protein, Early Endosome Antigen 1 (EEA1) in control and AD brain. Proteomic analysis also revealed enrichment of &#946;-amyloid (A&#946;), tau, snRNP70 (U1-70K), and apolipoprotein E (APOE) in the sarkosyl-insoluble fractions of AD brain compared to those of control, consistent with previous tissue fractionation strategies. Thus, this simple enrichment protocol is ideal for a wide range of experimental applications ranging from Western blotting and functional protein co-aggregation assays to mass spectrometry-based proteomics.

An abbreviated fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain is described.

Anreicherung von Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). SM is a common sphingolipid composed of a phosphorylcholine and a ceramide as the hydrophilic and hydrophobic component, respectively. A number of SM species are present in mammalian cells due to a variety in the sphingoid long chain base (LCB) and an N-acyl moiety in the ceramide. In this report, we show a method of estimating the number of carbon and double bonds in a LCB and an N-acyl moiety based on their corresponding product ions in MS/MS/MS (MS3) experiments. In addition, we present a quantitative analysis method for SM using two stable isotopically labeled SM species, which facilitates determining the range used in SM quantitation. The present method will be useful in characterizing a variety of SM species in biological samples and industrial products such as cosmetics.

Here, we present a protocol to quantify and qualify each sphingomyelin species using multiple reaction monitoring and MS/MS/MS mode, respectively.

Quantitative und Qualitative Methode für Sphingomyelin von LC-MS mit zwei stabilen isotopischer beschriftet Sphingomyelin Arten

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, resulting in the expression of the Huntingtin protein (Htt) or N-terminal fragments thereof with an expanded polyglutamine (polyQ) stretch.
The exon1 of the Huntingtin protein (Httex1) is the smallest Htt fragment that recapitulates many of the features of HD in cellular and animal models and is one of the most widely studied fragments of Htt. The small size of Httex1 makes it experimentally more amenable to biophysical characterization using standard and high-resolution techniques in comparison to longer fragments or full-length Htt. However, the high aggregation propensity of mutant Httex1 (mHttex1) with increased polyQ content (&#8805;42) has made it difficult to develop efficient expression and purification systems to produce these proteins in sufficient quantities and make them accessible to scientists from different disciplines without the use of fusion proteins or other strategies that alter the native sequence of the protein. We present here a robust and optimized method for the production of milligram quantities of native, tag-free Httex1 based on the transient fusion of small ubiquitin related modifier (SUMO). The simplicity and efficiency of the strategy will eliminate the need to use non-native sequences of Httex1, thus making this protein more accessible to researchers and improving the reproducibility of experiments across different laboratories. We believe that these advances will also facilitate future studies aimed at elucidating the structure-function relationship of Htt as well as developing novel diagnostic tools and therapies to treat or slow the progression of HD.

Here, we present a robust and optimized protocol for the production of milligram quantities of native, tag-free monomers and fibrils of the exon1 of the Huntingtin protein (Httex1) based on the transient fusion of small ubiquitin related modifier (SUMO).

Erzeugung von nativen, unmarkierten Huntingtin Exon1 Monomer und Fibrillen mit einem SUMO-Fusion-Strategie

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of diverse cellular functions, including cytoskeletal dynamics, cell motility, cell polarity, axonal guidance, vesicular trafficking, and cell cycle control. Changes in Rho GTPase signaling play an essential regulatory role in many pathological conditions, such as&#160;cancer, central nervous system diseases, and immune system-dependent diseases. The posttranslational modification of Rho GTPases (i.e., prenylation by mevalonate pathway intermediates) and GTP binding are key factors which affect the activation of this protein. In this paper, two essential and simple methods are provided to detect a broad range of Rho GTPase prenylation and GTP binding activities. Details of the technical procedures that have been used are explained step by step in this manuscript.

Here we describe a protocol to investigate the prenylation and guanosine-5'-triphosphate (GTP)-loading of Rho GTPase. This protocol consists of two detailed methods, namely membrane fractionation and a GTPase-linked immunosorbent assay. The protocol can be used for measuring the prenylation and GTP loading of different other small GTPases.

Erkennung von kleine GTPase Prenylation und GTP binden mit Membran Fraktionierung und GTPase verbundene Immunosorbentprobe Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and identification of an active pheromone compound. This method has resulted in the successful characterization of the chemical signals that function as pheromones in a wide range of animal species. Sea lampreys rely on olfaction to detect pheromones that mediate behavioral or physiological responses. We use this knowledge of fish biology to posit functions of putative pheromones and to guide the isolation and identification of active pheromone components. Chromatography is used to extract, concentrate, and separate compounds from the conditioned water. Electro-olfactogram (EOG) recordings are conducted to determine which fractions elicit olfactory responses. Two-choice maze behavioral assays are then used to determine if any of the odorous fractions are also behaviorally active and induce a preference. Spectrometric and spectroscopic methods provide the molecular weight and structural information to assist with the structure elucidation. The bioactivity of the pure compounds is confirmed with EOG and behavioral assays. The behavioral responses observed in the maze should ultimately be validated in a field setting to confirm their function in a natural stream setting. These bioassays play a dual role to 1) guide the fractionation process and 2) confirm and further define the bioactivity of isolated components. Here, we report the representative results of a sea lamprey pheromone identification that exemplify the utility of the bioassay-guided fractionation approach. The identification of sea lamprey pheromones is particularly important because a modulation of its pheromone communication system is among the options considered to control the invasive sea lamprey in the Laurentian Great Lakes. This method can be readily adapted to characterize the chemical communication in a broad array of taxa and shed light on waterborne chemical ecology.

Here, we present a protocol to isolate and characterize the structure, olfactory potency, and behavioral response of putative pheromone compounds of sea lampreys.

Die Identifizierung von Meerneunauge Pheromone mit Bioassay-geführte Fraktionierung

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. This method utilizes hypotonic buffers, digitonin, mechanical lysis and differential centrifugation to isolate the cytoplasm, mitochondria and plasma membrane. The process can be scaled to accommodate the needs of researchers, is inexpensive and straightforward. This method will allow researchers to determine protein localization in cells without specialized centrifuges and without the use of commercial kits, both of which can be prohibitively expensive. We have successfully used this method to separate cytosolic, plasma membrane and mitochondrial proteins in the human monocyte cell line U937.

Here, we present a protocol to isolate the plasma membrane, cytoplasm and mitochondria of U937 cells without the use of high-speed centrifugation. This technique can be used to purify subcellular fractions for subsequent examination of protein localization via immunoblotting.

Zelle Fraktionierung von U937 Zellen in der Abwesenheit von High-Speed-Zentrifugation

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis process, which maintains enzymes far from their substrate. Characterization of these complex interactions is thus a challenge in complex substrates such as LB. The method here measures molecular interactions between fluorophore-tagged molecules and native autofluorescent lignin, to be revealed by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). Contrary to FRET measurements in living cells using two exogenous fluorophores, FRET measurements in plants using lignin is not trivial due to its complex autofluorescence. We have developed an original acquisition and analysis pipeline with correlated observation of two complementary properties of fluorescence: fluorescence emission and lifetime. sFLIM (spectral and fluorescent lifetime imaging microscopy) provides the quantification of these interactions with high sensitivity, revealing different interaction levels between biomolecules and lignin.

This protocol describes an original setup combining spectral and fluorescence lifetime measurements to evaluate F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between rhodamine-based fluorescent probes and lignin polymer directly in thick plant sections.

Messung von Wechselwirkungen zwischen fluoreszierenden Sonden und Lignin in Pflanzenabschnitten durch sFLIM basierend auf nativer Autofluoreszenz

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve intracellular structures and the dynamics of biomolecules with ~20 nm precision. A prerequisite for SMLM are fluorophores that transition from a dark to a fluorescent state in order to avoid spatio-temporal overlap of their point spread functions in each of the thousands of data acquisition frames. BODIPYs are well-established dyes with numerous conjugates used in conventional microscopy. The transient formation of red-shifted BODIPY ground-state dimers (DII) results in bright single molecule emission enabling single molecule localization microscopy (SMLM). Here we present a simple but versatile protocol for SMLM with conventional BODIPY conjugates in living yeast and mammalian cells. This procedure can be used to acquire super-resolution images and to track single BODIPY-DII states to extract spatio-temporal information of BODIPY conjugates. We apply this procedure to resolve lipid droplets (LDs), fatty acids, and lysosomes in living yeast and mammalian cells at the nanoscopic length scale. Furthermore, we demonstrate the multi-color imaging capability with BODIPY dyes when used in conjunction with other fluorescent&#160;probes. Our representative results show the differential spatial distribution and mobility of BODIPY-fatty acids and neutral lipids in yeast under fed and fasted conditions. This optimized protocol for SMLM can be used with hundreds of commercially available BODIPY conjugates and is a useful resource to study biological processes at the nanoscale far beyond the applications of this work.&#160;

Conventional BODIPY conjugates can be used for live-cell single-molecule localization microscopy (SMLM) through exploitation of their transiently forming, red-shifted ground state dimers. We present an optimized SMLM protocol to track and resolve subcellular neutral lipids and fatty acids in living mammalian and yeast cells at the nanoscopic length scale.

Konventionelle BODIPY-Konjugate für Live-Cell Super-Resolution-Mikroskopie und Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...