אנו מודים למרכז גנטיקה Caenorhabditis (במימון המכון הלאומי לבריאות (NIH) במשרד של מחקר תשתית תוכניות P40 OD010440) עבור זנים. המחברים רוצה להודות בטיסט Roelens, אלי Lessman, סיפק לנו משוב בונה, המעבדה מנו ב CCNY, הנטר לשימוש של המעבדה שלהם עבור חלק הצילומים ועבור סיוע שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי פרס PSC-הנטר TRADB-46-113 ולהעניק NIH 1SC2GM118275-01. טרשת נפוצה מומן בחלקו על ידי מוסד קנדי מלגת פוסט-דוקטורט בריאות (CIHR), E.K. נתמכה על ידי עלייה NIH/NIGMS הענק GM062981.

1. הגדרה על rec-8 RNAi (יום 1-3 באיור2)
פרוטוקול זה משתנה בין Kamath ו Ahringer30.
<ol><li>עבור אינדוקציה של rec-8 dsRNA ביטוי Escherichia coli, להכין תולעים נימיות צמיחה בינוני (NGM) אגר צלחות31 בתוספת ריכוז סופי של 1 מ מ איזופרופיל-β-D-2-thiogalactopyranoside (IPTG) ו- µg 100/mL אמפיצילין. לאחסן בחושך ב 4 ° C עד השימוש, עד 4 שבועות.</li>
	<li>פס HT115 חיידקים נושאת את השיבוט rec-8 (W02A2.6) Ahringer המעבדה ספריה30 rec-8 השיבוט על גבי צלחות מרק לוריא (LB) בתוספת אמפיצילין µg/mL 100 ו- 50 µg/mL טטרציקלין. לגדול בין לילה ב שייקר ב 37 º C.</li>
	<li>יום 1, לחסן מושבות יחיד מן המושבות יחיד טרי מרוחים של החיידק HT115 e. coli נושא השיבוט RNAi rec-8 לתוך אמפיצילין המכיל 4 מ ל LB µg/mL 100 ו- 50 µg/mL טטרציקלין. לגדול התרבות חיידקים לילה ב מטרף או תוף רולר ב 37 º C.</li>
	<li>למחרת בבוקר (יום 2), זירוז ייצור של גדילי כפול (ds) RNA rec-8 W02A2.6 בתרבות חיידקי HT115 על-ידי הוספת ריכוז סופי של 1 מ מ IPTG, ומנענע למשך 40 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאחר אינדוקציה, זרע NGM/IPTG צלחות עם 100-200 µL של חיידקים rec-8 HT115 ואחסן צלחות בטמפרטורת החדר הלילה האפל (3 ביום).</li>
	<li>למחרת בבוקר (יום 4), להוסיף את המתח נמטודות הרצוי הלוחות חיידקים המושרה HT115 rec-8 כפי שמתואר בשלב 2.1 מתחת.</li>
</ol>2. יצירת ובידוד Tetraploids (יום 4-16 באיור2)
<ol><li>ביום הרביעי, מקום 3-4 צעירים L4 אנדרוגינוסים (הרביעי) הפרפרים והעשים של המתח דיפלואידי הרצוי על לוחות NMG/IPTG נזרע עם חיידקים rec-8 HT115 נפנתה יום לפני (שלב 1.5, לעיל). לגדול נמטודות ב 15 ° C בחושך.</li>
	<li>חזור על שלבים 1.3 ו 1.4 החל 3 ימים לאחר שלב 2.1, אשר יהיה שלושה ימים לפני (F1s) הוא צאצא ראשון מהשלב הזה הופכים L4s. העיתוי של שלב זה יהיה תלוי כמה מהר זן נמטודות גדל ב 15 º C. כמה זנים מוטציה דיפלואידי הן מגדלי איטי, תזמון זה צריך משובח כוונון על מנת לבודד tetraploids.</li>
	<li>יום 8 (לאחר 4 ימים של טיפול הזנה של RNAi rec-8 ), העברה-20 (2 אנדרוגינוסים/צלחת פטרי) אנדרוגינוסים L4 F1 (הדור הראשון שקבורה) גדל בתוך לחלילית-8 HT115 חיידקים על גבי HT115 טרי המושרה rec-8 RNAi ולאפשר אותם self-fertilize.<ol>
<li>לחלופין, העברת 20 אנדרוגינוסים F1 L4 גדל החיידק rec-8 HT115 על גבי טרי המושרה HT115 rec-8 RNAi חיידקים יחד עם זכרים ללא טיפול של המתח זהה (2 אנדרוגינוסים עם פלטה/זכרים 4-6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>ביום 13, התחל הקרנה על F2 (דור שקבורה) רומא המופיעות ארוך (לון) או באופן כללי גדול יותר מאשר הסוג הפרוע; ואז להעביר חיות לון בודדות על זנים OP50 או HB101 רגיל של חיידקים e. coli . המשך הקרנת F3 רומא (שקבורה השלישי); אולם, F3 רומא מ באותה הצלחת יכולה להיחשב זנים עצמאית אם הם הופכים הוקמה, כי הם יכולים להיות אחים מאותו הוקמה כבר אמא F2. הערה: tetraploids בשם מזוהים בקלות כי הם בבירור יותר diploids. אנדרוגינוסים פראי סוג הם שני שלישים קצר יותר tetraploids. כי זה ארוך יותר, גוף tetraploid עושה סיבוב נוסף כפי שהוא נע קדימה על ידי יצירת גלים sinusoidal כיפוף הגוף מהראש עד זנב (איור 3 א).</li>
	<li>לאפשר לון תולעים self-fertilize, מופצים על-ידי בחירת לון רומא עד רק לון רומא הינם הוליד בהיעדר rec-8 טיפול RNAi. פעולה זו עשויה להימשך שלושה דורות נוספים. תולעים לון לעיתים קרובות סטרילי, לא תשואה רומא.</li>
</ol>3. אימות Tetraploid זנים (סרט 1, איור 3 א, ב')
הערה: זנים Tetraploid הניתנים לאימות על ידי ספירת מספר הכרומוזומים שלהם oocytes מופרית. מיקרוסקופ פלואורסצנטי יכול לשמש על המסך עבור מספר זוגות כרומוזום oocytes דיפלואידי מופרית (לפני לחטיבות meiotic), אם המתח יש סמן פלורסנט כרומוזומים. בהיעדרו של כרומוזום פלורסנט סמנים, נמטודות tetraploid יכולים להיות מוקרן על ידי תיקון של נמטודות מכתים עם צבע DNA; ראה להלן פרוטוקול לתיקון אתנול, חיית-כל 4 ′, צביעת dihydrochloride 6-Diamidine-2 ′-phenylindole (דאפי).
<ol><li>צביעת דאפי כל בעלי חיים הערה: זנים Tetraploid נושא 12 זוגות כרומוזום מחוברים הניתנים לאימות מאת דאפי מכתימה את החיות האלה, ספירת מספר גופים דאפי שלה oocytes מופרית.<ol>
<li>מקום 5 כדי 10 µL של המאגר M931 בשקופית מיקרוסקופ, ואז להעביר נמטודות 6-10 המסירה.</li>
		<li>תחת מיקרוסקופ ויבתר, צייר רוב M9 מהמסירה מבלי להסיר את נמטודות עם טישו ניקוי נטולת מוך. לאחר מכן, מיד להוסיף טיפה 10 µL של 90% אתנול על התולעים. לאפשר את התולעים להתייבש לחלוטין, אבל לא יותר מכמה שניות.</li>
		<li>ברגע האתנול מתאדה (ניתן לראות זאת כפי שזה קורה מתחת למיקרוסקופ ויבתר), להוסיף µL 10 נוספים של 90% אתנול על התולעים.</li>
		<li>חזור על שלב 3.1.3 שלוש פעמים נוספות.</li>
		<li>ברגע הטיפה האחרונה של אתנול התאדו, להוסיף 6 µL של דאפי או Hoechst לצבוע הריכוז הסופי מומלץ בתקשורת הרכבה של בחירה (לדוגמה, 1:1,000 לדילול דאפי 2 ng/µL ריכוז מניות ב- M9). לאחסון לטווח ארוך של השקופיות, 0.5% p-phenylenediamine מומס 20 מ מ טריס-HCl, pH 8.8, גליצרול 90% כפתרון antifade, במקום M9 בלבד, עשוי לשמש.</li>
		<li>מכסה את התולעים בשקופית עם coverslip, לאטום את הקצוות של coverslip עם לק. הציון במיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (שלב 3.1.7) לפחות 10 דקות לאחר הוספת את coverslip. ניתן לאחסן שקופיות ללא antifade לכמה ימים ב 4 ° C לפני הבקיע, אבל האיכות של קרינה פלואורסצנטית מתחיל לרדת לאחר מספר ימים.</li>
		<li>באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה X 100, להבקיע במשחק oocyte מופרית הכי בוגרת, אשר נמצא בסמוך לגן spermatheca, טרם נכנס spermatheca את המספר של דאפי בודדים גופות (כרומוזום מהעשור זוגות) או הרחם.<ol>
<li>להבקיע בודדים גופות דאפי בתוך גרעין oocyte, השתמש להתמקד בסדר של המיקרוסקופ לנוע באיטיות מהחלק העליון של גרעין oocyte לתחתית במהלך ספירת. לאחר מכן, לספור מחדש באותו הגרעין תוך כדי הזזת המוקד בכיוון ההפוך (קרי, מהתחתית לצמרת של הגרעין) כדי לאשר את מספר הגופות דאפי שנספרו.</li>
		</ol>
</li>
		<li>ציון oocyte מופרית הבוגר ביותר של כל אחד הגונדות שני ב אנדרוגינוסים לפחות עשרה לכל זן לון יציב. Oocytes פראי סוג יש 6 גופות דאפי על ממוצע, 5 זוגות אוטוזום את זוג כרומוזום המין. הנוכחות של 12 גופים דאפי oocyte זנים לון יציב מצביע על כך החיות בגן זן זה הן או חלקית (4 סטים של Autosomes, 3 X-chromosomes) או (4 סטים של Autosomes, 4 X-chromosomes) tetraploids.</li>
		<li>לחשב את המספר הממוצע של גופים דאפי נצפתה מן oocytes (לפחות 10) מרובים לכל זן. אמנם אגע כמה זוגות כרומוזום או על העליון של אחד את השני, אז המספר של דאפי גופות ב oocyte לעיתים קרובות הוא קטן יותר מאשר המספר הממשי של כרומוזום זוגות.</li>
		<li>(אופציונלי) עוד יותר לאמת יציב זנים לון איפה המספר הממוצע של דאפי גופות 12 כדי לבדוק אם הם מלא (4A, 4 X) או חלקי (4A, 3 X) tetraploids על ידי immunofluorescence מכתים נגד כרומוזום ציר חלבונים כגון HTP-332. זה מכתים יבחין כרומוזום זוגות על-ידי הצגת תבנית בצורת צלב של כרומוזומים ינותק יחיד נוכח tetraploid חלקית.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ricke, R. M., van Ree, J. H., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+chromosome+instability+and+cancer%3A+a+complex+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Whole chromosome instability and cancer: a complex relationship.</a> Trends Genet. 24, 457-466 (2008).</li>
<li>Frawley, L. E., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Polyploidy.</a> Curr Biol. 25, R353-R358 (2015).</li>
<li>Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+bigger+is+better%3A+the+role+of+polyploidy+in+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">When bigger is better: the role of polyploidy in organogenesis.</a> Trends Genet. 31, 307-315 (2015).</li>
<li>Otto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+consequences+of+polyploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The evolutionary consequences of polyploidy.</a> Cell. 131, 452-462 (2007).</li>
<li>Davoli, T., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Causes+and+Consequences+of+Polyploidy+in+Normal+Development+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The Causes and Consequences of Polyploidy in Normal Development and Cancer.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).</li>
<li>Adams, K., Wendel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+patterns+of+gene+expression+in+polyploid+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Novel patterns of gene expression in polyploid plants.</a> Trends Genet. 21, 539-543 (2005).</li>
<li>Adams, K. L., Wendel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidy+and+genome+evolution+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Polyploidy and genome evolution in plants.</a> Curr Opin Plant Biol. 8, 135-141 (2005).</li>
<li>Berman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ploidy+plasticity%3A+a+rapid+and+reversible+strategy+for+adaptation+to+stress%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Ploidy plasticity: a rapid and reversible strategy for adaptation to stress.</a> FEMS Yeast Res. 16, (2016).</li>
<li>Levy, D. L., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Intracellular+Scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Intracellular Scaling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 113-135 (2012).</li>
<li>Breneman, A., Cande, J., Dunn, J., Burbank, K., O'toole, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+genetic+analysis+of+polyploidy+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide genetic analysis of polyploidy in yeast.</a> Nature. 443, 541-547 (2006).</li>
<li>Kuznetsova, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+instability%2C+tolerance+of+mitotic+errors+and+multidrug+resistance+are+promoted+by+tetraploidization+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells.</a> Cell Cycle. 14, 2810-2820 (2015).</li>
<li>Taylor, J. S., Van de Peer, Y., Meyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+duplication%2C+divergent+resolution+and+speciation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome duplication, divergent resolution and speciation.</a> Trends Genet. 17, 299-301 (2001).</li>
<li>Younis, A., Hwang, Y. -J., Lim, K. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploitation+of+induced+2n-gametes+for+plant+breeding%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Exploitation of induced 2n-gametes for plant breeding.</a> Plant Cell Rep. 33, 215-223 (2014).</li>
<li>Ihssen, P. E., McKay, L. R., McMillan, I., Phillips, R. B. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1577/1548-8659(1990)119%3C0698%3APMAGIF%3E2.3.CO%3B2">Ploidy Manipulation and Gynogenesis in Fishes: Cytogenetic and Fisheries Applications.</a> Trans Am Fish Soc. 119, 698-717 (2011).</li>
<li>Stanley, J. G., Allen, S. K., Hidu, H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0044848681900028">Polyploidy induced in the American oyster, Crassostrea virginica, with cytochalasin B.</a> Aquaculture. 23, 1-10 (1981).</li>
<li>Eakin, G. S., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14648853">Tetraploid development in the mouse.</a> Dev Dyn. 228, 751-766 (2003).</li>
<li>Heier, J., Takle, K. A., Hasley, A. O., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ploidy+manipulation+and+induction+of+alternate+cleavage+patterns+through+inhibition+of+centrosome+duplication+in+the+early+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Ploidy manipulation and induction of alternate cleavage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo.</a> Dev Dyn. 244, 1300-1312 (2015).</li>
<li>Arnold, B., Kim, S. -T., Bomblies, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Geographic+Origin+of+a+Widespread+Autotetraploid+Arabidopsis+arenosa+Lineage+Followed+by+Interploidy+Admixture%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Single Geographic Origin of a Widespread Autotetraploid Arabidopsis arenosa Lineage Followed by Interploidy Admixture.</a> Mol Biol Evol. 32, 1382-1395 (2015).</li>
<li>Session, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+evolution+in+the+allotetraploid+frog+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis.</a> Nature. 538, 336-343 (2016).</li>
<li>Gallardo, M. H., Bickham, J. W., Honeycutt, R. L., Ojeda, R. A., Köhler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+tetraploidy+in+a+mammal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Discovery of tetraploidy in a mammal.</a> Nature. 401, 341(1999).</li>
<li>Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+sex+determination+in+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Primary sex determination in the nematode C. elegans.</a> Development. 101, Suppl . 5-16 (1987).</li>
<li>Madl, J. E., Herman, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploids+and+sex+determination+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Polyploids and sex determination in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 93, 393-402 (1979).</li>
<li>Nigon, V. Polyploidie experimentale chez un nematode libre, Rhabditis elegans maupas. Bull Biol Fr Belg. 95, 187-225 (1951).</li>
<li>Woodruff, G. C., Eke, O., Baird, S. E., Félix, M. -A., Haag, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+Into+Species+Divergence+and+the+Evolution+of+Hermaphroditism+From+Fertile+Interspecies+Hybrids+of+Caenorhabditis+Nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Insights Into Species Divergence and the Evolution of Hermaphroditism From Fertile Interspecies Hybrids of Caenorhabditis Nematodes.</a> Genetics. 186, 997-1012 (2010).</li>
<li>Mlynarczyk-Evans, S., Roelens, B., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+That+Masking+of+Synapsis+Imperfections+Counterbalances+Quality+Control+to+Promote+Efficient+Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Evidence That Masking of Synapsis Imperfections Counterbalances Quality Control to Promote Efficient Meiosis.</a> PLoS Genet. 9, e1003963(2013).</li>
<li>Lozano, E., Sáez, A. G., Flemming, A. J., Cunha, A., Leroi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Growth+by+Ploidy+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of Growth by Ploidy in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 16, 493-498 (2006).</li>
<li>Roelens, B., Schvarzstein, M., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+Karyotype+in+Caenorhabditis+elegans+Reveals+Multiple+Inputs+Driving+Pairwise+Chromosome+Synapsis+During+Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Manipulation of Karyotype in Caenorhabditis elegans Reveals Multiple Inputs Driving Pairwise Chromosome Synapsis During Meiosis.</a> Genetics. 201, 1363-1379 (2015).</li>
<li>Martinez-Perez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossovers+trigger+a+remodeling+of+meiotic+chromosome+axis+composition+that+is+linked+to+two-step+loss+of+sister+chromatid+cohesion%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Crossovers trigger a remodeling of meiotic chromosome axis composition that is linked to two-step loss of sister chromatid cohesion.</a> Genes Dev. 22, 2886-2901 (2008).</li>
<li>Severson, A. F., Ling, L., van Zuylen, V., Meyer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axial+element+protein+HTP-3+promotes+cohesin+loading+and+meiotic+axis+assembly+in+C.+elegans+to+implement+the+meiotic+program+of+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The axial element protein HTP-3 promotes cohesin loading and meiotic axis assembly in C. elegans to implement the meiotic program of chromosome segregation.</a> Genes Dev. 23, 1763-1778 (2009).</li>
<li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li>
<li>Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWood%2C+WB+%22The+Nematode+Caenorhabditis+Elegans%22">The Nematode Caenorhabditis Elegans</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1988).</li>
<li>MacQueen, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Sites+Play+Dual+Roles+to+Establish+Homologous+Synapsis+during+Meiosis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosome Sites Play Dual Roles to Establish Homologous Synapsis during Meiosis in C. elegans.</a> Cell. 123, 1037-1050 (2005).</li>
<li>Martinez-Perez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossovers+trigger+a+remodeling+of+meiotic+chromosome+axis+composition+that+is+linked+to+two-step+loss+of+sister+chromatid+cohesion%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Crossovers trigger a remodeling of meiotic chromosome axis composition that is linked to two-step loss of sister chromatid cohesion.</a> Genes Dev. 22, 2886-2901 (2008).</li>
<li>Schvarzstein, M., Wignall, S. M., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+cohesion%2C+co-orientation%2C+and+congression+during+meiosis%3A+lessons+from+holocentric+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Coordinating cohesion, co-orientation, and congression during meiosis: lessons from holocentric chromosomes.</a> Genes Dev. 24, 219-228 (2010).</li>
<li>Kim, S., Spike, C., Greenstein, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKim%2C+S+%22Germ+Cell+Development+in+C.+elegans%22">Germ Cell Development in C. elegans</a>. , Springer. New York, NY. 277-320 (2013).</li>
<li>Peters, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+mitotic+and+meiotic+centriole+duplication+by+the+Plk4-related+kinase+ZYG-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Control of mitotic and meiotic centriole duplication by the Plk4-related kinase ZYG-1.</a> J Cell Sci. 123, 795-805 (2010).</li>
<li>Pasierbek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Caenorhabditis+elegans+cohesion+protein+with+functions+in+meiotic+chromosome+pairing+and+disjunction%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction.</a> Genes Dev. 15, 1349-1360 (2001).</li>
<li>Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+sex+determination+in+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Primary sex determination in the nematode C. elegans.</a> Development. 101, 5-16 (1987).</li>
<li>Flemming, A. J., Shen, Z. -Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+polyploidization+and+cellular+proliferation+drive+body+size+evolution+in+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 5285-5290 (2000).</li>
<li>Meneely, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+determination+in+polyploids+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sex determination in polyploids of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 137, 467-481 (1994).</li>
<li>Whangbo, J. S., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18450316">Environmental RNA interference.</a> Trends Genet. 24, 297-305 (2008).</li>
<li>Imae, R., Dejima, K., Kage-Nakadai, E., Arai, H., Mitani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endomembrane-associated+RSD-3+is+important+for+RNAi+induced+by+extracellular+silencing+RNA+in+both+somatic+and+germ+cells+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Endomembrane-associated RSD-3 is important for RNAi induced by extracellular silencing RNA in both somatic and germ cells of Caenorhabditis elegans.</a> Sci Rep. 6, 28198(2016).</li>
<li>Tijsterman, M., May, R. C., Simmer, F., Okihara, K. L., Plasterk, R. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+systemic+RNA+interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Genes required for systemic RNA interference in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 14, 111-116 (2004).</li>
<li>Cortes, D. B., McNally, K. L., Mains, P. E., McNally, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+asymmetry+of+female+meiosis+reduces+the+frequency+of+inheritance+of+unpaired+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The asymmetry of female meiosis reduces the frequency of inheritance of unpaired chromosomes.</a> Elife. 4, e06056(2015).</li>
<li>Vargas, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autosomal+Trisomy+and+Triploidy+Are+Corrected+During+Female+Meiosis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Autosomal Trisomy and Triploidy Are Corrected During Female Meiosis in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 207, 911-922 (2017).</li>
<li>Tabara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rde-1+gene%2C+RNA+interference%2C+and+transposon+silencing+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans.</a> Cell. 99, 123-132 (1999).</li>
<li>Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHodgkin%2C+J+%22Karyotype%2C+ploidy%2C+and+gene+dosage%22">Karyotype, ploidy, and gene dosage</a>. , University of Oxford. (2005).</li>
<li>Schoenfelder, K. P., Fox, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expanding+implications+of+polyploidy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The expanding implications of polyploidy.</a> J Cell Biol. 209, 485-491 (2015).</li>
<li>Levy, D. L., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Scaling+Problems+and+Solutions+in+Amphibians%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Biological Scaling Problems and Solutions in Amphibians.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8, a019166(2015).</li>
<li>Taylor, J. S., Van de Peer, Y., Braasch, I., Meyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+provides+evidence+for+an+ancient+genome+duplication+event+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+Royal+Soc+B%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics provides evidence for an ancient genome duplication event in fish.</a> Philos Trans Royal Soc B. 356, 1661-1679 (2001).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בייצור גמטות הפלואידי (n) הוא המפתח ליצירת זיגוטה דיפלואידי (2n)-הפריה. הפחתה זו של הגנום מתבצע במהלך המיוזה עם שתי חלוקות תאים עוקבים אחרי שכפול גנום יחיד. כדי ליצור הפלואידי גמטות, C. elegans, כמו עם רוב metazoans אחרים, הפרדת maternally, בטון אבהי-נגזר homologs בליגה הראשונה, ואילו האחות chromatids של כל homolog ולברים בליגה השנייה. אחת דרך את הגנום כולו polyploidy מתעוררת בטבע היא דרך הדור של גמטות להיכשל חצי גודל הגנום שלהם במהלך המיוזה.
זה ידוע כבר מעל 50 שנה את tetraploid C. elegans נמטודות הן קיימא ופורה. Nigon23, ו מאוחר יותר תלול בטירוף ו, הרמן22, שנוצר וזיהה קומץ של tetraploids C. elegans באמצעות שיבוש סגרגציה כרומוזום meiotic באמצעות טיפולי חום-הלם ושימוש גנטיים, בהתאמה. סינגל נוסף briggsae ג tetraploid זן נגזר באמצעות פרוטוקול זה למעלה מ-30 שנה מאוחר יותר24. Tetraploids אלה נוצלו לחקור איך C. elegans לקבוע אם להיות זכר או אנדרוגינוס, איך פלואידיות מווסת את קצב גדילתם וגודלם, וכדי לנתח זיווג ואת synapsis של מיוזה25,26, 38 , 39 , 40. אך אלה ומחקרים נוספים הדורשים שימוש tetraploids ספציפי או זנים triploid היו מוגבל על-ידי הקושי ביצירת זנים tetraploid בשיטה זו.
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר את הדור של 4A מלאים יציב, 4 X ושל חלקי 4A, 3 X tetraploid Caenorhabditis נמטודות זנים מכל הראשוני הרקע הגנטי דיפלואידי או קריוטיפ ללא שימוש גנטיים.
Tetraploidy עלולה להיווצר על ידי יותר מאשר מנגנון אחד C. elegans:
תלול בטירוף ו, הרמן הציע כי זנים tetraploid שהם יצרו כנראה נגזר מצב ביניים triploid. זנים שלהם התקבלו באמצעות בחירה דורות מרובים או על ידי חציית את triploid בשם ביניים עם זכרים דיפלואידי22. הליקויים בעבודת כרומוזום למחיצות בתוך לחלילית-8 מוטציות כי נותן לעלות oocytes דיפלואידי, זרע להציע מנגנון אפשרי אחר, שבו חיות tetraploid שעלולות להתעורר עם rec-8 RNAi ערכת27.
אנדרוגינוסים RNAi שטופלו rec-8 יכול לייצר דיפלואידי oocytes ו spermatocytes, אשר להצמיח בעלי חיים tetraploid על הפריה. בקנה אחד עם האפשרות הזו היא העובדה כי חלק אנדרוגינוסים F2 משובטים הולידה זנים לון יציב בהדור הבא, אשר עולה כי את אנדרוגינוסים לון F2 משובטים שם כבר tetraploid. לפי שיטת החצייה, הדור הראשון של אנדרוגינוסים RNAi מטופלים rec-8 הוא חצה עם זכרים ללא טיפול. Spermatocytes דיפלואידי יכול להיווצר עדיין אצל גברים כי הצלב נעשה בנוכחות חיידקים לבטא dsRNA rec-8 , לכן, גברים נחשפים rec-8 RNAi במהלך ההזדווגות לפחות 3 ימים. לכן, polyploids לון בערכת cross-fertilizing יכול גם יצרו מן ההפריה של oocytes דיפלואידי על ידי הזרע דיפלואידי. זני tetraploid יציב שעלולים להתעורר גם הפריה בין גמטות דיפלואידי או במעבר triploid חיות המכיל oocytes של פלואידיות משתנה עם חיות דיפלואידי בייצור הזרע הפלואידי.
שיקולים חשובים:
העצמי-לעומת ערכות הפרייה:
ערכת להפרות עצמית rec-8 RNAi F1 אנדרוגינוסים ובא ערכת המערבים מעבר של אנדרוגינוסים שטופלו עם לא מטופל בשני זכרים הולידה 4A, 4 X ו- 4A, זנים tetraploid X 3. למרות polyploids עוד היו בתחילה שבודד הערכה עצמית המפרה, יותר של בעלי חיים polyploid אלה היו סטרילי, ובכך הן ערכות יעילים באופן דומה לייצר זנים יציב tetraploid. הסיבות להצלחת מוגברת ו עקרות בערכת עצמית המפרה נותר עלום. למרות שתי ערכות יעילים באופן דומה, הערכה עצמית המפרה היא קלה יותר כאשר היא אינה דורשת את הבידוד של הזכרים להזדווגות. בנוסף, כאשר המתח עניין לא יעיל או פגומה-הזדווגות, הערכה עצמית המפרה. עדיף שלא ערכת cross-fertilizing עשוי לשמש ליצירת tetraploids מורכבים המכילים יותר מ שתי גרסאות של כרומוזום יחיד.
שינויים ומגבלותיה:
כיום, פרוטוקול זה כרוך rec-8 RNAi טיפול על ידי האכלת חיידקים לבטא dsRNA עבור הגן rec-8 . לפיכך, פרוטוקול זה לא עובד במינים Caenorhabditis להגיב RNAi מאכילים, או מוטציות פגומים ההתפשטות סביבתי או מערכתית של RNAi בין רקמות-41,-42,-43. פוטנציאל ניתן לפתור בעיה זו על ידי החדרת RNAi טיפול על ידי הזרקה ישירה של dsRNA עניין ישירות לתוך germline.
חיות triploid להפיקם באמצעות מעבר של tetraploid חיה דיפלואידי שממנו הופק, כי ערכה זו אינו יוצר יציב זנים triploid44,45. רק 15% מכלל הביצים הוליד triploids הפתח, הצאצאים שלהם בעיקר סטרילי רומא עקב אנאפלואידיה. בנוסף, הוא צאצא פורה ששרדו כמה נוטים להיות מלא או בסמוך diploids בתוך כמה דורות. זה סביר, לפחות בחלקו, כי oocytes חלקית מתקן טריזומיה מאת פנקסי כרומוזום השלישית לגוף קוטב meiotic במחלקה הראשונה.
מגבלה בלתי עבירים של פרוטוקול זה היא כי זה לא עובד עבור ביצוע tetraploids של מוטציות המשפיעות על רכיבים של מכונות RNAi כי הם עמידים בפני טיפול RNAi46.
פתרון בעיות:
RNAi rec-8:
כמה שיקולים מכריעים עבור פרוטוקול זה מוצלח. הראשונה היא להשתמש IPTG טריים וצלחות IPTG NMG טרי עבור אינדוקציה של ייצור dsRNA rec-8 חיידקים חיידקים HT115 נושא השיבוט rec-8 (W02A2.6). IPTG הוא רגיש אור וזה חשוב לצמצם חשיפה קלה צלחות. ניתן לאחסן IPTG צלחות עד חודש ב 4 ° C בחושך. שנית, rec-8 (W02A2.6) RNAi HT115 זני חיידקים מן הספריה Ahringer (Kamath ו- Ahringer 2003) הניב הפנוטיפ rec-8 חזקה יותר מאשר אחרים זמינים rec-8 HT115 שיבוטים.
זן tetraploid תחזוקה:
זני tetraploid גדלים באיטיות ומפיקים לכל היותר 50 progenies לכל דור47. כל זני tetraploid מזוהה יציבים יחסית, אך הם יכולים לשבור ולהפוך כאשר דיפלואידי הדגיש (תקשורת אישית ג'ונתן הודג'קין ותצפיות שלנו שלא פורסמו). לכן, חשוב לציין כי כאשר זנים tetraploid גדלים 25 ° c, חום-בהלם, מורעבים, או קפוא, מופשר, הם יכולים במהירות לחזור diploidy, לכן חשוב להמשיך לאסוף את החיות לון כאשר מפשירה זנים אלו או כאשר חשיפת זנים אלו בתנאים מלחיצים שעלולות לגרום להם לחזור.
יישומים אפשריים:
חקירה של האפקט או את התפקיד של כל הגנום polyploidization האבולוציה, מחזור התא, ביטוי גנים ופיתוח אורגניזמים רב תאיים הסתמכה על השוואות בין: תאים באורגניזם המכילים פלואידיות שונים, באותו התא סוגי קשר הדוק מינים עם פלואידיות שונים, או מינים אשר עברו האירועים polyploidization האחרונים אבולוציונית, בידוד פיזי3,5,6,7,8 ,11,18,19,20,48,49,50. למרות tetraploids יכול להיגזר דג זברה ומערכות מודל של העכבר, הצאצאים שלהם הם סטרילי או קטלני embryonically16,17. בנוסף, המערכות הללו דגם יש מחזורי החיים הארוכים, בהשוואה ל- C. elegans, ואת השיטות הזמינות כדי ליצור חיות polyploid הן מורכבות ולא יעיל. לכן, זנים של C. elegans נגזר על ידי שיטה זו תהיה אינסטרומנטלי לקדם כל חקירה על תופעות ועל תפקידיה של כל הגנום polyploidy אורגניזמים רב תאיים.
מאז triploid הנגזרות של tetraploid על ידי חוצה את tetraploid המקורי דיפלואידי, השוואה בין diploids, triploids tetraploids זה רק נבדלים מספר העותקים הגנום, מספק הזדמנות ייחודי וחסר תקדים הערכת שווי ערך חיות/איברים/תאים עם גודל הגנום שונים (או מנה ג'ין). גמישות ונוחות ערכת המתוארים כאן אפשרה לנו ליצור עשרות זנים tetraploid מרקע גנטי דיפלואידי או karyotypes. כמה זנים אלה שימשו כבר למנגנונים שאילתה של כרומוזום הומולוגי זיווג, synapsis במהלך המיוזה27.
זני tetraploid פראי סוג של מוטציה נושא סמנים פלורסנט תספק דרכים חדשות חקירה כדי להבין את קשרי הגומלין בין יחס הגודל של גרעיני/ציטוזול הגנום על החיה תאיים/סלולרי/עוגב ו כל שינוי קנה מידה, הגנום כולו polyploidization על הסתגלות, היווצרות המינים, מנה ג'ין, ביטוי ופיתוח רקמות ו עוגב. בנוסף המחקר של שינוי קנה מידה ביולוגית, הדור של זנים tetraploid יהיה משמעותי נוסף שאילתות של שאלות עקרוניות ביולוגיים הרלוונטיים יציבות הגנום איתות, חוץ-תאית, endoreduplication, הגנום כולו שכפול, ג'ין המינון, הסתגלות ללחץ, התפתחות של עמידות סמים, ואת מנגנון היווצרות המינים...

Polyploidy כל הגנום קיימת ברחבי הטבע אשר לעתים קרובות צעד שנדרש לצורך הסתגלות היווצרות המינים, organogenesis, ריפוי פצעים, דרוג ביולוגי; זה ידוע גם לקדם סרטן והן עמידות בפני תרופות1,2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. תעשיות החקלאות, דוגה ליצור צמחים polyploid דגים, רכיכות על ידי טיפול כימי (למשל, קולכיצין ו- orzalin) כדי לקבל שיעורי צמיחה מהירה, מגושם היבול והמשק החי13, 14,15. ייצור ניסיוני ולא יעיל של tetraploids קיימת עבור דג זברה של עכבר דגם מערכות16,17. עם זאת, רוב או כל polyploid multicellular שנוצרו על ידי בעלי החיים embryonically קטלני או סטרילי, ולכן לא אידיאלי במחקרי מעבדה על ההשפעות של polyploidy האורגניזם multicellular. כתוצאה מכך, כל הבנה של כל הגנום polyploidization אורגניזמים רב תאיים הוגבלה מינים קרובים אבולוציונית האחרונות polyploidization אירועים18,19,20 . נתיב כדי לקדם שאילתות של תפקיד ביולוגי או ההשלכות של polyploidization הוא השימוש של מערכת דגם C. elegans . חשוב, C. elegans הוא מערכת גנטית צייתן בדרך כלל קיים דיפלואידי, מכילה רק 5 autosomes (א) וכרומוזום מין אחד (X) לכל הגנום, הוא שקוף ומאפשר ויוו השגחה של תהליכים ביולוגיים, ו יש מחזור חיים קצר של 3-4 ימים (מביצה לבוגר בגרו). C. elegans הוכח להיות מסוגל לשחזר כמו tetraploid, אשר הוא הסוג הנפוץ ביותר של כל הגנום polyploidy בטבע. Triploid בעלי חיים יכול להיווצר על ידי חציית tetraploids עם diploids, אבל פלואידיות שלהם אינו יציב, ולהיות הזנים דיפלואידי בתוך כמה דורות.
ב העשורים האחרונים רק קומץ של קיימא הפורה של C. elegans זנים tetraploids היו מבודדים במעבדה, באמצעות אסטרטגיה מפרך, יוצר רק מוגבל סוגי זנים21,22, 23. אסטרטגיה זו יוצר tetraploids C. elegans באמצעות טיפולי הלם חום, אשר ככל הנראה משפיע על כרומוזום ההפרדה גמטות, הקרנה לבעלי polyploid בשם באמצעות סמנים גנטיים. Tetraploids האלו היו מאוד שימושי בירור של איך זה תולעים נימיות קובע אם להיות זכר או אנדרוגינוס. לימודי מאוחר יותר להשתמש זנים זמין כדי לחקור את הצמיחה, מנה ג'ין, ורגולציה של synapsis במהלך המיוזה הזה24,25,של נמטודות21,26. למרבה הצער, מחקרים אלה היו מוגבל על ידי הקושי ביצירת זנים חדשים tetraploid, על רקע גנטיים זנים אלו הכילו. המוצג כאן הוא פרוטוקול פשוטה ומהירה ליצירת tetraploids יציב, אשר שימש ליצירת זנים ללמוד ויסות synapsis במהלך המיוזה27.
כמו בטבע, polyploidization יכול להיווצר על ידי היווצרות של דיפלואידי במקום גמטות הפלואידי. מציאת שלנו כי מוטציה רכיב rec-8 מיוזה ספציפי cohesin מייצר זרע דיפלואידי, oocytes עולה כי הורסים את הגן rec-8 יגרום בייצור של רומא tetraploid (איור 1)27, 28,29. יצירת זנים tetraploid פשוט כרוך הורסים rec-8 על ידי התערבות RNA (RNAi), במשך שני דורות על מנת phenocopy התכונה rec-8 גמטות דיפלואידי מוטציה. בשם polyploids ניתן לזהות בקלות על ידי שלהם יותר מאשר גודל גוף נורמלי. Polyploids מאושרות כמו tetraploids מלאה או חלקית על-ידי ספירת מספר כרומוזומים לכל גרעין יציב קווים הם הוקמה לאחר.
האסטרטגיה המתוארים כאן מאפשר את הדור של יציבה tetraploid Caenorhabditis נמטודות זנים מכל הראשונית הרקע הגנטי דיפלואידי או קריוטיפ ללא שימוש גנטיים. מאחר פרוטוקול זה יותר יעיל, תכליתי, ופשוט יותר ערכת בעבר, הוא יתרחב את הכלים הדרושים כדי לבצע שאילתה על התפקידים של polyploidization בתהליכי יסוד של פיתוח, יציבות הגנום באבולוציה multicellular אורגניזמים. המגבלה רק הנראה לעין בשימוש של פרוטוקול זה הוא עמיד בפני RNAi גנטי ברקעים.

<table><tbody><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Motic Microscopy</td><td>SMZ171</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;NGM agar plates&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile</td><td>Tritech Research</td><td>T3305</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile</td><td>Tritech Research</td><td>T3500</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriological Agar, 5 kg</td><td>VWR</td><td>89140-850</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride, Biotechnology Grade</td><td>VWR</td><td>97061-278</td><td></td></tr><tr><td>Peptone, BD Bacto</td><td>VWR</td><td>90000-368</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin Trihydrate</td><td>VWR</td><td>97062-300</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, dioxane-free</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0391</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Growth Culture&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Lennox Broth</td><td>IBI Scientific</td><td>89126-176</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;LB Agar plates&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Lennox</td><td>IBI Scientific</td><td>89126-182</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibiotics&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin Trihydrate</td><td>VWR</td><td>97062-300</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline Hydrochloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258, Pentahydrate</td><td>Biotium</td><td>40045</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Biotium</td><td>40011</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Ethanol Fixation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP</td><td>Koptec, VWR</td><td>89125-166</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;M9 Buffer&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride, Biotechnology Grade</td><td>VWR</td><td>97061-278</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade</td><td>VWR</td><td>97062-346</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate, monobasic dihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC271750025</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNAi Clones&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA</td><td>Source Bioscience</td><td>W02A2.6</td><td></td></tr><tr><td>HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA</td><td>Dharmacon</td><td>RCE1182-202299820</td><td></td></tr></tbody></table>

manipulation of ploidy in caenorhabditis elegans

מנגנונים המערבות כל הגנום polyploidy תפקיד חשוב ב ההתפתחות והשינויים; כמו כן, דור חריג של תאים tetraploid נמצא קשור ההתקדמות של סרטן והן ההתפתחות של עמידות לתרופות. עד עכשיו, זה לא היה ריאלי לתמרן בקלות את פלואידיות של חיה multicellular ללא יצירת בעיקר סטרילי רומא. שהוצגו כאן הוא פרוטוקול פשוטה ומהירה ליצירת tetraploid Caenorhabditis elegans חיות מכל כל זן דיפלואידי. שיטה זו מאפשרת למשתמש ליצור דעה קדומה באזור הבידוד כרומוזום במהלך המיוזה, בסופו של דבר הגדלת פלואידיות C. elegans. אסטרטגיה זו מסתמכת על ההפחתה ארעית של ביטוי של הגן rec-8 לייצר גמטות דיפלואידי. מוטציה rec-8 מייצר גמטות דיפלואידי פוטנציאלי שיוכל לייצר את tetraploids על הפריה. ערכת צייתן זו שימש ליצירת זנים tetraploid נושאת מוטציות, כרומוזום rearrangements כדי לזכות בתובנה dynamics כרומוזומלית ואינטראקציות במהלך השיוך synapsis של מיוזה. שיטה זו יעילה ליצירת זנים tetraploid יציב ללא סמנים גנטיים, ניתן להחיל על כל זן דיפלואידי, יכול לשמש כדי להפיק triploid C. elegans. שיטה פשוטה זו שימושית עבור חוקרים אחרים השאלות הביולוגיות היסוד הרלוונטיים יציבות הגנום, ג'ין המינון, קנה מידה ביולוגית, איתות חוץ-תאית, הסתגלות ללחץ, התפתחות של עמידות לתרופות, ו מנגנונים של היווצרות המינים.

Watch this Scientific Journal Video about Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

שיטה זו מאפשרת לדור של נמטודות Caenorhabditis tetraploid ו- triploid של כל זן דיפלואידי. זני polyploid שנוצר על ידי שיטה זו השתמשו ללמוד אינטראקציות כרומוזום ב- meiotic prophase, שיטה זו שימושית לבחינת שאלות בסיסיות חשובות תא, התפתחותית, אבולוציונית, וביולוגיה סרטן.

מניפולציה של פלואידיות ב Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

manipulation-of-ploidy-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Genetics

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

11.0K Views.  City University of New York. שיטה זו מאפשרת לדור של נמטודות Caenorhabditis tetraploid ו- triploid של כל זן דיפלואידי. זני polyploid שנוצר על ידי שיטה זו השתמשו ללמוד אינטראקציות כרומוזום ב- meiotic prophase, שיטה זו שימושית לבחינת שאלות בסיסיות חשובות תא, התפתחותית, אבולוציונית, וביולוגיה סרטן.

Video: Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

הערכה מקיפה של תאי מין כימי רעילות שימוש נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Developmental Biology

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

מניפולציה ploidy של עוברי דג הזברה עם חום 2 הלם טיפול

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining

The C. elegans germline makes an excellent model for studying meiosis, in part due to the ease of conducting cytological analyses on dissected animals. Whole mount preparations preserve the structure of meiotic nuclei, and importantly, each gonad arm contains all stages of meiosis, organized in a temporal-spatial progression that makes it easy to identify nuclei at different stages. Adult hermaphrodites have two gonad arms, each organized as a closed tube with proliferating germline stem cells at the distal closed end and cellularized oocytes at the proximal open end, which join in the center at the uterus. Dissection releases one or both gonad arms from the body cavity, allowing the entirety of meiosis to be visualized. Here, a common protocol for immunofluorescence against a protein of interest is presented, followed by DAPI staining to mark all chromosomes. Young adults are immobilized in levamisole and quickly dissected using two syringe needles. After germline extrusion, the sample is fixed before undergoing a freeze crack in liquid nitrogen, which helps permeabilize the cuticle and other tissues. The sample can then be dehydrated in ethanol, rehydrated, and incubated with primary and secondary antibodies. DAPI is added to the sample in the mounting medium, which allows reliable visualization of DNA and makes it easy to find animals to image under a fluorescent microscope. This technique is readily adopted by those familiar with handling C. elegans after a few hours spent practicing the dissection method itself. This protocol has been taught to high-schoolers and undergraduates working in a research lab and incorporated into a course-based undergraduate research experience at a liberal arts college.

C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining

This is a commonly used method for C. elegans gonad dissection followed by freeze crack, which produces germline samples for immunofluorescence via antibody staining, or for simple DAPI staining to visualize DNA. This protocol has been successful for undergraduates in a research lab and in a course-based undergraduate research experience.

ג. אלגנס גונד דיסקציה והקפאת סדק לאימונופלואורסצנציה וצביעת DAPI

The C. elegans germline makes an excellent model for studying meiosis, in part due to the ease of conducting cytological analyses on dissected animals. ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as self-fertilizing hermaphrodites, which produce large broods of progeny-when males are present, they can produce even larger broods of cross progeny. Errors in meiosis, fertilization, and embryogenesis can be rapidly assessed as phenotypes of sterility, reduced fertility, or embryonic lethality. This article describes a method to determine embryonic viability and brood size in C. elegans. We demonstrate how to set up this assay by picking a worm onto an individual Modified Youngren's, Only Bacto-peptone (MYOB) plate, establish the appropriate timeframe to count viable progeny and non-viable embryos, and explain how to accurately count live worm specimens. This technique can be used to determine viability in self-fertilizing hermaphrodites as well as cross-fertilization by mating pairs. These relatively simple experiments are easily adoptable for new researchers, such as undergraduate students and first-year graduate students.

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Here, we present a general method to determine the embryonic viability and total number of embryos produced (brood) using the model organism C. elegans.

מדידת כדאיות עוברית וגודל הברוד ב- Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a well-established model organism used across a range of basic and biomedical research. Within the nematode research community, there is a need for an affordable and effective way to maintain large, age-matched populations of C. elegans. Here, we present a methodology for mechanically sorting and cleaning C. elegans. Our aim is to provide a cost-effective, efficient, fast, and simple process to obtain animals of uniform sizes and life stages for their use in experiments. This tool, the Caenorhabditis Sieve, uses a custom-built lid system that threads onto common conical lab tubes and sorts C. elegans based on body size. We also demonstrate that the Caenorhabditis Sieve effectively transfers animals from one culture plate to another allowing for a rapid sorting, synchronizing, and cleaning without impacting markers of health, including motility and stress-inducible gene reporters. This accessible and innovative tool is a fast, efficient, and non-stressful option for maintaining C. elegans populations.

Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

The current protocol includes a methodology for the sorting and cleaning of age-matched populations of Caenorhabditis elegans. It uses a simple, inexpensive, and efficient custom-made tool to obtain a large experimental population of nematodes for research.

Caenorhabditis נפה:, מכשיר low-tech ו מתודולוגיה לצורך מיון אורגניזמים רב תאיים קטנים

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a well-established model organism used across a range of basic and biomedical research. Within the nematode ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Biology

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

גישות כמותיים ללימוד מבנים סלולאריים ומורפולוגיה ארגונית בקנבאבדיוטיס

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather than individual worm samples to quantify bacterial load in this organism. Here it is argued that the large inter-individual variability seen in bacterial colonization of the C. elegans intestine is informative, and that batch digest methods discard information that is important for accurate comparison across conditions. As describing the variation inherent to these samples requires large numbers of individuals, a convenient 96-well plate protocol for disruption and colony plating of individual worms is established.

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

This protocol describes a 96-well disruption of individual bacterially colonized Caenorhabditis elegans following cold paralysis and surface bleaching&#160;to remove external bacteria. The resulting suspension is plated on agar plates to allow accurate, medium-throughput quantification of bacterial load in large numbers of individual worms.

שימוש בנתונים של תולעת בודדת כדי לכמת את ההטרוגניות באינטראקציות של Caenorhabditis elegans-Bacterial

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

C. elegans Development and Reproduction

Ceanorhabditis elegans is a powerful tool to help understand how organisms develop from a single cell into a vast interconnected array of functioning tissues. Early work in C. elegans traced the complete cell lineage and structure at the electron microscopy level, allowing researchers unprecedented insight into the connection between genes, development and disease. Appreciating the stereotyped development and reproductive program of C. elegans is essential to using this model organism to its experimental fullest.
This video will give you a peek into the development of a worm from fertilization to hatching, and walk you though the life stages of the newly hatched larvae on its journey to reproductive maturity. The video will detail how the major axes are established, which founder cells give rise to what tissues in the developing embryo and how to discriminate between the four larval stages. Finally, you will learn how to set up a genetic cross and we&quot;ll visit a few applications that manipulate the development and reproduction of C. elegans to experimental benefit.

Development and Reproduction of Caenorhabditis elegans

ג. אלגנס פיתוח ורבייה

Ceanorhabditis elegans is a powerful tool to help understand how organisms develop from a single cell into a vast interconnected array of functioning ...