פרוטוקול זה מדגים שיבוש מכני של אלגנס ים. בפורמט של 96 בארות המאפשר כימות תפוקה בינונית של עומס חיידקים בתולעים בודדות. טכניקה זו מגבירה את המהירות והאחידות של שיבוש מכני בהשוואה לשיטות מבוססות פאסל המאפשרות לחוקרים לייצר בקלות ערכות נתונים גדולות יותר של מדידות תולעת בודדת באיכות גבוהה.
טכניקה זו כוללת חלקים נעים רבים וקל לאבד את מקומך. ודאו שיש לכם את כל החומרים, הצינורות המסומנים, המאגרים והצלחות שהוכנו לפני שתתחילו. מי שתדגים את ההליך תהיה מייגן טיילור, מומחית מחקר מובילה מהמעבדה שלי.
התחל על ידי השעיה מחדש של דגימת התולעת במיליליטר אחד של M nine TX zero one בצינור מיקרו צנטריפוגה. לאסוף את התולעים הבוגרות על ידי צנטריפוגה ולהשליך את supernatant. שימוש באותם פרמטרים של צנטריפוגה.
שטפו את התולעים פעמיים עם מיליליטר אחד של M9TX01 ופעם אחת עם מיליליטר אחד של מאגר תולעים M9, כדי למזער את החיידקים החיצוניים. לאחר מכן, להשעות מחדש כל דגימה במיליליטר אחד של S בינוני ועוד שני x חום הרג OP50 בצינור תרבית. דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 30 דקות כדי להעביר את החיידקים שאינם דבקים במעיים.
לאחר הדגירה, שטפו את התולעים המטוהרות פעמיים עם מיליליטר אחד של M9TX01 קר והשליכו את הסופר נטנט. שים את הצינורות על הקרח במשך 10 דקות כדי לשתק את התולעים. לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של חיץ תולעת M תשע קר כקרח עם אקונומיקה ללא בישום לכל צינור.
דגירה של הצינורות על הקרח למשך 10 דקות לפחות כדי להרוג חיידקים חיצוניים. השליכו את חיץ האקונומיקה והחזירו את הצינורות לקרח כדי למנוע מהתולעים לשאוב. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של M9TX01 קר לכל צינור וצנטריפוגה למשך חמש שניות.
במיני צנטריפוגה. החזירו את הצינורות לקרח והסירו את הסופרנטנט. חזור על שלב זה פעם אחת.
עבור permeabilization כימי של הקוטיקולה תולעת. מעבירים את הצינורות המכילים את התולעים ב-20 מיקרוליטרים של חיץ למתלה צינורות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של תמיסת SDS/DTT לכל דגימה חמה.
לדגור את הצינורות עד שמונה דקות על הספסל כדי לשבור חלקית את הקוטיקולה של התולעים הבוגרות. בשלב זה, התולעים ימותו וישקעו בתחתית הצינור. לאחר הדגירה, יש להשליך בזהירות את ה-SDS/DTT.
לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של M9TX01 לכל צינור וצנטריפוגה לזמן קצר כדי לגלגל את התולעים. השליכו את הסופר-נטנט ושעו מחדש את התולעים במיליליטר אחד M 9 תולעת חיץ עם 0.1% טריטון x-100. כדי להתכונן לשיבוש מכני של תולעים, להשיג באר סטרילית בעומק שני מיליליטר 96 צלחת באר וכיסוי צלחת סיליקון.
השתמש במרית סקופ סטרילית כדי להוסיף כמות קטנה של קרביד סיליקון סטרילי 36 רשת לכל באר, כך שהרשת בקושי מכסה את תחתית הבאר. הוסף 180 מיקרוליטרים של מאגר תולעים M תשע לכל באר. תייג את העמודות והשורות ולאחר מכן כסה את הצלחת באופן רופף בכיסוי צלחת הסיליקון.
לאחר מכן, העבירו את התולעים החדירות לצלחת פטרי קטנה עם M9TX01 מלא עד לעומק של סנטימטר אחד. באמצעות ניתוח מיקרוסקופ פיפטה החוצה תולעים בודדות בנפחים של 20 מיקרוליטר ולהעביר אותם לבארות בודדות של צלחת 96 באר כדי להוציא את כל התולעים דבוקות לפיפטה, לשאוף 20 מיקרוליטרים של M9TX01 מאזור ברור של צלחת פטרי ולשחרר אותו בחזרה לתוך המנה. לאחר העברת כל התולעים מכסים את צלחת הבאר 96 עם גיליון של סרט תקרה גמיש כאשר הצד המגובה בנייר פונה כלפי מטה אל בארות הדגימה.
הניחו קלות את שטיחון תקרת הסיליקון על גבי סרט התקרה הגמיש מבלי ללחוץ את הכיסוי אל תוך הבארות. הניחו את הצלחת על ארבע מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 דקות כדי למנוע התחממות יתר במהלך הפרעה. לאחר קירור הצלחת לחץ על משטח תקרת הסיליקון בחוזקה לתוך הבארות כדי לאטום אותן.
לאחר מכן אבטחו צלחות במשבש הרקמות. מנערים את הצלחות במשך דקה אחת ב-30 הרץ. לאחר מכן סובב את הצלחות ב -180 מעלות וחזור על הרעד במשך דקה אחת.
הקש את הצלחות בחוזקה על הספסל פעמיים או שלוש כדי לנתק כל חצץ מסרט התקרה הגמיש. צנטריפוגה צלחת להגדיר 2, 400 פעמים G במשך שתי דקות כדי לאסוף את הדגימות בתחתית הבארות. לאחר מכן הסר את מכסה הסיליקון ומשוך את סרט התקרה.
כדי להכין דילול סדרתי פי עשרה של עיכול התולעת, מלאו 180 מיקרוליטרים של X PBS אחד בשורות B עד D של צלחת 96 באר. באמצעות פייפטר רב-באר המוגדר ל-200 מיקרוליטרים, מערבבים באיטיות את תקציר התולעת על ידי פיפטינג. מעבירים את הכמות המרבית של הנוזל לשורה A של לוחית 96 הבאר המכילה PBS.
באמצעות פיפטה רב ערוצית, הסר 20 מיקרוליטרים מהשורה העליונה וחלק לשורה B.ולאחר מכן ערבוב. חזור על שלב זה עבור שורה B עד C ולאחר מכן שורה C עד D כדי לקבל דילול פי 1000 עבור כימות חיידקי של תולעים מונו-קולוניאליות. צלחת 10 עד 20 מיקרוליטר של כל דילול על צלחות אגר מוצקות.
עבור התיישבות מרובת מינים, צלחת 100 מיקרוליטר של כל דילול על לוחות אגר 10 ס"מ. באמצעות פרוטוקול זה, חיטוי חיצוני יעיל נצפה לאחר הלבנה על פני השטח של תולעים משותקות קרות כפי שניתן לראות על ידי ירידה של חיידקים חיצוניים במאגר. מבלי להשפיע על החיידקים הקשורים למעי.
שיבוש ידני של תולעים הביא להטרוגניות רבה יותר. חצץ סיליקון קרביד היה אידיאלי לשיבוש עם או בלי טרי אנדקס. בשיטת 96 באר, חרוזי זכוכית גדולים לא התאימו לטכניקת 96 באר.
חרוזי זכוכית קטנים הניבו תוצאות עקביות אך סתמו את הצינור בקצהו. תולעים שהתיישבו על אותו מאגר חיידקים הראו שונות גבוהה בעומס המעיים כאשר נצפו עבור חיידקים בודדים וקהילות חיידקים מרובות מינים. תולעים שהתיישבו עם חיידקים המבטאים GFP, הראו הטרוגניות במדידות תולעים בודדות.
עבור GFP זה מבטא זן חיידקי המשווה את ההתיישבות של סוג בר בריסטול לן שתי תולעים. ל-DAF שני מוטנטים של IGF הראו כי המוטציה DAF 16 תומכת באוכלוסיות גדולות יותר של חיידקים, בעוד ש-DAF שתיים עמידות להתיישבות. הטרוגניות זו הייתה אופיינית ועקבית לאורך ריצות שונות של אותו ניסוי.
דגימה מחדש של נתונים כדי לדמות תקצירי אצווה נמצאה כמשנה את ההתפלגות בהשוואה לנתוני תולעים בודדים. האצווה אקסטרפולציה של CFU לכל תולעת התרכזה סביב הממוצע האריתמטי של הנתונים הבודדים שהובילו לאובדן השונות הביולוגית. במקום להמשיך לעכל אקונומיקה של משטח חי ולשטוף תולעים ניתן להשתמש בהן לניסויים נוספים.
התנועה תתחדש במהירות לאחר הסרת התולעים מהקור.
