עבודה זו נתמכה על ידי מענק הפרויקט טייס ממרכז CREH ממומן על ידי NIEHS ועל ידי הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (מספר 31572626).

ניסויים בבעלי חיים כל הוצאו להורג בדרישות ההנחיות הרלוונטיות כל, תקנות וגופים רגולטוריים. פרוטוקול להיות הפגינו בוצעה תחת הדרכה ואישור של טיפול בעלי חיים מוסדיים ושל שימוש הוועדה (IACUC) של טקסס A & M המכון ללימודי רפואה גנומית.
1. פתרון הכנה
<ol><li>לדלל תמיסת מלח מאוזנת של האנק x 10 ל- x 1 עם כפול מזוקקים H2O, ולאחסן ב 4 º C.</li>
	<li>הכינו את הפתרון בידוד על-ידי הוספת HEPES (10 מ מ), MgCl2 (1 מ מ) וגלוקוז (5 מ מ). להתאים את ה-pH ל 7.4 ולשמור על קרח.</li>
	<li>להכין את הפתרון collagenase מן collagenase Type 4. הערה: באופן ספציפי, collagenase Type 4 מכיל 160 U לכל מ ג של משקל יבש. 1 גר' collagenase Type 4 הוא מדולל 5 מ"ל כפול מזוקקים H2O עם ריכוז של 200 מ"ג/מ"ל. 2 מיליליטר Collagenase מדולל מתווסף 30 מ ל הקרח בידוד קר פתרון, 6 מ של פתרון collagenase מועבר שפופרת 50 מ עבור כל עכבר.</li>
	<li>הכינו את הפתרון שטיפת על-ידי הוספת 1 מ"מ CaCl2 הפתרון בידוד.</li>
	<li>הכינו את פתרון טיהור בעזרת פתרון diatrizoate polysucrose קר/נתרן (1.1119 g/mL, 5 mL).</li>
	<li>להכין 500 מ"ל של איון תרבות בינוני על-ידי הוספת-גלוטמין (20 מ מ), פניצילין (100 U/mL), סטרפטומיצין (100 µg/mL), סרום שור עוברית (FBS) (10%) לתוך RPMI בינונית.</li>
	<li>להכין את הפתרון DCFH-DA מניות על ידי המסת אבקה מים מזוקקים-200 מיקרומטר, חנות ב-20 ° C. הערה: האבחון מכתים הפתרון נעשה טרי על ידי דילול לפתרון מניות DCFH-DA הריכוז הסופי של 5 מיקרומטר ב- RPMI. ריאגנט הזה צריך להיות מוגן מפני אור.</li>
</ol>2. ניתוח הכנה
<ol><li>Intraperitoneally להזריק (I.P.) עכבר עם avertin (2.5% avertin, 0.4 מ ל/20 גרם). אחרי העכבר הוא מורדם לחלוטין, כבר לא מגיב כדי הינד רגל צובט, המתת חסד בעכבר והזז מכסה המנוע ביולוגי.</li>
	<li>הנח את העכבר לאללה עם הצד הבטן פונה כלפי מעלה, לרסס את העור עם אתנול 70% עבור עיקור.</li>
	<li>פתיחת חלל הבטן עם 1 ס מ U-החתך על הבטן העליונה ומשכו את העור בכיוון rostral החזה כדי לחשוף את חלל הבטן.</li>
</ol>3. לבלב זלוף והסרה
<ol><li>כמופיע באיור1, למצוא את המיקום של ampulla. השתמש זוג מלקחיים מעוקל נכנעתי התריסריון קרוב המיקום של הסוגר של Oddi. להשתמש עוד זוג מלקחיים מעוקל תהדק את הקיר התריסריון כדי לחסום את המעבר מרה תריסריון. הערה: Ampulla לא הוכנס בשלב זה. שלב זה נועד לחסום את המעבר מרה תריסריון.</li>
	<li>למקם מחדש את העכבר עם הראש הפרוקסימלית ואת כפות הרגליים דיסטלי לגבי החוקר.</li>
	<li>למצוא את צינור המרה, לאט להזריק 3 מ"ל של collagenase פתרון בעזרת מזרק 5 מ ל ומחט 30 גרם. ודא שאת צינור המרה והלבלב הם בניפוח לאחר הזריקה.</li>
	<li>הסר את הלבלב נפוחה באמצעות מלקחיים מעוקל מספריים בסדר כדי להפרידו מן יורד קולון, המעיים, קיבה, טחול. למקם את הלבלב צינור 50-mL המכיל 3 מ"ל של פתרון collagenase ולשמור אותו בקרח.</li>
</ol>4. לבלב עיכול
<ol><li>מקם כל שפופרת 50-mL לתוך אמבט מים 37 º C. תקופת דגירה של 15-20 דקות (זמן משתנה עם זן, הגיל של העכברים).</li>
	<li>רטט הצינור באמצעות מערבולת.</li>
	<li>בריכה 4-5 הלבלב מתעכל במסננת גדולה כיור סטרילי והשתמש סקופ כדי להפוך הלבלב להתפרק ביסודיות. להשתמש בכוח pipette התאים מתעכל מהמסך 23 גרם 10 מ"ל ומחט המזרק המכיל שטיפת פתרון. לאסוף את הפתרון לשטוף בצינור 50-mL.</li>
	<li>Centrifuge הצינורות ב g x 97 ב 4 ° C עבור 1 דקות, decant את תגובת שיקוע.</li>
	<li>להוסיף 25 מ של פתרון לשטיפת צינורות, מחדש להשעות את הרקמה על ידי עדין vortexing. ספין לאורך הרקמות ב g x 97 ב 4 ° C עבור 1 דקות, decant את תגובת שיקוע. חזור על 3 פעמים. להיזהר לא להוציא את הרקמה pelleted.</li>
</ol>5. טיהור של איים קטנים
<ol><li>להוסיף 10 מ של פתרון טיהור בגדר רקמות שטף, resuspend בעדינות את התוכן.</li>
	<li>בעדינות כשכבת-על 5 מ של בידוד פתרון על הפתרון טיהור. הקפד לשמור על ממשק נוזלי חדה בין שני הפתרונות.</li>
	<li>Centrifuge את הצינור 560 x g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עם האצה איטית, בלי בלמים. להוסיף את פיפטה לתוך הממשק ולאסוף את השכבה איים קטנים לתוך צינורות 50 מ ל חדש.</li>
	<li>לשטוף את איונים כפי שמתואר בשלב 3.5.</li>
</ol>6. ציפוי וטיפול של תאי איון
<ol><li>Resuspend ע ב 10 מ"ל של איים קטנים תרבות פתרון מערבבים היטב ובעדינות במקום 100 µL טוב עם פיפטה רב-ערוצי על צלחת 96-ובכן. במקום כ 5 איים לכל 96. טוב.</li>
	<li>מקם את הצלחת בחממה תרביות רקמה במשך 12 שעות.</li>
	<li>Centrifuge (112 x g) של צלחת 96-ובכן ולהסיר המדיום תרבות.</li>
	<li>לדלל כימיקלים סביבתיים במדיום תרבות איונים. להוסיף 100 µL של כל אחד מדלל כימי לתוך בארות נפרדים של הצלחת. Resuspend איים על כל היטב, תקופת דגירה של 12 שעות ב 37 מעלות צלזיוס (הריכוז משתנה לחומרים סביבתיים שונים).</li>
</ol>7. ROS מכתים ומדידה
<ol><li>לאחר הטיפול איונים, לשטוף עם PBS 1 x (200 µL עבור כל 96-ובכן). הערה: ריכוז הכימיקלים הוא כדלקמן: AFB1: 3 מיקרומטר, מסוג אטרזין: 100 מיקרומטר, BaP: 10 מיקרומטר, BPA: 100 מיקרומטר, β-אסטרוגן, PCB126: 10 מיקרומטר, Nonylphenol ו BPA: 100 מיקרומטר.</li>
	<li>השתמש N-אצטיל ציסטאין (NAC) כ נוגד חמצון כדי להרוות ROS. להוסיף 5 מ מ של NAC מדלל כימיות הנוצרות על-ידי ROS, תקופת דגירה של 12 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>Centrifuge את הצלחת 96-ובכן ב g 112 x, דגירה עם 5 מיקרומטר פתרון של בדיקה פלורסנט (H2-DCFH-DA מומס RPMI מדיה) ב 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.</li>
	<li>לשטוף את התאים איון שטופלו 3 פעמים עם PBS ולמדוד את זריחה עם קורא microplate-488 ננומטר. הערה: ההצטברות של DCF בתאים יכול להימדד על-ידי עלייה בזריחה ב- 530 ננומטר כאשר המדגם הוא נרגש-488 ננומטר.</li>
	<li>מבצע אינסולין הגלוקוז-גירוי הפרשת (GSIS) assay9 xenobiotic בתדר ROS מטופלים איונים ושל לא מטופל כדי למדוד את ההשפעות xenobiotic על תפקיד פיזיולוגי באיי לנגרהנס.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Maruthur, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+prevalence+of+type+2+diabetes:+increased+incidence+or+improved+survival?.">The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival?.</a> Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).</li><li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance.">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li><li>Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+beta-cell+failure+in+type+2+diabetes+mellitus.">Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus.</a> Exp Diabetes Res. , 703538 (2012).</li><li>Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biomarkers+of+oxidative+stress+in+aquatic+organisms+in+relation+to+toxic+environmental+pollutants.">Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).</li><li>Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+toxicity+in+&#946;-cells:+type+2+diabetes,+good+radicals+gone+bad,+and+the+glutathione+connection.">Glucose toxicity in &#946;-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection.</a> Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).</li><li>Kaneto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+induces+p21+expression+in+pancreatic+islet+cells:+possible+implication+in+beta-cell+dysfunction.">Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction.</a> Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).</li><li>Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+alters+mitochondrial+activation+and+insulin+secretion+in+pancreatic+beta+cells.">Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+palmitate+on+hepatic+insulin+resistance+are+mediated+by+NADPH+Oxidase+3-derived+reactive+oxygen+species+through+JNK+and+p38MAPK+pathways.">The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).</li><li>Efendi&#263;, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreastatin+and+islet+hormone+release.">Pancreastatin and islet hormone release.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).</li><li>Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ah+receptor+and+NF-&#954;B+interactions,+a+potential+mechanism+for+dioxin+toxicity.">Ah receptor and NF-&#954;B interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).</li><li>Cui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pregnane+X+receptor+regulates+the+AhR/Cyp1A1+pathway+and+protects+liver+cells+from+benzo-[&#945;]-pyrene-induced+DNA+damage.">Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[&#945;]-pyrene-induced DNA damage.</a> Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).</li><li>Li, L. A., Wang, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCB126+induces+differential+changes+in+androgen,+cortisol,+and+aldosterone+biosynthesis+in+human+adrenocortical+H295R+cells.">PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells.</a> Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).</li><li>Asahi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+induces+endoplasmic+reticulum+stress-associated+apoptosis+in+mouse+non-parenchymal+hepatocytes.">Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes.</a> Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).</li><li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+pancreatic+islet+isolation.">Murine pancreatic islet isolation.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255 (2007).</li><li>Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelium+in+the+modulation+of+isoflurane-induced+vasodilatation+in+rat+thoracic+aorta.">Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta.</a> British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).</li><li>Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+can+cause+sustained+hyperglycemia+in+C57/BL6J+mice.">Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice.</a> Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).</li><li>Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phencyclidine+analogs+and+precursors:+rotarod+and+lethal+dose+studies+in+the+mouse.">Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).</li><li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination.">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

לצבירת ראיות מציע כי החשיפה לכימיקלים סביבתיים ממלא תפקיד חשוב בהתפתחות של T2DM. ROS ואינטראקציות-induced הוכר כגורם etiological פוטנציאליים, תורם להתפתחות של T2DM. בני אדם חשופים למגוון רחב של כימיקלים xenobiotic, ויש צורך גדול עבור מחקר חדשניים טכניקות לזיהוי ביעילות את הלבלב חשיפה לרעלים, לחקור את המנגנו?...

עולה השכיחות של T2DM הפכו משבר הבריאות העולמי בשנים האחרונות פוזות איום רציני לבריאות הציבור1. גורמים רבים נמצאו להיות מקושר סיבתי הפיתוח של T2DM, ביניהם, חוזרות ממצאים מראים כי נקודה מתכנסת אחת נפוצה עבור גורמים אלה הוא אינדוקציה של סטרס חמצוני, מה שמוביל הדור של ROS מופרז2 , 3.
מגוון רחב של כימיקלים סביבתיים לרבות Pcb, דיוקסינים BaP נמצאה לזירוז סטרס חמצוני, אשר עלול לפגום את תפקוד תאי β בלבלב, להוביל תנגודת לאינסולין ו- T2DM4. למרות הרמה פיזיולוגיים של ROS ממלא תפקיד חשוב בתאיים, חשיפה ROS שחורג הקיבולת של המערכת נוגד חמצון מתבטא הנזק לרקמות/תאים ומוביל מחלות5. תאי β בלבלב אקספרס רמה נמוכה של אנזימים נוגדי חמצון, ולכן הם מטרה רגיש ביותר נזק בתיווך סטרס חמצוני6,7. חשיפה כרונית רמות גבוהות של ROS הוכח לגרום תאי הלבלב מפגינות תפקוד5 וכן לאינסולין בכבד, רקמת שומן8.
המטרה הכוללת של הפרויקט הזה היא לפתח הנועד מבוססת תא כימיקלים המסך שלהם פוטנציאל diabetogenic מבוסס על אינדוקציה שלהם של ROS בתאי הלבלב. הלבלב חסר רעלים מטבוליים, הוא מטרה רגיש הנזק הנגרמת xenobiotic6,7. לכן, על ידי מדידת ישירות את האבחון שנוצר בתאי הלבלב, וזמינותו הזה צריך לספק הערכה ישירה של הפגיעה הנגרמת כימית בלבלב. כדי לפתח שיטה זו, אנחנו מבודדים לנגרהנס עכבר תרבותי של איון מבודד בתנאי התרבות תאים עם כימיקלים, מנוצל הדור ROS כימית-induced כמו המדידה. ההליך זה פשוטה ויעילה בזיהוי בתדר ROS חומרים כימיים איון מבודדים; זה יכול להיות פיתוח נוסף לחקירה על מנגנוני רעילות ספציפיים הלבלב חוץ גופית בתוך.

<table><tbody><tr><td>10&amp;times;Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type 4</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>CLS-4</td><td></td></tr><tr><td>polysucrose/sodium diatrizoate solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>2&amp;rsquo;,7&amp;rsquo;-dichlorofluorescein (DCFH-DA)</td><td>Sigma</td><td>D6883-50MG</td><td></td></tr><tr><td>fluorescence microplate reader&amp;nbsp;</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma</td><td>G8540-25G</td><td></td></tr><tr><td>streptomycin</td><td>GIBCO</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>Rat/Mouse Insulin ELISA Kit</td><td>Millipore</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorval</td><td>Sorval RT7</td><td>for 96-well plate centrifuge</td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>Biotek</td><td>Epoch 2</td><td>for fluorescence reading</td></tr></tbody></table>

a murine pancreatic islet cell-based screening for diabetogenic environmental chemicals

חשיפה לכימיקלים סביבתיים מסוימים של האדם ובעלי חיים נמצאה לגרום נזק תאי של תאי β בלבלב אשר יוביל להתפתחות של סוכרת סוג 2 (T2DM). למרות המנגנונים על הנזק תאי β כימית-induced היה לא ברור, עשוי להיות מורכב, ממצא חוזרות אחד היא כי חומרים אלה זירוז סטרס חמצוני שמוביל הדור של מינים חמצן תגובתי מוגזמת (ROS) לגרום נזק התא β. כדי לזהות פוטנציאל diabetogenic כימיקלים סביבתיים, בודדנו תאי הלבלב איון של עכברים C57BL/6 ואיון בתרבית תאים ב 96-ובכן תא תרבות לוחות; לאחר מכן, התאים איון היו עצומות עם כימיקלים, הדור ROS אותרה על ידי 2', 7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) הפלורסנט. באמצעות שיטה זו, אנו נמצא כי ביספנול A (BPA), Benzo [א] pyrene (BaP) ולאחר polychlorinated biphenyls (PCBs), עלול לגרום לרמות גבוהות של ROS, רומז כי הם פוטנציאלי עלול לגרום נזק תאי איון. שיטה זו צריכה להיות שימושית עבור הקרנת diabetogenic ואינטראקציות. בנוסף, התאים בתרבית איון עשוי גם להיות מותאם לניתוח במבחנה רעילות כימית-induced בתאי הלבלב.

מיקרוסקופ של איון מבודד בריא מוצג באיור 2, שבה יש איים קטנים עגולים או אליפטיים צורה עם מדים יחסית לגודל (למרות אחידות הגודל יכול להשתנות זן זן). חקרנו את הפונקציות הלבלב איון assay במבחנה הבא מאת לבודד את איון והמרצת הפרשת אינסולין בלבלב ע תרבות. <strong class=...

Watch this Scientific Journal Video about A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals at JoVE.com

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

כאן אנו מציגים פרוטוקול בידוד תאי הלבלב איון העכבר לסינון את inductions ROS מאת ואינטראקציות על מנת לזהות פוטנציאל diabetogenic xenobiotic כימיקלים.

הקרנה מבוססת תא מאתר הלבלב איון Diabetogenic כימיקלים סביבתיים

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

a-murine-pancreatic-islet-cell-based-screening-for-diabetogenic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.2K Views.  Hunan Agriculture University. כאן אנו מציגים פרוטוקול בידוד תאי הלבלב איון העכבר לסינון את inductions ROS מאת ואינטראקציות על מנת לזהות פוטנציאל diabetogenic xenobiotic כימיקלים.

Video: A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

Murine Pancreatic Islet Isolation

הלבלב Murine איילט בידוד

Biology

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

Transcriptomic תא בודד ניתוחים של תאים בלבלב האנדוקרינית העכבר

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Developmental Biology

Analysis of Non-Human Primate Pancreatic Islet Oxygen Consumption

The measurement of oxygen consumption in spheroid clusters of cells, such as ex vivo pancreatic islets, has historically been challenging. We demonstrate the measurement of islet oxygen consumption using a 96-well microplate designed for the measurement of oxygen consumption in spheroids. In this assay, spheroid microplates are coated with a cell and tissue adhesive on the day prior to the assay. We utilize a small volume of adhesive solution to encourage islet adherence to only the bottom of the well. On the day of the assay, 15 islets are loaded directly into the base of each well using a technique that ensures optimal positioning of islets and accurate measurement of oxygen consumption. Various aspects of mitochondrial respiration are probed pharmacologically in non-human primate islets, including ATP-dependent respiration, maximal respiration, and proton leak. This method allows for consistent, reproducible results using only a small number of islets per well. It can theoretically be applied to any cultured spheroids of similar size.

This protocol demonstrates the accurate and reproducible measurement of oxygen consumption in non-human primate pancreatic islets. The islet loading techniques and coating of the microplate provide a framework for efficient measurement of respiration in other types of cultured spheroids.

ניתוח של שאינם אנושיים הלבלב של איון צריכת החמצן

The measurement of oxygen consumption in spheroid clusters of cells, such as ex vivo pancreatic islets, has historically been challenging. We demonstrate ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; עכבר דגם של סוכרת מסוג 2: בידוד לבלב וLive- תא 2-פוטון הדמיה של איי שלמים

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Medicine

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Critical challenges for the diabetes research field are to understand the molecular mechanisms that regulate islet &#946;-cell replication and to develop methods for stimulating &#946;-cell regeneration. Herein a high-content screening method to identify and assess the &#946;-cell replication-promoting activity of small molecules is presented.

A-תכולה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלטפורמת Discovery הלבלב איילט β-cell שכפול

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and &#946;-cell failure. Various strategies, including the injection of insulin or the usage of insulin-sensitizing drugs, were pursued to treat T2DM or at least reduce the symptoms. In addition, the application of herbal compounds has attracted increasing attention. Thus, it is necessary to find efficient test systems to identify and characterize insulin-mimetic compounds. Here we developed a modified chick embryo model, which enables testing of synthetic compounds and herbal extracts with insulin-mimetic properties. Using a fluorescence microscopy-based primary screen, which quantifies the translocation of Glucose transporter 4 (Glut4) to the plasma membrane, we were able to identify compounds, mainly herbal extracts, which lead to an increase of intracellular glucose concentrations in adipocytes. However, the efficacy of these substances requires further verification in a living organism. Thus, we used an in-ovo approach to identify their blood glucose-reducing properties. The approval by an ethics committee is not needed since the use of chicken embryos during the first two-thirds of embryonic development is not considered an animal experiment. Here, the application of this model is described in detail.

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

In this study, we describe an in-ovo system as a promising tool to test insulin-mimetic compounds in a living organism. The main advantages include adequate throughput rates and acceptable costs, which enable the identification of phytochemicals with insulin-mimetic properties.

מודל ב Ovo לבדיקת תרכובות מימטי-אינסולין

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

Neuroscience

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

השתלת intraportal של לנגרהנס במודל עכבר

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

שיטה לבידוד עכבר הלבלב איילט וקביעת תאית cAMP

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

פרוטוקול פשוט יעילות גבוהה לבידוד איון הלבלב של עכברים

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

הדמיה של סידן דינמיקה באוכלוסיות משנה של תאים הלבלב איון של העכבר

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

הקרנה מבוססת תא מאתר הלבלב איון Diabetogenic כימיקלים סביבתיים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video