Name: implantation of electrospun vascular grafts with optimized structure in a rat model
Uploaded: 2018-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implantation of Electrospun Vascular Grafts with Optimized Structure in a Rat Model at JoVE.com

עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי פרויקטים NSFC (81522023, 81530059, 91639113, 81772000, 81371699 ו- 81401534).

השימוש של חיות ניסוי שאושרו על-ידי חיה ניסויים אתית הוועדה של שינקאנסן האוניברסיטה, ביצעו תואם המדריך לקבלת טיפול, שימוש של חיות מעבדה.
1. ייצור שתלי Electrospun PCL
הערה: בזאת, טכניקת electrospinning היה מנוצל כדי לבדות שתלי כלי הדם.
<ol><li>להכין PCL פתרונות של 25 wt % ו 10 wt %, על ידי המסת PCL בתערובת של מתנול, כלורופורם, בהתאמה, (יחס נפח של 1:5), בטמפרטורת החדר (RT) במשך 12 שעות.</li>
	<li>לטעון את הפתרון PCL לתוך מזרק זכוכית 10-mL.</li>
	<li>מקם את המזרק עם מחט 21-G.</li>
	<li>מניחים את מוט פלדה אל חלד (2 מ מ בקוטר 25 ס מ אורך) על המכשיר אוסף.</li>
	<li>עבור שתלים סיבי עבה יותר, השתמש PCL הפתרון של 25 wt %, ומרחק עבודה של 17 ס מ מחט לאספן, קצב הזרימה של 8 mL/h, מתח של 11 kV כפרמטרים electrospinning. לשימוש שתלי רזה-סיבים, הפתרון PCL של 10 wt %, ומרחק עבודה של 20 ס מ מחט לאספן, קצב זרימה של 2 מ ל/h, מתח של 18 kV כפרמטרים electrospinning.</li>
	<li>ודא כי השתלים שהושג מוצבים בתוך ואקום למשך הלילה כדי להסיר שאריות הממס. לעקר את כל הכלים לפני ההליך ולשמור על הטכניקה aseptic ברחבי.</li>
	<li>לפני ההשתלה, לחטא את השתלים על ידי אנו ממליצים להם 10 מ"ל של 75% אתנול למשך 30 דקות ואז לחשוף אותם לאור אולטרא סגול לילה.</li>
	<li>מדידות גודל סיבים, נקבוביות: לחשב את הקוטר הממוצע סיבים באמצעות תוכנת ImageJ מבוסס על סריקת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM).</li>
	<li>בדיקות מכניות של פיגומים:<ol>
<li>חותכים פיגומים צינורי למקטעים 3 מ מ אורך בעזרת סכין גילוח. למדוד את העובי של פיגומים באמצעות מיקרומטר.</li>
		<li>למקם פיגומים הכרישים על מכונת בדיקות מתיחה עם עומס קיבולת של 100 ש</li>
		<li>מלחציים פיגומים עם 1 מ"מ הבין-קלאמפ מרחק, למשוך longitudinally בקצב של 10 מ מ/דקה עד קרע. למדוד את חוזק ואת האולטימטיבי התארכות בהפסקה. לחשב את האלסטיות של האזור הליניארי הראשונית (עד 5% זן) של העקומה מתח-זן.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. עכברוש. העורק השרשה מודל
הערה: כל חומרים, כלים המשמשים בניתוח הם סטרילי. במהלך הניתוח, ודא כי המפעיל לובש מסכה גזה וכפפות סטרילי למניעת זיהומים. ודא שטמפרטורת החדר נשמרת ב- 27-30 ° C כדי לשמור על טמפרטורת הגוף בבעלי חיים. פעל לפי ההנחיות IACUC המקומית בנוגע שיכוך כאבים.
<ol><li>השתמש חולדות ספראג Dawley זכר שוקל 240-270 גרם מקבלים שתל של כלי הדם. ודא שהחולדה יש התענה 24 שעות לפני הניתוח. המטרה של חולדות צום של 24 שעות היא ריקה הצואה של המעיים מספיק, ובכך להרחיב האופק של המפעיל.</li>
	<li>לתפוס הצוואר האחורי של החולדה, הראש כלפי מטה, את המחט springe לתוך חלל הבטן הבטן התחתונה. זירוז של עכברוש בשביל הרדמה עם קלוראל-הידרייט (330 מ ג/ק ג) על ידי זריקה בקרום הבטן.</li>
	<li>לאשר ההרדמה נאותה על ידי הבטחת העכברוש הגמיש השרירים ונשימה יציבה. מקם את החולדה תחת המיקרוסקופ ההפעלה במצב פרקדן.</li>
	<li>החל וזלין הוטרינר אופטלמולוגיות משחה על העיניים למניעת יובש תחת הרדמה. לנהל בדיקות דם (UI 100/kg) עם תמיסת מלח פיזיולוגית heparinized פתרון (UI 50/mL) בזריקה וריד הזנב לפני הניתוח.</li>
	<li>לגלח את הפרווה בקיר הבטן הקדמי באמצעות סכין גילוח, לנקות את העור באמצעות יודיפלור תמיסה תמיסת כוהל רפואי.</li>
	<li>לבצע חתך laparotomy קו האמצע עם מספריים כירורגיים להבטיח החתך כ 4-5 ס"מ ו ואז לחשוף את חלל הבטן.</li>
	<li>. משכי, עוטפים את המעיים עם גזה לחלח עם תמיסת מעדיפים.</li>
	<li>לנתח את העורק הראשי בקפידה.</li>
	<li>לזהות, מאתרים ומפסיקים את כל הענפים קטן בעזרת תפרים ניילון monofilament 9-0.</li>
	<li>תהדק את המקטע מבודד (עד 1 ס מ אורך) של אבי העורקים באמצעות שני תופסנים כלי הדם. אבי העורקים יכולים להישאר בחוזקה למשך 20-30 דקות.</li>
	<li>Transect העורק הראשי בין שני תופסנים באמצעות מיקרו-מספריים כדי ליצור את האתרים anastomotic.</li>
	<li>לרוקן את שני הקצוות של אבי העורקים באמצעות פתרון heparinized מלוחים (UI 50/mL) כדי להסיר את שאריות הדם.</li>
	<li>לקלף את adventitia באמצעות מיקרו-מספריים.</li>
	<li>Anastomose השתל ועם הקוטר הפנימי של 2 מ מ 1 ס"מ אורך על העורק הראשי של החולדה עם דפוס התפר של-שמונה בעזרת תפרים ניילון monofilament 9-0.</li>
	<li>ראשית, לבנות ארבע. חיבור בהתאם לרצף של 9, 3, 12, ו 6 o ' שעון עמדות על הצד צינתור, ואז anastomose את הקצוות לחתוך 4 תפרים בין שני תפרים. לאחר שסיים את התפר צינתור, תפר הצד דיסטלי באותה שיטה. הערה: כל תפר נדרש כדי להבטיח שהצד יליד מעט שמוטבע השתל.</li>
	<li>להסיר את המלחציים דיסטלי כדי לאפשר את הדם לזרום לתוך השתל ולאחר מכן להסיר את המלחציים הפרוקסימלית.</li>
	<li>הקש את הקצוות התפר כדי לעצור את הדימום באמצעות כדור צמר גפן סטרילי או ספוג גזה קטנים. הקש על 3 דק ', עד hemostasis.</li>
	<li>להחזיר את המעיים לתוך חלל הבטן.</li>
	<li>לשטוף את חלל הבטן בעזרת תמיסת מלח פיזיולוגית חמימים פתרון גנטמיצין (320 U/mL).</li>
	<li>לתפור לקיר הבטן באמצעות ניילון 3-0 בתפר לשכבת השריר והעור, בהתאמה.</li>
	<li>למקם את החולדה לתוך כלוב נקי ויבש, לשים כרית החימום תחת הכלוב כדי לשמור על טמפרטורת הגוף החי; ואז לחכות החולדה להתאושש מן ההרדמה. לטפל החיה עד זה שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות.</li>
	<li>אחרי זה יחזור להכרה, לשים את החולדה לכלוב יחיד עם מים ואוכל. החל יוד על הפצע כדי למנוע זיהום לאחר הניתוח. להחזיר את החולדה מחברתם של חיות אחרות עד זה יחלים במלואו.</li>
	<li>המתת חסד חולדות בהתאם להנחיות מוסדיים בנקודות זמן מוגדרים מראש.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Coombs, K. E., Leonard, A. T., Rush, M. N., Santistevan, D. A., Hedberg-Dirk, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+effect+of+material+stiffness+on+valvular+interstitial+cell+differentiation.">Isolated effect of material stiffness on valvular interstitial cell differentiation.</a> J Biomed Mater Res A. 105 (1), 51-61 (2017).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sandwich+tubular+scaffold+derived+from+chitosan+for+blood+vessel+tissue+engineering.">A sandwich tubular scaffold derived from chitosan for blood vessel tissue engineering.</a> J Biomed Mater Res A. 77 (2), 277-284 (2006).</li><li>Thottappillil, N., Nair, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffolds+in+vascular+regeneration:+current+status.">Scaffolds in vascular regeneration: current status.</a> Vasc Health Risk Manag. 11, 79-91 (2015).</li><li>Pektok, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+and+healing+characteristics+of+small-diameter+poly+(e-caprolactone)+vascular+grafts+in+the+rat+systemic+arterial+circulation.">Degradation and healing characteristics of small-diameter poly (e-caprolactone) vascular grafts in the rat systemic arterial circulation.</a> Circulation. 118 (24), 2563-2570 (2008).</li><li>Innocente, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paclitaxel-eluting+biodegradable+synthetic+vascular+prostheses:+a+step+towards+reduction+of+neointima+formation?.">Paclitaxel-eluting biodegradable synthetic vascular prostheses: a step towards reduction of neointima formation?.</a> Circulation. 120 (11 Suppl), S37-S45 (2009).</li><li>de Valence, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+bilayered+vascular+grafts+for+surgical+applicability+and+tissue+regeneration.">Advantages of bilayered vascular grafts for surgical applicability and tissue regeneration.</a> Acta Biomater. 8 (11), 3914-3920 (2012).</li><li>Assmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+autologous+in+vivo+recellularization+of+decellularized+aortic+conduits+by+fibronectin+surface+coating.">Acceleration of autologous in vivo recellularization of decellularized aortic conduits by fibronectin surface coating.</a> Biomaterials. 34 (25), 6015-6026 (2013).</li><li>Hasan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+scaffolds+for+tissue+engineering+of+vascular+grafts.">Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts.</a> Acta Biomater. 10 (1), 11-25 (2014).</li><li>Baker, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+to+improve+cell+infiltration+in+composite+fiber-aligned+electrospun+scaffolds+by+the+selective+removal+of+sacrificial+fibers.">The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers.</a> Biomaterials. 29 (15), 2348-2358 (2008).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+macropores+in+electrospun+silk+fibroin+scaffolds+using+sacrificial+PEO-microparticles+to+enhance+cellular+infiltration.">Creation of macropores in electrospun silk fibroin scaffolds using sacrificial PEO-microparticles to enhance cellular infiltration.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (12), 3474-3481 (2013).</li><li>Lee, B. L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+ablation+enhances+cell+infiltration+into+three-dimensional+electrospun+scaffolds.">Femtosecond laser ablation enhances cell infiltration into three-dimensional electrospun scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 8 (7), 2648-2658 (2012).</li><li>Rnjak-Kovacina, J., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+pore+size+of+electrospun+scaffolds.">Increasing the pore size of electrospun scaffolds.</a> Tissue Eng Part B Rev. 17 (5), 365-372 (2011).</li><li>Zhong, S., Zhang, Y., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+large+pores+in+electrospun+nanofibrous+scaffolds+for+cellular+infiltration:+a+review.">Fabrication of large pores in electrospun nanofibrous scaffolds for cellular infiltration: a review.</a> Tissue Eng Part B Rev. 18 (2), 77-87 (2012).</li><li>Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+poly(epsilon-caprolactone)+microfiber+and+multilayer+nanofiber/microfiber+scaffolds:+characterization+of+scaffolds+and+measurement+of+cellular+infiltration.">Electrospun poly(epsilon-caprolactone) microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds: characterization of scaffolds and measurement of cellular infiltration.</a> Biomacromolecules. 7 (10), 2796-2805 (2006).</li><li>Rnjak-Kovacina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+the+porosity+and+pore+size+of+electrospun+synthetic+human+elastin+scaffolds+for+dermal+tissue+engineering.">Tailoring the porosity and pore size of electrospun synthetic human elastin scaffolds for dermal tissue engineering.</a> Biomaterials. 32 (28), 6729-6736 (2011).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+thick+fibers+and+large+pores+of+electrospun+poly(epsilon-caprolactone)+vascular+grafts+on+macrophage+polarization+and+arterial+regeneration.">The effect of thick fibers and large pores of electrospun poly(epsilon-caprolactone) vascular grafts on macrophage polarization and arterial regeneration.</a> Biomaterials. 35 (22), 5700-5710 (2014).</li><li>Hutcheson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+growth+of+extracellular-vesicle-derived+microcalcification+in+atherosclerotic+plaques.">Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques.</a> Nat Mater. 15 (3), 335-343 (2016).</li><li>Tara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-organized+neointima+of+large-pore+poly(L-lactic+acid)+vascular+graft+coated+with+poly(L-lactic-co-epsilon-caprolactone)+prevents+calcific+deposition+compared+to+small-pore+electrospun+poly(L-lactic+acid)+graft+in+a+mouse+aortic+implantation+model.">Well-organized neointima of large-pore poly(L-lactic acid) vascular graft coated with poly(L-lactic-co-epsilon-caprolactone) prevents calcific deposition compared to small-pore electrospun poly(L-lactic acid) graft in a mouse aortic implantation model.</a> Atherosclerosis. 237 (2), 684-691 (2014).</li></ol>

המחברים יש אינטרסים כלכליים לא סותרים.

חדירה לתא הוא קריטי עבור ההתחדשות, שיפוץ של שתל וסקולרית ויוו16. חדירה לתא מוגבל קשורה לעיתים קרובות הנקבוביות קטן יחסית של השתל המעכבים את ההעברה של תאים לתוך הקיר שתל. כדי לטפל הקושי הזה, פיתחנו שיטה שונה להכין electrospun PCL שתלי כלי הדם עם מבנה גדול שם. בפירוט, גודל הנקבוביות ?...

שתלי כלי הדם מחומרים פולימרים סינתטיים מנוצלים נרחב במרפאה לטיפול במחלות לב וכלי דם (CVDs). למרבה הצער, במקרה של השתלים דם בקוטר קטן (D < 6 מ מ) יש מוצרים מוצלחים זמינים עקב נמוך patency מופעלות על ידי מהירות זרימת דם מופחתת, אשר מובילה לעיתים קרובות פקקת, היפרפלזיה intimal, ועוד סיבוכים1.
הנדסת רקמות מספק אסטרטגיית חלופיים כדי להבין patency לטווח ארוך, הומאוסטזיס מבוסס על התחדשות נימי הדם מונחה לגרדום שחזור. בפירוט, השתל וסקולרית, כתבנית תלת מימדי, יכול לספק תמיכה מכנית והדרכה מבניים במהלך לרגנרציה של רקמות עילאיים ועל ההשפעה פונקציות הסלולר, כולל תא אדהזיה, הגירה, התפשטות, ו הפרשת מטריצה חוץ-תאית2. עד עכשיו, פולימרים סינתטיים שונים תאימותם ליישומים בהנדסת רקמות עילאיים. בין אלה פולימרים, poly(ε-caprolactone) (PCL) נחקר באינטנסיביות עקב תא טוב תאימות והשפלה איטי שנעו בין כמה חודשים עד שנתיים3. בעכברוש העורקים מודל4,5,6, שתלי כלי הדם PCL שעובדו על-ידי electrospinning הציג המבנית מעולה, patency, עלייה מתמדת כמו גם תא הפלישה, כורוידאלית ב שתל קיר עד 6 חודשים. עם זאת, רקמות לוואי שיפוץ, כולל רגרסיה של תאים, נימים, הסתיידות, גם נצפו ב timepoints יותר, עד ל-18 חודשי.
Cellularization של כלי הדם השתל היא גורם מפתח בקביעת התחדשות רקמות, ותתמוך7. Electrospinning, כמו טכניקה רב-תכליתי, כבר נרחב מועסקים עבור הכנת שתלי כלי הדם עם מבנה סיבי ננו8. למרבה הצער, המבנה הנקבובית קטן יחסית מובילה לעיתים קרובות לא מספיקות תא בחדירת השתל electrospun כלי דם, אשר מגביל את התחדשות רקמות עוקבות. כדי לפתור בעיה זו, טכניקות שונות נוסו כדי להגדיל את גודל הנקבוביות נקבוביות הכוללת, לרבות המלח/הפולימר שטיפת9,10, שינוי של אספן המנגנון, שלאחר הטיפול על ידי קרינת לייזר11 , ועוד. למעשה, המבנה של שתלי electrospun (כולל סיבים בקוטר גודל הנקבוביות, נקבוביות) קשורה קשר הדוק עיבוד התנאים12,13. במהלך electrospinning, קוטר סיבים ניתן לשלוט בקלות על-ידי שינוי הפרמטרים, כגון הריכוז של פולימר פתרון, קצב הזרימה, מתח, וכו '. 14 , 15, ו. לכן, גודל הנקבוביות ואת נקבוביות שופרו בהתאם.
לאחרונה דיווחנו PCL ששונה electrospun שתל למבנה macroporous (סיבי עם קוטר של 5-7 מיקרומטר, הנקבוביות של 30-40 µm). In vivo השרשה על-ידי החלפת עכברוש. העורק הראו שיעור גבוה של patency, כמו גם התחדשות endothelialization, שריר חלק טוב בגיל 3 חודשים לאחר הניתוח16. וחשוב מכך, אין תופעות לוואי רקמות כולל רגרסיה הסתיידות והתא יכול להיות שנצפו גם לאחר שנה אחת של השרשה.

<table><tbody><tr><td>Poly(&amp;epsilon;-caprolactone) (PCL) pellets (M&lt;sub&gt;n&lt;/sub&gt;=80,000)</td><td>Sigma</td><td>704067</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Tianjin Chemical Reagent Company</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol</td><td>Tianjin Chemical Reagent Company</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Tianjin Chemical Reagent Company</td><td>A1007</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Tianjin Fengchuan Company</td><td>2296</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley rats</td><td>Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal saline</td><td>Hebei Tiancheng Pharmaceutical company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloral hydrate</td><td>Tianjin Ruijinte chemical company</td><td>2223</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium Injection</td><td>Tianjin Biochem Pharmaceutical company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin Sulfate Injection</td><td>Jiangsu Lianshui Pharmaceutical company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-&amp;alpha;-SMA primary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab7817</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-smooth MYH primary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab683</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti-rat elastin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab23748</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-von Willebrand factor primary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab6994</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG (Alexa Fluor 488)</td><td>Invitrogen</td><td>ab150117</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (Alexa Fluor 488)</td><td>Invitrogen</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>5% normal goat serum</td><td>Zhongshan Golden bridge</td><td>ZLI9022</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin and eosin (H&amp;amp;E)</td><td>Beijing leagene biotech</td><td>DH0006</td><td></td></tr><tr><td>Masson&#039;s trichrome</td><td>Beijing leagene biotech</td><td>DC0032</td><td></td></tr><tr><td>Verhoeff-van Gieson (VVG)</td><td>Beijing leagene biotech</td><td>DC0059</td><td></td></tr><tr><td>Von Kossa</td><td>Beijing leagene biotech</td><td>DS0003</td><td></td></tr><tr><td>Surgical sutures needles with thread,3-0 silk</td><td>Shanghai Jinhuan medical supplies company</td><td>G3002b</td><td></td></tr><tr><td>Surgical sutures needles with thread,9-0 silk</td><td>Shanghai Jinhuan medical supplies company</td><td>H901</td><td></td></tr></tbody></table>

implantation of electrospun vascular grafts with optimized structure in a rat model

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפברק macroporous PCL שתל וסקולרית. ומתארות פרוטוקול הערכה באמצעות מודל עכברוש של החלפת העורק הראשי. השתלים כלי הדם electrospun לעיתים קרובות בעלי נקבוביות קטנות יחסית, אשר להגביל חדירה לתא השתלים ומעכבים את ההתחדשות ובניה של הניאו-העורקים. במחקר זה, PCL שתלי כלי הדם עם סיבי עבה יותר (5-6 מיקרומטר), נקבוביות גדולות יותר (~ 30 מיקרומטר) היו מפוברק באמצעות טכניקה לעיבוד ששונה. ביצועים לטווח ארוך של השתל הוערך על ידי ההשרשה במודל חולדה. העורק הראשי. אולטראסאונד הראה כי השתלים נותר פטנט ללא מפרצת או היצרות המתרחשים גם לאחר 12 חודשים של השרשה. Macroporous מבנה משופרת של ingrowth תא וקידם ובכך רקמות מחדש בגיל 3 חודשים. חשוב מכך, לא היה סימן של שיפוץ תופעות לוואי, כגון הסתיידות בתוך הקיר שתל לאחר 12 חודשים. לכן, electrospun PCL שתלי כלי דם עם macroporous ששונה עיבוד החזק פוטנציאל להיות תחליף עורק להשתלה לטווח ארוך.

השתלים PCL היו explanted ב 3 חודשים ל- 12 חודשים וכאב לאחר הניתוח, נותחו על ידי טכניקות היסטולוגית סטנדרטי עבור hematoxylin ואאוזין (H & E), מאסון trichrome, Verhoeff-ואן Gieson (VVG), פון Kossa ו- immunofluorescence מכתים עבור α-SMA, MYH, vWF ואלסטין. היסטולוגית התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ זקוף, immunofluorescence התמונות צו...

Watch this Scientific Journal Video about Implantation of Electrospun Vascular Grafts with Optimized Structure in a Rat Model at JoVE.com

Implantation of Electrospun Vascular Grafts with Optimized Structure in a Rat Model

השרשה שתלי כלי הדם Electrospun עם אופטימיזציה מבנה במודל חולדה

כאן, אנו מציגים שיטה electrospinning ששונה כדי להמציא PCL שתלי כלי הדם עם נקבוביות גדולות וסיבים עבים, לתאר את פרוטוקול כדי להעריך את הביצועים ויוו במודל של עכברים של החלפת העורק הראשי.

Here, we present a protocol to fabricate macroporous PCL vascular graft and describe an evaluation protocol by using a rat model of abdominal aorta ...

implantation-electrospun-vascular-grafts-with-optimized-structure-rat

Research

JoVE Journal

Biology

7.9K Views.  Nankai University. כאן, אנו מציגים שיטה electrospinning ששונה כדי להמציא PCL שתלי כלי הדם עם נקבוביות גדולות וסיבים עבים, לתאר את פרוטוקול כדי להעריך את הביצועים ויוו במודל של עכברים של החלפת העורק הראשי.

Video: Implantation of Electrospun Vascular Grafts with Optimized Structure in a Rat Model

Training a Sophisticated Microsurgical Technique: Interposition of External Jugular Vein Graft in the Common Carotid Artery in Rats

Neointimal hyperplasia is one the primary causes of stenosis in arterialized veins that are of great importance in arterial coronary bypass surgery, in peripheral arterial bypass surgery as well as in arteriovenous fistulas.1-5 The experimental procedure of vein graft interposition in the common carotid artery by using the cuff-technique has been applied in several research projects to examine the aetiology of neointimal hyperplasia and therapeutic options to address it. 6-8 The cuff prevents vessel anastomotic remodeling and induces turbulence within the graft and thereby the development of neointimal hyperplasia.
Using the superior caval vein graft is an established small-animal model for venous arterialization experiment.9-11 This current protocol refers to an established jugular vein graft interposition technique first described by Zou et al., 9 as well as others.12-14 Nevertheless, these cited small animal protocols are complicated.
To simplify the procedure and to minimize the number of experimental animals needed, a detailed operation protocol by video training is presented. This video should help the novice surgeon to learn both the cuff-technique and the vein graft interposition. Hereby, the right external jugular vein was grafted in cuff-technique in the common carotid artery of 21 female Sprague Dawley rats categorized in three equal groups that were sacrificed on day 21, 42 and 84, respectively. Notably, no donor animals were needed, because auto-transplantations were performed. The survival rate was 100 % at the time point of sacrifice. In addition, the graft patency rate was 60 % for the first 10 operated animals and 82 % for the remaining 11 animals. The blood flow at the time of sacrifice was 8&plusmn;3 ml/min. In conclusion, this surgical protocol considerably simplifies, optimizes and standardizes this complicated procedure. It gives novice surgeons easy, step-by-step instruction, explaining possible pitfalls, thereby helping them to gain expertise fast and avoid useless sacrifice of experimental animals.

Neointimal hyperplasia is the primary cause of stenosis in arterialized veins. We propose a new protocol whereby the right external jugular vein is grafted using the cuff technique in the common carotid artery of Sprague Dawley rats. The survival rate was 100 % at the time point of sacrifice.

אימון טכניקה מתוחכמת מייקרו: התערבותם של שתלי וריד צוואר חיצוניים בעורק התרדמה המשותף בחולדות

Neointimal hyperplasia is one the primary causes of stenosis in arterialized veins that are of great importance in arterial coronary bypass surgery, in ...

Medicine

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

השתלת רקמות מהונדסות בלב החולדה

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

טכניקה כירורגית להשתלה של רקמות שתלי כלי דם מהונדסים ולאחר<em&gt; In vivo</em&gt; ניטור

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Bioengineering

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

דור והארכת כלי רקמות מהונדסות במודל עכבר

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.

Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

Athymic עכברוש מודל להערכת הנדסי קדמי צולב גידים שתלי

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. The long-term clinical results showed excellent patency rates, however, with significant incidence of stenosis. To investigate the cellular and molecular mechanisms of vascular neotissue formation and prevent stenosis development in tissue engineered vascular grafts (TEVGs), we developed a mouse model of the graft with approximately 1 mm internal diameter. First, the TEVGs were assembled from biodegradable tubular scaffolds fabricated from a polyglycolic acid nonwoven felt mesh coated with &#949;-caprolactone and L-lactide copolymer. The scaffolds were then placed in a lyophilizer, vacuumed for 24 hr, and stored in a desiccator until cell seeding. Second, bone marrow was collected from donor mice and mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation. Third, approximately one million cells were seeded on a scaffold and incubated O/N. Finally, the seeded scaffolds were then implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. The implanted grafts demonstrated excellent patency (&#62;90%) without evidence of thromboembolic complications or aneurysmal formation. This murine model will aid us in understanding and quantifying the cellular and molecular mechanisms of neotissue formation in the TEVG.

To improve our knowledge of cellular and molecular neotissue formation, a murine model of the TEVG was recently developed. The grafts were implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. This model achieves similar results to those achieved in our clinical investigation, but over a far shortened time-course.

השתלה של וריד נבוב חציצת שתל נחותה בעכבר דגם

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

The Arteriovenous (AV) Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in pathological situations such as cancer, vascularization plays a leading role in disease progression. Consequently, there is a strong need for a standardized and well-characterized in vivo model in order to elucidate the mechanisms of neovascularization and develop different vascularization approaches for tissue engineering and regenerative medicine.
We describe a microsurgical approach for a small animal model for induction of a vascular axis consisting of a vein and artery that are anastomosed to an arteriovenous (AV) loop. The AV loop is transferred to an enclosed implantation chamber to create an isolated microenvironment in vivo, which is connected to the living organism only by means of the vascular axis. Using 3D imaging (MRI, micro-CT) and immunohistology, the growing vasculature can be visualized over time. By implanting different cells, growth factors and matrices, their function in blood vessel network formation can be analyzed without any disturbing influences from the surroundings in a well controllable environment. 
In addition to angiogenesis and antiangiogenesis studies, the AV loop model is also perfectly suited for engineering vascularized tissues. After a certain prevascularization time, the generated tissues can be transplanted into the defect site and microsurgically connected to the local vessels, thereby ensuring immediate blood supply and integration of the engineered tissue. By varying the matrices, cells, growth factors and chamber architecture, it is possible to generate various tissues, which can then be tailored to the individual patient's needs.

The Arteriovenous AV Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

We describe a microsurgical approach for the generation of an arteriovenous (AV) loop as a model for analyzing vascularization in vivo in an isolated and well-characterized environment. This model is not only useful for the investigation of angiogenesis, but is also optimally suited for engineering axially vascularized and transplantable tissues.

Arteriovenous (AV) Loop במודל בעלי חיים קטנים לחקר אנגיוגנזה והנדסת רקמות כלי דם

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant technique with nutritional support. Recently, there have been many attempts at esophageal tissue engineering, but the success rate has been limited due to difficulty in early epithelization in the special environment of peristalsis. Here, we developed an artificial esophagus that can improve the regeneration of the esophageal mucosa and muscle layers through a two-layered tubular scaffold, a mesenchymal stem cell-based bioreactor system, and a bypass feeding technique with modified gastrostomy. The scaffold is made of polyurethane (PU) nanofibers in a cylindrical shape with a three-dimensional (3D) printed polycaprolactone strand wrapped around the outer wall. Prior to transplantation, human-derived mesenchymal stem cells were seeded into the lumen of the scaffold, and bioreactor cultivation was performed to enhance cellular reactivity. We improved the graft survival rate by applying surgical anastomosis and covering the implanted prosthesis with a thyroid gland flap, followed by temporary nonoral gastrostomy feeding. These grafts were able to recapitulate the findings of initial epithelialization and muscle regeneration around the implanted sites, as demonstrated by histological analysis. In addition, increased elastin fibers and neovascularization were observed in the periphery of the graft. Therefore, this model presents a potential new technique for circumferential esophageal reconstruction.

Esophageal reconstruction is a challenging procedure, and development of a tissue-engineered esophagus that enables regeneration of esophageal mucosa and muscle and that can be implanted as an artificial graft is necessary. Here, we present our protocol to generate an artificial esophagus, including scaffold manufacturing, bioreactor cultivation, and various surgical techniques.

רקמת הנדסה לשיקום שחזור הוושט בחולדות

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

וריד ביון דגם: מודל מתאים ללמוד patency מעקף

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

Implantation of Tissue-Engineered Vascular Graft in Mouse Carotid Artery via Cuff Technique

The development of small-diameter vascular grafts has been a global endeavor, with numerous research groups contributing to this field. Animal experimentation plays a pivotal role in assessing the efficacy and safety of vascular grafts, particularly in the absence of clinical applications. Compared to alternative animal models, the mouse implantation model offers several advantages, including a well-defined genetic background, a mature method for disease model construction, and a straightforward surgical procedure. Based on these advantages, the present study devised a simple cuff technique for the implantation of tissue-engineered vascular grafts in the mouse carotid artery. This technique began with the fabrication of polycaprolactone (PCL) small-diameter vascular grafts via electrostatic spinning, followed by the seeding of macrophages onto the grafts through perfusion adsorption. Subsequently,&#160;the cellularized tissue-engineered vascular grafts were transplanted into the mouse carotid artery using the cuff technique to evaluate patency and regenerative capability. After 30 days of in vivo implantation, vascular patency was found to be satisfactory, with evidence of neo-tissue regeneration and the formation of an endothelial layer within the lumen of the grafts. All data were analyzed using statistical and graphing software. This study successfully established a mouse carotid artery implantation model that can be used to explore the cellular sources of vascular regeneration and the mechanisms of action of active substances. Furthermore, it provides theoretical support for the development of novel small-diameter vascular grafts.

Here, a protocol is presented for the implantation of a tissue-engineered vascular graft into the mouse carotid artery using the cuff technique, providing a suitable animal model for investigating vascular tissue regeneration mechanisms.

השרשה שתלי כלי הדם Electrospun עם אופטימיזציה מבנה במודל חולדה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video