Name: isolation of primary human decidual cells from the fetal membranes of term placentae
Uploaded: 2018-04-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae at JoVE.com

המחברים רוצה להודות התורמים, את BioBank RCWIH, ואת ביה ח הר סיני/UHN המחלקה למיילדות גינקולוגיה עבור דגימות האנושי השתמשו במחקר זה. ברצוננו להודות לחברים של המעבדה בורית, במיוחד ד ר קרוליין דאנק עזרה עם פיתוח השיטה. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן ברוכים הבאים בורוז (גרנט #1013759).

Placentae נאספים מהסמסטר בריא, לא בנשים העבודה שעברו קיסרי אלקטיבי. איסוף, עיבוד, חד פעמית של דגימות האדם לדבוק הקווים המנחים של הלוח הר סיני החולים אתיקה. בכתב מתקבל של כל מטופל. מחקר זה אושרה על ידי מועצת המנהלים של אתיקה מחקר בבית החולים הר סיני.
1. תכשירים
הערה: כל השלבים להתבצע תחת ברדס fume, כל ציוד כירורגי חייב להיות מעוקר דרך החיטוי לפני השמה בשכונה fume. כל חומר אחר (בקבוקים, צינורות 50 מ ל, וכו ') חייב להיות מעוקר עם 70% אתנול פתרון. תמיד ללבוש ציוד מגן אישי בכל עת בעת עבודה עם פסולת ותברואה (חלוק, כפפות, שיער ארוך אסוף, וכו ').
<ol><li>
פתרון עיכול אנזימטי (הפתרון הסופי: 200 מ ל)
	<ol>
<li>פיפטה 180 מ של HBSS-/ - לתוך גביע 500 מ"ל, להוסיף מגנט מלהיב סטרילי ומניחים על ערבוב צלחת בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>שוקל ולהוסיף את הפעולות הבאות לפתרון של HBSS-/-לאט ברצף: 20 מ ל FBS, 400 מ"ג Collagenase 2 ([הסופי] = 2 מ"ג/מ"ל), 20 מ ג מעכבי טריפסין שעועית סויה ([סופי] = 0.1 מ"ג/מ"ל), 30 מ"ג DNase 1 ([הסופי] = 0.15 מ"ג/מ"ל), ו- 200 מ"ג BSA ([סופי] = 1 מ"ג/מ"ל)</li>
		<li>הגדר את ערבוב במהירות בינונית, ולאפשר את התערובת ומערבבים למשך 10-20 דקות (כיסוי עם סרט נייר כסף או פרפין פח תוך כדי ערבוב).</li>
		<li>שופכים את הפתרון מעורב לתוך בקבוק זכוכית 250 מ ל באמצעות משפך פלסטיק ולמקם בשכונה fume.</li>
		<li>עוברים את הפתרון באמצעות יחידת סינון העליון פלסטיק (0.22 μm ממברנה מסנן, 500 מ"ל), aliquot 20 מ"ל לתוך צינורות 50 מ ל (סה כ 10 צינורות), חנות ב-20 ° C עד השימוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RPMI 1640 מדיה (2% שטיפה פתרון ו- 10% צמיחה מלאה בינוני)
	<ol>
<li>לשלב RPMI 1640 FBS בבקבוק זכוכית בשכונה fume.</li>
		<li>2% FBS פתרון, לשלב 490 מ של RPMI 1640, 10 מ ל FBS.</li>
		<li>10% FBS הפתרון, לשלב 450 mL RPMI 1640 ו- 50 מ ל FBS.</li>
		<li>פיפטה 500 μL של normocin לתוך בקבוק הזכוכית 500 מ"ל מהשלב הקודם המכיל RPMI ומדיה FBS (50 מ"ג/מ"ל מניות, 0.05 מ"ג/מ"ל ריכוז בעבודה).</li>
		<li>להעביר מדיה דרך μm ממברנה מסנן 0.22 בחנות בבקבוק זכוכית 500 מ"ל ב 4 ° C עד השימוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>30 דקות לפני הפעלת הניסוי, מקום aliquot של 20 מ"ל של קפוא עיכול אנזימטי פתרון באמבט חרוז 37 ° C, למקם את 2% FBS ואמצעי התקשורת FBS RPMI 1640 10% באמבט חרוז 37 ° C, להפעיל את האמבט במים נדנדה והגדר 37 ° C , דור 2, והינו ממוקם צנטריפוגה מבוקרת טמפרטורה עד 4 ° C.</li>
</ol>2. אוסף של רקמת Decidual מן המונח היפרדות הקרומים
<ol><li>למקם בקבוקים עם HBSS + +, HBSS-/-חמישה צינורות 50 מ ל במעמד מתחת למכסה המנוע fume. פיפטה 25 מ של HBSS + / + צינור אחד.</li>
	<li>
באמצעות הידיים בכפפה, להוציא את השליה המונח מהגורם המכיל המשמש להובלת זה מן התיאטרון חדר הניתוח. מקם את השליה על משטח החתלה (אימהית בצד למעלה) ולהפיץ את הקרומים העובריים בעזרת מלקחיים ומספריים.
	<ol>
<li>שכב רפידות חיתול חופפים על מכסה המנוע fume.</li>
		<li>השתמש חיתול נפרד כדי להעיף את השליה אז הצד האימהי הוא הפנים למעלה.</li>
		<li>למצוא נקודת של קרום קרע ולבצע חתכים כדי לאפשר את הממברנה כדי לגולל ושכבה פרקדן על פני השטח fumehood. הערה: לאחר הקרום שהוחזר מן השליה, רותמי יהיה עם הפנים למעלה נח על השכבה chorion, עם השכבה השפיר מאחור.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בזהירות באמצעות המגרד של תא פלסטיק, לגרד את הרקמה decidual chorion ואת המקום לשפופרת 50 מ ל המכיל 25 מ ל HBSS + / +.</li>
	<li>לגרד את הקרום עם לחץ מתון. אל תחיל מדי לחץ כמו זה עלול לגרום זיהום chorion. לאסוף קרישי דם קטנים כמו גם, אלה מכילים מספר תאים decidual. התראה: לאחר אוסף decidual, השליה חייב להיות ארוז בתוך סל פלסטיק חומרים מסוכנים, קפוא במקפיא-20 ° C לפני סילוק מתאים (לפי הכללים מוסדית). רפידות חיתול מדם חייב להיות עטוף בשקית ניילון חותם חזק והשמדתי בתוך קופסת הבטיחות הביולוגי.</li>
</ol>3. שטיפת, אנזימטי עיכול של הרקמה Decidual
<ol><li>לשטוף את רקמות שנאספו על ידי בעדינות רועד הצינור 50 מ ל בעבודת יד ולהעביר אותו דרך מסננת מתכת (250 μm, רשת שינוי גודל 60) 250 μm מנוחה מעל מיכל הדגימה סטרילי (שתן).</li>
	<li>חזור על לשטוף את פעמיים עם HBSS + / + פעמיים עם HBSS-/ - צינורות טריים עבור כל כביסה. (סופי שוטף עם HBSS-/-מאפשר הסרת סידן ומגנזיום נוכח HBSS + +, אשר יפריע אחרת תהליך עיכול אנזימטי הבא). שימו לב. במהלך השלבים כביסה, זיהום רקמות chorion יהיה כפי הרקמה decidual הוא אור ורוד בצבע הוא אמורפי, בזמן chorion הלבן, דחוס וצמיגי. לכן, זיהום chorion ניתן להסירו בקלות עם מלקחיים.</li>
	<li>לחלופין, אם הרקמה decidual עבה, להעביר אותו צלחת פטרי בקוטר 10 ס מ סטרילי והמשך מינצ של הרקמה עם שני אזמלים מנוגדות בצלחת.</li>
	<li>
למקם את הרקמה שטף סטרילי 50 מ ל שפופרת המכילה 100 מ ג של רקמות/mL של פתרון עיכול אנזימטי (ראו הכנות).
	<ol>
<li>כנקודת התייחסות, לוודא הרמה של רקמת decidual יגיע הסימן 5-10 מ"ל ברכבת התחתית 50 מ.</li>
		<li>השתמש בערך 20 מ"ל של פתרון עיכול אנזימטי (הוכן בשלב 1.1) לעכל את רותמי הכולל שנאסף קרום עוברי כל. המונח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לסגור את הפקק של הצינור עם הסרט פרפין (לאטום את הצינור בחוזקה, לעטוף פרפין הסרט סביב פקקי העליון של הצינור) תחת התרבות הוד, דגירה רקמת decidual ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות באמבט מים חזק (145 סל ד דור 2).</li>
	<li>לאחר דגירה, להסיר את הסרט פרפין לעקר את פני השטח של הצינור המכיל רקמות מתעכל עם 70% אתנול, מתחת למכסה המנוע fume. לנער את הצינור בקצרה בעבודת יד.</li>
	<li>לאסוף תא ההשעיה דרך מסננת מתכת (250 μm, רשת שינוי גודל 60) לתוך מיכל הדגימה סטרילי חדש. לדלל עם אמצעי אחסון שווה (20 מ ל) של RPMI + 10% FBS המכיל 0.1% normocin כדי לעצור את התגובה אנזימטיות. המשך ישירות לשלב צנטריפוגה 4.1.</li>
	<li>במידת הצורך, למקם את הרקמה מעוכל הנותרים בחזרה לתוך צינור 50 מ עם 20 מ של עיכול אנזימטי טריים פתרון וחזור על מערכת העיכול (20 דקות, 37 ° C, רועד אמבט מים).</li>
	<li>אם עיכול השני הוא הכרחי, במקום ברכבת התחתית הראשונה עם תא השעיה על קרח (כיסוי עם סרט פרפין לשמור סטרילי). חזור על שלבים 3.5-3.6 ולשלב את המתלים שני תאים.</li>
</ol>4. יצירת השעיה תא בודד
<ol><li>Centrifuge התליה תא (420 גרם, 4 ° C, 11 דקות).</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend התאים 40 מ"ל של RPMI + 2% FBS המכיל 0.1% normocin ("מאגר שטיפת"). הערה: תא גלולה להיות רפוי, כמו ג'לי עקב זיהום תאי הדם האדומים, תשאף תגובת שיקוע בזהירות. הסרה של השלב העליון עם פיפטה ידני ייתכן שתידרש.</li>
	<li>חזור על צנטריפוגה-420 גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 11 דקות.</li>
	<li>בזהירות להסיר את תגובת שיקוע (כאמור הערה שלב 4.2) ו resuspend בגדר תא ב 5 מ של שטיפת מאגר ולהוסיף 35 מ של מאגר פירוק כדוריות דם אדומות בצינור אותו. הערה: אם בגדר גדולים או מדמם מאוד, זה ניתן לחלק את שני צינורות עבור השלב פירוק כדוריות דם אדומות על-ידי הוספת 10 מ"ל של מאגר לשטוף ואת חלוקת באותה מידה שני צינורות ואז הוספת 35 מ של מאגר פירוק כדוריות דם אדומות כל שפופרת.</li>
	<li>דגירה על קרח במשך 20 דקות בקצרה מערבולת צינור בתחילתה ואת בסוף הדגירה כדי lyse כדוריות דם אדומות.</li>
	<li>צנטריפוגה-420 g עבור 11 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>. בזהירות, להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב- 40 מ של מאגר לשטוף.</li>
	<li>עוברים את התאים μm 70 ניילון מסנן כדי להסיר תאים גושים.</li>
	<li>צנטריפוגה-420 גרם עבור 11 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של מדיום מלאה (RPMI 10% + FBS המכיל 0.1% normocin).</li>
	<li>
לספור תאים באמצעות trypan צבען כחול-הדרה hemocytometer ההליך כמפורט להלן:
	<ol>
<li>מתחת למכסה המנוע תרבות בעדינות פיפטה תא ההשעיה לאורך 3 x כדי לערבב ביסודיות לפני שילוב עם trypan blue. ב- mL 1.5 שפופרת להכין תא ההשעיה, מדולל 1:2 (לשלב, 20 μL של פתרון trypan blue) וμl 20 של השעיה תא decidual. מערבבים בזהירות trypan blue-תא פתרון על-ידי pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים (פתרון זה אינו סטרילי).</li>
		<li>מניחים את hemocytometer על השלב של המיקרוסקופ עם זכוכית coverslip על העליונה. הערה: Hemocytometer היא מיקרוסקופ שקופית עם רשתות עליו לתת תשעה ריבועים גדולים מחולק לשלושה קווים. כל ריבוע גדול יש אזור של 1 מ מ2, העומק של נוזל בבית הבליעה 0.1 מ מ. לכן, שאמצעי האחסון של נוזל יכול למלא כל ריבוע גדול 1 מ"מ * 1 מ"מ * 0.1 מ"מ = 0.1 מ"מ3= 10 מ ל-4 .</li>
		<li>לאט לאט להוסיף 10 μL של תערובת trypan blue-תא לתוך החריץ של hemocytometer, המאפשר נימיות לפזר את תערובת תא מעל השקופית כולה (לעצור לפני תערובת ממלא טוב).</li>
		<li>הצג את התאים במיקרוסקופ (ב 10 X הגדלה), לספור את כל התאים לבן/ירוק השוללים trypan blue (אלה הם התאים קיימא) ארבע המשבצות החיצוניות גדול של hemocytometer. בעת ספירת תאים יגעו בשורה, לספור רק את אותו מגע בצד ימין ואת השורות העליונות, אך לא כאלה נוגע לימין ואת התחתון קווים. לא לספור תאים כחול כהה; צבע כחול מציין כי התא מת כפי trypan blue צבען יכול בקלות לחדור דרך קרום פלזמה לתוך הציטופלסמה.</li>
		<li>כדי לחשב את מספר התאים קיימא ב 1 מ"ל של התא השעיה (X): <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57443/57443eq1v2.jpg"> 2 = גורם לדילול 10,000 = פקטור המרה (1 מ"ל = 1 ס מ3 = 10, 000 * 0.1 מ מ3)</li>
	</ol>
</li>
	<li>לדלל decidual לתאים ריכוז סופי רצוי RPMI + 10% FBS (מדיום הגידול). הערה: עבור ציפוי תרביות רקמה, פיפטה 2 * 106 תאים/היטב לתוך צלחת פלסטיק 6-ובכן, 10 * 106 תאים לתוך צלחת פלסטיק 10 ס מ או 75,000 לתאים coverslip זכוכית.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brosens, N., Hayashi, N., White, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+receptor+regulates+decidual+prolactin+expression+in+differentiating+human+endometrial+stromal+cells.">Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells.</a> Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).</li><li>Bell, S. C., D'Arcangues, C., Frase, I. S., Newton, J. R., Odlind, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Decidualization and relevance to menstruation. , 187-212 (1990).</li><li>Kariya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+inhibits+in+vitro+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells.">Interleukin-1 inhibits in vitro decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 73, 1170-1174 (1991).</li><li>Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+11+advances+progesterone-induced+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells.">Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Molecular and Human Reproduction. 8, 636-643 (2002).</li><li>Wu, W. -. X., Brooks, J., Glasier, A. F., McNeilly, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+decidualization+and+prolactin+mRNA+and+production+at+different+stages+of+human+pregnancy.">The relationship between decidualization and prolactin mRNA and production at different stages of human pregnancy.</a> Society for Endocrinology. 14, 255-261 (1995).</li><li>Bell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+secretion+of+protein+by+the+endometrium+and+decidua.">Synthesis and secretion of protein by the endometrium and decidua.</a> Implantation: Biology and Clinical Aspects. , 95-118 (1988).</li><li>Croy, B. A., Chantakru, S., Esadeg, S., Ashkar, A. A., Wei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decidual+natural+killer+cells:+key+regulators+of+placental+development.">Decidual natural killer cells: key regulators of placental development.</a> Journal of Reproductive Immunology. 57, 151-168 (2002).</li><li>Smarason, A. K., Gunnarsson, A., Alfredsson, J. H., Valdimarsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytosis+and+monocytic+infiltration+of+decidua+in+early+pregnancy.">Monocytosis and monocytic infiltration of decidua in early pregnancy.</a> Journal of Clinical and Laboratory Immunology. 21, 1-5 (1986).</li><li>Daiter, E., Pampfer, S., Yeung, Y. G., Barad, D., Stanley, E. R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+colony-+stimulating+factor-1+in+the+human+uterus+and+placenta.">Expression of colony- stimulating factor-1 in the human uterus and placenta.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 74, 850-858 (1992).</li><li>Casey, M. L., Cox, S. M., Beutler, B., Milewich, L., MacDonald, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cachectin/tumor+necrosis+factor-alpha+formation+in+human+decidua.+Potential+role+of+cytokines+in+infection-induced+preterm+labor.">Cachectin/tumor necrosis factor-alpha formation in human decidua. Potential role of cytokines in infection-induced preterm labor.</a> Journal of Clinical Investigation. 83, 430-436 (1989).</li><li>Lala, P. K., Kennedy, T. G., Parhar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+lymphocyte+alloreactivity+by+early+gestational+human+decidua.+II.+Characterization+of+the+suppressor+mechanisms.">Suppression of lymphocyte alloreactivity by early gestational human decidua. II. Characterization of the suppressor mechanisms.</a> Cellular Immunology. 127, 368-381 (1988).</li><li>Shynlova, O., Nedd-Roderique, T., Li, Y., Dorogin, A., Nguyen, T., Lye, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infiltration+of+myeloid+cells+into+decidua+is+a+critical+early+event+in+the+labour+cascade+and+post-partum+uterine+remodelling.">Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17, 311-324 (2013).</li><li>Osman, I., Young, A., Ledingham, M. A., Thomson, A. J., Jordan, F., Greer, I. A., Norman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+density+and+pro-inflammatory+cytokine+expression+in+human+fetal+membranes,+decidua,+cervix+and+myometrium+before+and+during+labour+at+term.">Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term.</a> Molecular Human Reproduction. 9, 41-45 (2003).</li><li>Farine, T., Lye, S. J., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+maternal+leukocytes+are+activated+in+response+to+cytokines+secreted+by+uterine+tissues+of+pregnant+women.">Peripheral maternal leukocytes are activated in response to cytokines secreted by uterine tissues of pregnant women.</a> Journal of Cellular and Molecular Immunology. 14, 635-638 (2017).</li><li>Hamilton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+infiltrate+the+human+and+rat+decidua+during+term+and+preterm+labor:+evidence+that+decidual+inflammation+precedes+labor.">Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor.</a> Biology of Reproduction. 86, 39 (2011).</li><li>Casey, M. L., Cox, S. M., Word, A., Macdonald, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+and+infection-induced+preterm+labour.">Cytokines and infection-induced preterm labour.</a> Reprodution Fertility and Development. 2, 499-510 (1990).</li><li>Yellon, S. M., Mackler, A. M., Kirby, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+leukocyte+traffic+and+activation+in+parturition.">The role of leukocyte traffic and activation in parturition.</a> Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 10, 323-338 (2003).</li><li>Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. S., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cells+in+term+and+preterm+labor.">Immune cells in term and preterm labor.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 11, 571-581 (2014).</li><li>Xu, Y., Plazyo, O., Romero, R., Hassan, S. S., Gomez-Lopez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+leukocytes+from+the+human+maternal-fetal+interface.">Isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface.</a> Journal of Visualized Experiments. 99, (2015).</li><li>Trundley, T., Gardner, L., Northfield, J., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+isolation+of+cells+from+the+human+fetal-maternal+interface.">Methods for isolation of cells from the human fetal-maternal interface.</a> Methods in Molecular Medicine. 122, 109-122 (2006).</li><li>Jividen, K., Movassagh, M. J., Jazaeri, A., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+methods+for+establishing+primary+human+endometrial+stromal+cells+from+hysterectomy+specimens.">Two methods for establishing primary human endometrial stromal cells from hysterectomy specimens.</a> Journal of Visualized experiments. 87, (2014).</li><li>Pelekanos, R. A., Sardesai, V. S., Futrega, K., Lott, W. B., Kuhn, M., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+mesenchymal+stem/stromal+cells+derived+from+human+placenta+tissue.">Isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells derived from human placenta tissue.</a> Journal of Visualized experiments. 112, (2016).</li><li>De Clercq, K., Hennes, A., Vrien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+endometrial+epithelial+and+stromal+cells+for+in+vitro+decidualization.">Isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization.</a> Journal of Visualized Experiments. 121, (2017).</li><li>Zhang, J., Shynlova, O., Sabras, S., Bang, A., Briollais, L., Lye, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+and+activation+status+of+maternal+and+peripheral+blood+leukocytes+during+pregnancy+and+labour,+both+term+and+preterm.">Immunophenotyping and activation status of maternal and peripheral blood leukocytes during pregnancy and labour, both term and preterm.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10, 2386-2402 (2017).</li></ol>

המחברים אין לחשוף

הפרוטוקול המתואר כאן מדגים את העלות ואת הזמן שיטה יעילה עבור בידוד תאים decidual הראשית שנאסף בקרום עוברי של המונח האנושיות placentae כי הוא מאוד נגיש וברור. ההצלחה של פרוטוקול זה תלויה בשני גורמים קריטיים, (1) יעילות של גירוד decidual מהשכבה chorion בקרום עוברי וטיפול (2) שבה התאים decidual מטופלות לאורך כל הפר...

רירית הרחם, אחד הפעילים ביותר למבוגרים נקבה ברקמות, עובר שיפוץ דרמטי בכל מחזור הוסת בתגובה לגירוי על ידי השחלה הורמונים, אסטרוגן (E2) ופרוגסטרון (P4). רותמי, המכונה גם רירית הרחם בהריון, היא רקמה הרבייה חשובה ביותר שנוצר עד לסוף השלב postovulatory כתוצאה מונחה P4 בידול בעקבות השלב proliferative E2-הדומיננטי. תאים decidual אחראים הפרשת ההורמונים גורמים הבלסטוציסט מוצלחת השרשה ועל פיתוח של הממשק עם רחם-היפרדות לשמירה על סובלנות אימהי להשתלת העובר.
Decidualization נדרש השרשת ובניה עוקבות של העורקים ספירלה decidual. תאי סטרומה רירית הרחם עוברים decidualization, תחת השליטה של P4, מחנה, במהלך שלב luteal מאוחר של המחזור החודשי1. תהליך זה הוא יזם סביב כלי הדם מתפשט ברחבי stroma, רומז תפקידה להערכת ואבו ליקוציט סחר רגולציה. זה שינוי הסלולר מאופיין של מורפולוגיה מעגלית, גודל הגרעין גדל והרחבה של תוך-פלזמית קשה ו גולג'י2. Decidualized תאי סטרומה הם מסוגלים לייצר paracrine גורמים התומכים הבלסטוציסט השרשה, המאופיינת על ידי הפרשת הורמונים (קרי פרולקטין) רבים, גורמי גדילה אנגיוגנזה, אינסולין גורם גדילה מחייב חלבון-1 (IGFBP-1), פרוסטגלנדין (עמוד) E (ממריץ של מחנה תאיים), ציטוקינים, מטריצה חוץ-תאית רכיבים וחומרים מזינים חיוניים עבור היפרדות השרשה ופיתוח3,4,5,6 .
האוכלוסייה תא decidual לא מורכבת אך ורק תאי סטרומה decidualized אבל מכיל גם אוכלוסיות גדולות, הריון ספציפי ליקוציט decidual. Decidualization כרוך קרדיוגני מקומי חולף זרם של תאים הטבעיים (NK) רוצח, תאי-T, תאים דנדריטי macrophages. Subpopulation ליקוציט הגדול הוא תאי NK הרחם, הכוללת כ- 50-70% של כל לויקוציטים אימהי שחדר רותמי אשר הם מקור של ציטוקינים וגורמים האנגיוגנזה אשר עשויים לסייע בתהליך decidualization, לודיג מספר לאורך כל ההריון7. מקרופאגים, להיות subpopulation השנייה בגודלה של תאים חיסוניים, נמצאות סביב האתר השרשה ולהגדיל במהלך הריון8. הם מקור של ציטוקינים, צמיחה גורמים כגון המושבה מגרה פקטור (CSF-1)9, הגידול נקרוזה מקדם α (TNFα)10 ופרוסטגלנדין (עמוד) E11.
לאורך כל ההריון, לפני הלידה המונח, רותמי היא המקור העיקרי של ציטוקינים ו נוגדנים אחראית ליקוציט היקפיים אימהי הפעלה והעברה עוקבות לרקמות הרחם ליזום עבודה. מחקרים שנעשו בבעלי חיים הראה כי ציטוקינים פרו-דלקתיים רבים הם למעלה מוסדר ב רותמי העכבר במהלך העבודה, כגון TNF-a, IL-6, IL-12, ו- IL-1b12. ב האדם רותמי, ציטוקינים פרו דלקתיים IL-1b, IL-6 ו- IL-8 (הגדולות chemoattractant נויטרופילים) התערוכה ביטוי גבוה יותר במהלך העבודה לעומת לא העבודה13. אלו ומופרש ציטוקינים תוצאה הפעלת ואת זרם של לויקוציטים אל רקמות decidual14; מקרופאג decidual, נויטרופילים בחדירת שני האדם ואת עכברוש ביבוא במהלך תקופת העבודה, עם חדירת decidual שקדמו myometrial 4-fold רבתי, המציינת את מפל של הפעלת בין רקמות הרחם שני סמוכים זה 15. אלה שחדר לויקוציטים לייצר PGs מסוגל להפעיל התכווצויות סינכרונית של ה myometrium16, מטריקס metalloproteinases (MMPs) ליזום ממברנה לקרע17,18, כמו גם ציטוקינים פרו-דלקתיים כדי להגביר את תהליך הפעלת הרחם ('סערת ציטוקינים').
בשל תפקידים חשובים רבים של תאים decidual, כמו משחק תפקיד קריטי בתהליך ההשתלה, שמירה על רגישות אימהית-עוברית ההיריון המוקדמים, השתתפות ההפעלה של העבודה-מונח הלקויות השונות יכול להיווצר במהלך הריון. למשל, בעיות פוריות (1) בשל השרשה חוזרים ונשנים כישלון ואובדן הריון חוזרים ונשנים יכול לנבוע כשל של התבגרות decidual; (2) הגבלת גדילה תוך רחמי (IUGR), רעלת עקב פיתוח לקוי, חוסר תפקוד של רותמי/השליה או טרנספורמציה וסקולרית פרוץ בצומת decidual-myometrial; כמו גם לידה לידה מוקדמת (3) אשר יכול לנבוע הפעלה decidual מוקדמת.
לנוכח הפרעות עיקריים אלה, יחד עם המגבלות מוסרי ומעשי של האדם ויוו מחקרים, הקמת שורות תאים decidual אנושיים העיקרי הוא חיוני עבור ניתוח במבחנה במטרה הבנה טובה יותר, שיפור ניהול קליני של סיבוכים בהריון. לפיכך, מטרת המחקר שלנו היה לפתח פרוטוקול המאפשר ניתוקה של תאים אנושיים decidual ראשי עם תשואה גבוהה התא ואת הכדאיות שנאסף בקרום עוברי של המונח placentae. בפרוטוקול הנוכחי זה מתאר בבירור זמן cost effective שיטה עבור בידוד של תתי סוגים ספציפיים של decidual תאים אשר לשמש למגוון רחב של ניתוחים במבחנה . אפיון של שפע של פנוטיפ של decidual תת אוכלוסיות המונח, בהשוואה בשליש הראשון או השני הוא חיוני כדי הגדרת התפקידים שלהם לאורך כל ההיריון האנושי.

<table><tbody><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution with calcium and magnesium</td><td>Prepared in facility (LTRI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution without calcium and magnesium</td><td>Prepared in facility (LTRI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diaper pads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Large surgical scissors</td><td>AL Medical</td><td>2018-12-20.</td><td></td></tr><tr><td>Large surgical forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-18</td><td></td></tr><tr><td>Plastic disposable cell scraper (25 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>250 mm (size 60 mesh) metal sieve</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1020-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Disposable scalpel with plastic handle (#21)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td></td></tr><tr><td>Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz)</td><td>VWR</td><td>25384-146</td><td></td></tr><tr><td>Nylon filter (70 mm)</td><td>VWR/Corning</td><td>21008-952</td><td></td></tr><tr><td>Erythrocyte lysis buffer</td><td>Qiagen</td><td>79217</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, 0.4% solution</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Reichert</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media</td><td>Invitrogen</td><td>11835-055</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Wisent</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>Normocin (50mg/ mL)</td><td>Invivogen</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL)</td><td>Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase 2, lyophilized powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>Soy bean trypsin inhibitor, powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9003-250mg</td><td></td></tr><tr><td>DNase powder</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA powder)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Spinning disc confocal microscope - Leica DMI 6000B</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Flow cytometer - Image Stream MK2</td><td>Amnis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IDEA software</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>APC-conjugated Vimentin antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>IC2105A</td><td></td></tr><tr><td>APC H7-conjugated CD45 antibody</td><td>BD</td><td>641399</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated Cytokeratin antibody</td><td>MACs Miltenyi Biotec</td><td>130-080-101</td><td></td></tr><tr><td>PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody</td><td>Novus</td><td>NBP2-47941PCP</td><td></td></tr><tr><td>eFluor450 Fixable Viability dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65-0863-14</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin primary antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7558</td><td></td></tr><tr><td>CD45 primary antibody</td><td>Dako</td><td>M0701</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeratin primary antibody</td><td>Dako</td><td>M0821</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeratin 7 primary antibody</td><td>Dako</td><td>M7018</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>Goat IgG</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2028</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A10036</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 secondary antibody</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-11058</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of primary human decidual cells from the fetal membranes of term placentae

רותמי, המכונה גם רירית הרחם בהריון, היא רקמה הרבייה חשובה ביותר. תאים decidual, המורכב בעיקר תאי סטרומה decidualized של תאים חיסוניים, אחראים הפרשת גורמים הורמונליים דלקתית אשר הם קריטיים עבור הבלסטוציסט מוצלחת השרשה, פיתוח היפרדות לשחק תפקיד חניכה של העבודה לטווח, לידה מוקדמת. רבים הריון לסיבוכים לפליטת של איזון עדין של אוכלוסיות תאים שונים הכוללת רותמי. שינויים ביחס של סוגי תאים decidual מסוים עשוי לשבש תהליכים חיוניים אלה ולהגביר את הסיכון לפתח סיבוכים חמורים של ההריון, כגון כשל השרשה של העובר, פיגור גדילה תוך רחמי, רעלת, צירי. פרוטוקול שמפורטות כאן מדגים את העלות ואת הזמן שיטה יעילה עבור בידודו של התאים decidual העיקרי של האדם שנאסף בקרום עוברי של המונח placentae. על ידי שילוב עיכול אנזימטי ובהפסקות מכני עדין של הרקמה decidual, הושג תשואה גבוהה של תאים decidual עם כמעט ללא זיהום chorion. חשוב, מאופיינים מבודד תאים decidual (תאי סטרומה (55-60%), לויקוציטים (35%), אפיתל (% 1) או trophoblast (0.01%) תאים) ומתוחזק הכדאיות גבוהים (80%) אשר אושר ע י ססגוניות assay cytometry זרימה הדמיה. פרוטוקול זה ספציפית parietalis רותמי, ניתן להתאים בשליש הראשון והשני placentae. מבודדת בעבר, תאים decidual יכול לשמש עבור מספר רב של יישומים ניסיוני במטרה להבין את התפקיד של אוכלוסיות תת תא decidual שונים של סיבוכים בהריון.

כדי לאמת את היעילות ואת הכדאיות של תאים מבודדים, אופיינו על ידי שתי שיטות: flow cytometry, immunocytochemistry (ICC). אוכלוסיות תאים 4 ממוקדים; decidualized תאי סטרומה אותרו על ידי הנוגדן אנטי-vimentin, פן-ליקוציט סמן CD45 שימש כדי לזהות תאים חיסוניים decidual, cytokeratin שימש כדי לזהות תאים אפיתל אנדותל, בסופו ש?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae at JoVE.com

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

פרוטוקול זה מדגים שיטת הבידוד של תאים אנושיים decidual הראשית שנאסף בקרום עוברי של המונח placentae אשר יכול לשמש למגוון רחב של יישומים (קרי immunocytochemistry, cytometry זרימה, וכו ') מכוון ללמוד את התפקיד של אוכלוסיות תאים שונים בסיבוכים בהריון.

בידוד של ראשי תאים Decidual האנושי בקרום עוברי של המונח Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

isolation-primary-human-decidual-cells-from-fetal-membranes-term

Research

JoVE Journal

Medicine

14.1K Views.  University of Toronto. פרוטוקול זה מדגים שיטת הבידוד של תאים אנושיים decidual הראשית שנאסף בקרום עוברי של המונח placentae אשר יכול לשמש למגוון רחב של יישומים (קרי immunocytochemistry, cytometry זרימה, וכו ') מכוון ללמוד את התפקיד של אוכלוסיות תאים שונים בסיבוכים בהריון.

Video: Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend diseases related to pregnancy. In this protocol, human primary villous cytotrophoblasts freshly isolated from placentas through a standard DNase/trypsin protocol are microporated with small interfering RNA (siRNA). This approach provided greater efficiency for siRNA transfection when compared to a lipofection-based method. Transfected cells can subsequently be analyzed by standard Western blot within a time frame of 3-4 days post-transfection. In addition, using cultured primary villous cytotrophoblasts, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) analysis was optimized and performed on extracts from days 1 to 4. The use of these cultured primary cells and the protocol described allow for an evaluation of the implication of specific genes and transcription factors in the process of villous cytotrophoblast differentiation into a syncytiotrophoblast-like cell layer. However, the limited time span allowable in culture precludes the use of methods requiring more time, such as generation of a stable cell population. Therefore testing of this cell population requires highly optimized gene transfer protocols.

This protocol describes a method for efficiently transfecting siRNA in freshly isolated human villous cytotrophoblasts using microporation and identifying DNA-protein complexes in these cells. Transfected cells can be monitored by Western blot and EMSA analyses during the 4-day culture time.

ניתוח Transfection siRNA ו Emsa על Cytotrophoblasts Villous אדם המבודד טרי

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Genetics

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

בידוד הרחבת גזע mesenchymal / תאי סטרומה נגזרו רקמה אנושית שליה

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Developmental Biology

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density centrifugation, media gradient isolation and immunomagnetic purification. As observed in vivo, mononucleated villous cytotrophoblast cells in primary culture differentiate into multinucleated syncytiotrophoblast cells after 72 hr. Compared to normoxia (8% O2), villous cytotrophoblast cells that undergo hypoxia/reoxygenation (0.5% / 8% O2) undergo increased oxidative stress and intrinsic apoptosis, similar to that observed in vivo in pregnancy complications such as preeclampsia, preterm birth, and intrauterine growth restriction. In this context, primary villous trophoblasts cultured under hypoxia/reoxygenation conditions represent a unique experimental system to better understand the mechanisms and signalling pathways that are altered in human placenta and facilitate the search for effective drugs that protect against certain pregnancy disorders. Human villous trophoblasts produce melatonin and express its synthesizing enzymes and receptors. Melatonin has been suggested as a treatment for preeclampsia and intrauterine growth restriction because of its protective antioxidant effects. In the primary villous cytotrophoblast cell model described in this paper, melatonin has no effect on trophoblast cells in normoxic state but restores the redox balance of syncytiotrophoblast cells disrupted by hypoxia/reoxygenation. Thus, human villous trophoblast cells in primary culture are an excellent approach to study the mechanisms behind the protective effects of melatonin on placental function during hypoxia/reoxygenation.

This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.

ראשוניים האדם Trophoblast דגם תרבית תאים כדי לחקור את ההשפעות המגנות של מלטונין נגד היפוקסיה / נגרמת reoxygenation שיבוש

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

בידוד ניתוח בתאי גזע hematopoietic מן השליה

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Biology

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

בידוד של עכבר רירית הרחם אפיתל סטרומה תאים עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

בידוד של טיפות שומנים נייד: שתי טכניקות טיהור החל מתאי שמרים ושליות אדם

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Bioengineering

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for embryo implantation into the uterine lining of the maternal womb. Improper decidualization has been established as a root cause for implantation failure and subsequent early embryo miscarriage. Therefore, understanding the molecular mechanisms underlying decidualization is advantageous to improving the rate of successful births. In vivo based studies of artificial decidualization are often limiting due to ethical dilemmas associated with human research, as well as translational complications within animal models. As a result, in vitro assays through primary cell culture are often utilized to explore the modulation of decidualization via hormones. This study provides a detailed protocol for the isolation of HESC and subsequent artificial decidualization via the supplementation of hormones to the culturing medium. Further, this study provides a well-designed method to knockdown any gene of interest by utilizing lipid-based siRNA transfections. This protocol permits the optimization of culture purity as well as product yield, thereby maximizing the ability to utilize this model as a reliable method to understand the molecular mechanisms underlying decidualization, and the subsequent quantification of secreted agents by decidualized endometrial stromal cells.

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a validated and optimized procedure for the isolation and culture of human endometrial stromal cells to conduct in vitro decidualization assay. Further, this study provides a detailed method to efficiently knockdown a specific gene using siRNAs in human endometrial stromal cells.

לבידוד של תאי סטרומה רירית הרחם אדם במבחנה Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

בידוד של לויקוציטים מממשק האדם-האימהי העוברי

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Immunology and Infection

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

בידוד, Cryopreservation ותרבות של תאי אפיתל amnion אדם ליישומים קליניים

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

בידוד של תאים ראשוניים עכבר Trophoblast וAssay הפלישה Trophoblast

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...