עבודה זו נתמכה על ידי מכון יוניס קנדי שרייבר הלאומי לבריאות ילד והתפתחות אדם, NIH / DHHS. עבודה זו נתמכה גם, בחלקו, על ידי Perinatal אוניברסיטת היוזמה ויין מדינה באימהי, Perinatal ובריאות ילד. הכרת תודה אנו מודים מורין McGerty (אוניברסיטת ויין סטייט) לקריאה הביקורתית של כתב היד.

פרוטוקול זה מתאים לבידוד יקוציט מbasalis decidua וparietalis decidua בהכנה לimmunophenotyping ידי cytometry זרימה. יתר על כן, התאים המבודדים יכולים לשמש למיון תא, תרבית תאים, בידוד RNA, וציטולוגיה. לפני העבודה עם הדגימות שהוזכרו בפרוטוקול זה, יש לקבל את האישור אתי אנושי מהוועדה המקומית לחקר האתיקה ולוחות סקירה מוסדית. האיסוף והניצול של דגימות אנושיות למטרות מחקר אושרו על ידי לוחות הסקירה המוסדית של המכון הלאומי יוניס קנדי שרייבר לבריאות ילד והתפתחות אדם (NICHD), מכון הלאומי לבריאות (NIH), מחלקת בריאות ושירותי אנוש (DHHS , Bethesda, MD, ארה&quot;ב) והאוניברסיטה ויין סטייט (דטרויט, מישיגן, ארה&quot;ב). נכתב הסכמה מהדעת התקבלה מכל הנשים בהריון לפני האוסף של דגימות רקמה. הערה: בעת שעבדה בדם של בעלי חיים, תאים, או מפגעסוכני היחידות הארגוניות כאמור בפרוטוקול זה, זה חיוני כי בטיחות ביולוגית נכונה ופעולות בטיחות במעבדה להיות אחריו. 1. Dissection של רקמות Decidual האדם הערה: צלחת הבסיס היא הבסיס מתחת ומחובר לשליה ומייצגת את פני השטח האימהיים. קרומי chorioamniotic כוללים amnion וסיסי. הצלחת הבסיסית כוללת basalis decidua והסיסי כולל parietalis decidua (איור 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Decidua basalis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח פיסת הצלחת הבסיסית מטבורית אחד של השליה (איורים 1 א ו -1 B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים אותו על קרש חיתוך סטרילי עם villi השליה פונה כלפי מעלה. הצד מראה villi השליה הוא בדרך כלל אדום מדם עם רקמת שעיר במראה. צלחת הבסיס חלקה וחיוורת בצבע אדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים חדים, מספריים ועדין נקודה כדי להסיר את Villכלי רקמה ודם היחידות הארגוניות. לשמור על הרקמה הספוגה ב1x PBS (Ca 2 + - וMg 2 + - ללא תשלום) בתהליך (איור 1 ג). לאסוף 2-3 חתיכות אלה ולשטוף אותם ביסודיות עם 1x PBS להסיר הדם (1D איור). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Decidua Parietalis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח פיסת קרום chorioamniotic (כ 10 סנטימטרים x 10 סנטימטר, איור 1E). מניחים אותו על הלוח עם סיסית פונה כלפי מעלה. צד השליה מכיל קרישי דם, והוא בדרך כלל אור בצבע צהבהב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים עדין נקודה כדי להסיר כמה שיותר קרישי הדם ככל האפשר (איור 1E). יש לשטוף את הקרום בסטרילי 1X PBS כדי לנקות את הדם העודף מהקרום עד PBS 1x פועל ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מגרד תא סטרילי חד פעמי כדי לגרד את שכבת decidual מן הקרום בעדינות. החל סטרילי 1X PBS על ממBrane בעת השלמת תהליך זה (איור 1F). אסוף את רקמות decidual ולמקם אותם בצינור פלסטיק 50 מיליליטר עם סטרילי 1X PBS (איור 1G). </li></ol></li></ol> 2. מכאני disaggregation ואנזימתי עיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הרקמה גזור מbasalis decidua (משלב 1.1.3) או parietalis decidua (משלב 1.2.3) עם סטרילי 1X PBS בצינור פלסטיק 50 מיליליטר. לאסוף כדורי רקמה על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ממוקם מעל גלולה הרקמה בזהירות מבלי להפריע גלולה. הערה: בשלב זה, את כדורים הם רופפים מאוד משום שהם מכילים תאי דם אדומים. אם הנפח של גלולה הוא על או פחות מ 3 מיליליטר, מחדש להשעות את גלולה ב 6 מיליליטר של תמיסת ניתוק תא מחומם מראש ל -37 מעלות צלזיוס. אם גלולה היא גדולה יותר מאשר 3 מיליליטר של נפח, להוסיף עוד פתרון ניתוק תא (להוסיף על פי 2 הדואר נפח של דגימות הרקמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הרקמות הומוגני (basalis decidua + parietalis פתרון או decidua ניתוק תא + פתרון ניתוק תא) לצינור C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינור C בDissociator האוטומטי ולהפעיל את התכנית המתאימה. הערה: התכנית לbasalis decidua פועלת לשניות 17 עם 668 סיבובים הכולל לטווח. התכנית לparietalis decidua פועלת לשניות 37 עם 235 סיבובים הכולל לטווח. תוכניות אלה מותאמים אישית כדי לבודד לויקוציטים מbasalis decidua או parietalis decidua עם תשואה טובה וכדאיויות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות disaggregation המכני של הרקמות, לעכל את הרקמות עם פתרון ניתוק תא זמין מסחרי כגון Accutase; (קוקטייל המכיל מפרקי חלבונים ואנזימי collagenolytic) במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. </li></ol> 3. בידוד של לויקוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, להוסיף 10 מיליליטר של 1x PBS לDIGEתערובת stion ולהעביר אותו דרך מסננת תא 100 מיקרומטר לתוך צינור פלסטיק 50 מיליליטר. בהתאם לדביקות של תערובת העיכול, אחד ייתכן שיצטרך להשתמש בכמה מסננות תא לתערובת אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הצינור עם 1x PBS ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות על RT. הסר את PBS 1x מעל כדורי התא בזהירות מחדש להשעות את כדורים עם 5 מיליליטר של חיץ FACS קר כקרח. הערה: כדי ללמוד את כדוריות דם לבנות polymorphonuclear וmononuclear יחד, עבור לשלב 6.1; ללמוד לויקוציטים mononuclear, המשך לשלב 3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיליליטר של 20% תקשורת שיפוע צפיפות (1.077 + 0.001 g / מיליליטר) לצינור פלסטיק 15 מיליליטר וכיסוי לאט ההשעיה התא על גבי מדיה שיפוע צפיפות. בעוד שכבות המדגם, חשוב לא לערבב תקשורת שיפוע צפיפות עם ההשעיה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה עם הרוטור את נדנדה-XG ב 500 במשך 30 דקות ב 4 C ללא הבלם. זה מאוד חשוב כדי לכבות את הבלם כדי למנוע ערבוב התאים וlosing השיפוע. לויקוציטים יימצא בממשק בין תקשורת שיפוע צפיפות וחיץ FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השכבה העליונה המכילה את המאגר ופסולת תא FACS בזהירות בעזרת פיפטה. הלהקה בממשק מכילה תאי mononuclear decidual וחלק מכדוריות הדם לבנות polymorphonuclear. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים בממשק לחלוטין לצינור פלסטיק 15 מיליליטר חדש. הוסף עוד נפח לפחות 3 פעמים של חיץ FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות לpelletize התאים. לשאוב supernatant ולשטוף את התאים עם חיץ FACS. Pelletize את התאים עם צנטריפוגה אחרת ב XG 300 במשך 5 דקות על RT. הערה: כדי לבצע את תרבית התאים, ראה שלב 4. כדי לבצע מיון תא, ראה שלב 5. כדי לבצע immunophenotyping, ראה שלב 6. </li></ol> 4. יישומים - תרבות סלולארי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות מחדש התאים משלב 3.7 ב 1 מיליליטר של מדיום תרבות RPMI 1640. ספירת תאי קיימא using דלפק אוטומטי תא או hemocytometer ופתרון trypan כחול 0.4%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את הסכום של מדיום תרבות RPMI לעשות ריכוז תא של 1 x 10 6 תאים / מיליליטר. תאים מוכנים לתרבות החברה. </li></ol> 5. יישומים - בידוד של המקרופאגים לתרבית תאים ראשוניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד CD14 + תאים, מגנטי התווית התאים משלב 3.7 עם microbeads CD14 (20 חרוזים μl לכל 10 7 תאים), דגירה במשך 15 דקות ב 4 C, וCD14 נפרד + תאים מסוגים אחרים של תאים על ידי הפעלת שדה מגנטי. לאחר 2 שטיפות עם חיץ MACS וההסרה של השדה המגנטי, elute תאי CD14 + עודפים המגנטיים עם חיץ MACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צנטריפוגה, מחדש להשעות את כדורי התא בינוני תרבות RPMI 1640. התאים מוכנים לציפוי (איור 2). </li></ol> 6. יישומים - immunophenotyping <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשתמש בתאים לimmunophenotyping, מחדש להשעות את התאים משלב 3.7 ב 1 מיליליטר של 1x PBS. ספירת תאי קיימא באמצעות דלפק אוטומטי תא או hemocytometer ופתרון trypan כחול 0.4%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית התאים עם צבע ניתן לתקן כדאיות (איור 3). לשטוף את התאים פעמיים עם חיץ FACS מחדש להשעות את התאים במאגר כתם. דגירה עם חוסם FCR במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף נוגדנים תאיים מצומדת לfluorochromes. לדוגמא, בפרוטוקול זה, להשתמש באנטי-CD3, נוגדנים נגד CD19, אנטי CD14, אנטי CD15, ואנטי-CD56 (טבלה 1). דגירה של 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 שטיפות עם 1x PBS, התאים ינותחו ב500 μl של חיץ כתם באמצעות cytometer זרימה. ייצוג של אסטרטגית gating להשתמש כדי לנתח את תת-האוכלוסיות לויקוציטים נמצאו ברקמות decidual מוצג באיור 4. </li></ol>

The authors disclose no conflicts of interest.

אפיון התכונות הפונקציונליות ופנוטיפי של חדירה לויקוציטים בממשק אימהי-העוברי האנושי הוא חיוני להבנה של מנגנוני החיסון שיובילו להפרעות הריון. כמה טכניקות שתוארו כדי לבודד לויקוציטים מהממשק אימהי-העוברי האנושי במהלך הריון 10,14,25,28,37,42,43. עם זאת, כל אחד מטכניקות אל?...

הריון מאופיין בשלושה שלבים ברורים חיסוניים: 1) השתלה וplacentation המוקדם הקשורים בתגובה פרו-דלקתית (כלומר, השתלה דומה &quot;פצע פתוח&quot;); 2) השליש השני ורוב השליש השלישי של הריון כאשר הומאוסטזיס חיסון מושגת באמצעות מדינה בעיקר אנטי דלקתית בממשק אימהי-העוברי; והמלטה 3), מדינה פרו-דלקתית 1-7. תאים חיסוניים יש תפקיד חשוב בויסות התגובה הדלקתית בממשק אימהי-העוברי שבו השפע שלהם ושינוי הלוקליזציה במהלך הריון 6-9. בבני אדם, הממשק אימהי-עוברי מייצג אזור של קשר ישיר בין האימהי (decidua) ועובר (סיסית או trophoblast) רקמות. ממשק זה כולל: 1) decidua parietalis שקווי חלל הרחם אינו מכוסה על ידי השליה והוא בסמיכותלlaeve סיסית; ו -2) basalis decidua, ממוקם בצלחת הבסיס של השליה שבו הוא פלש trophoblasts ביניים 10 (איור 1). האינטימיות של תחומי מגע אלה יוצר תנאים לחשיפה עוברית לאנטיגני 11-13 המערכת החיסונית של האם. שלא במפתיע, לויקוציטים מהווים עד 30-40% מתאי decidual 8,9,14,15 בנוסף לתאי סטרומה-סוג טיפוסיים ותאי בלוטות 8,14,16. התפקיד של לויקוציטים בממשק אימהי-העוברי כולל מספר רב של תהליכים הכוללים הגבלה של פלישת trophoblast 17, שיפוץ של עורקים סליליים 18,19, תחזוקה של סובלנות מצד 12,20, וחניכה של עבודת 21-26. לויקוציטים של שתי ההסתגלות וגפיים מולדים של מערכת החיסון, כלומר, תאי T, מקרופאגים, נויטרופילים, תאי B, תאים דנדריטים, ותאי NK, זוהו ברקמות decidual, ופרופורציות ומצב הפעלה הוכחו להשתנות מרחב ובזמן בכל הריון 6-10,12,14,24,27-30. הפרעות באוכלוסיית יקוציט ו / או הפונקציה משויכות הפלה ספונטנית 31, רעלת הריון 32, הגבלת גדילה תוך-רחמית 32,33, וצירים מוקדמים 7,24. לכן, המחקר של המאפיינים פנוטיפי והפונקציונליות של לויקוציטים בממשק אימהי-העוברי האנושי יאפשר הבהרת המסלולים החיסוניים dysregulated בהפרעות הריון. טכנולוגיה אחד הכלים החזקים ביותר המשמשים לקביעת הפנוטיפ ומאפיינים פונקציונליים של לויקוציטים הוא cytometry זרימה, המאפשרת ניתוח כמותי של פרמטרים מרובים בו זמנית 34-36. כדי לנתח לויקוציטים ידי cytometry זרימה, נדרש בידוד של כדוריות דם לבנות בהשעית תא בודד. לכן, שיטה להפריד הסתננות Leuיש צורך kocytes מהממשק האימהי-העוברי ללמוד פנוטיפי ומאפיינים פונקציונליים. כמה שיטות שתוארו לבודד את כדוריות דם לבנות מהממשק אימהי-העוברי האנושי 10,14,25,27,37-39. בעוד כמה להחיל disaggregation המכני 10,25,27,38, אחרים משתמשים עיכול אנזימטי 37,40 לניתוק רקמה. בגלל disaggregation המכני מייצר תשואה נמוכה וכדאיות מופחתת 41, וניתוק האנזימטית יכול להשפיע על כדאיות ופני תא שמירת סמן 42, בשיטה המתוארת במסמך זה משלב ניתוק מכאני עדין עם האנזימטית מראש טיפול להגדיל את התשואה של לויקוציטים המבודד מבלי להתפשר על כדאיות תא. שילוב דומה של שיטות הודגם כיעיל בבידוד של כדוריות דם לבנות מרקמות decidual בממשק האימהי-העוברי 39. לכן, הפרוטוקול המתואר במסמך זה כרוך Mechadisaggregation nical עם Dissociator רקמה אוטומטי שמגדיל עקביות תוך חיסכון בזמן ועבודה בהשוואה לגנדרני מסורתי עם אזמלים מנוגדים, סכיני גילוח, או מספריים כירורגיות 10,28. האנזים שנבחר לניתוק רקמה היה Accutase. שלא כמו collagenase הנפוץ 43, dispase 44, וטריפסין 45, Accutase (פתרון ניתוק תא) משלב את שני מפרקי חלבונים כלליים ופעילויות collagenolytic שתורמות לניתוק עדיין עדין יעיל 46,47. לאחר ניתוק, לויקוציטים מועשר מהאוכלוסייה הכוללת של תאי decidual ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות. תקשורת שיפוע צפיפות שונות כבר נוצלה בעבר, הנפוץ ביותר מהם Percoll (השעיה של חלקיקי סיליקה colloidal) 48 וFicoll (פולימר של סוכרוז עם משקל מולקולרי סינטטי גבוה) 49. היעילות מעולה של בידוד על ידי פולימר סוכרוז כבר previoמוצג usly 50, והפרוטוקול המתואר במסמך נוסף מוכיח שתקשורת שיפוע צפיפות זו מייצרת טוהר גבוה מספיק של לויקוציטים mononuclear. לפיכך, הפרוטוקול המתואר במסמך זה משלב disaggregation הרקמה המכני עם Dissociator אוטומטי רקמות, עיכול אנזימטי עם פתרון ניתוק תא, והפרדה לויקוציטים עם תקשורת שיפוע צפיפות (1.077 + 0.001 g / מיליליטר) כדי לבודד לויקוציטים מרקמות decidual אנושיות. פרוטוקול זה הוכח לשמר אנטיגנים פני תא יחד עם כדאיות תא. לויקוציטים המבודד יכול לשמש ליישומים מרובים הכוללים immunophenotyping עם cytometry זרימה ומחקרים תפקודיים במבחנה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers&#160;</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>(1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large and small Petri dishes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>(cell detachment solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 2 mL safe-lock conical tubes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainers</td>
			<td>FALCON/Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round bottom polystyrene test tubes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI culture medium 1640&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>22400-089</td>
			<td>(1X) (10% FBS and 1% P/S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic chamber slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>177437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific Corporation</td>
			<td>HEPA Class 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ISOTEMP 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexelcom</td>
			<td>Cellometer Auto2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cell Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#956;m pre-separation filters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multistand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL safe-lock conical tubes</td>
			<td>Any Vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td>(Fc Block)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human cell surface antigen antibodies&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>(Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD viability dye</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyse/Fix buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>346202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(1% BSA, 0.5% Sodium Azide, and 1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>20% density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Additional Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MAXQ 4450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>LSR-Fortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SpinChron DLX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic tissue dissociator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface

הריון מאופיין בחדירה של כדוריות דם לבנות ברקמות הרבייה ובממשק האימהי-עוברי (basalis decidua וparietalis decidua). ממשק זה הוא האתר האנטומי של קשר בין האם ורקמות עוברים; לכן, זה אתר חיסוני של פעולה במהלך הריון. לויקוציטים מסתנן בממשק אימהי-העוברי לשחק תפקיד מרכזי בהשתלה, תחזוקת הריון, ועיתוי של מסירה. לכן, אפיונים פנוטיפי ופונקציונליים של לויקוציטים אלה יספק תובנה המנגנונים המביאים להפרעות הריון. כמה פרוטוקולים תוארו כדי לבודד חדירה לויקוציטים מbasalis decidua וparietalis decidua; עם זאת, חוסר העקביות בחומרים הכימיים, אנזימים, ופעמים של דגירה עושה את זה קשה להשוות תוצאות אלו. מתואר כאן היא גישה חדשנית המשלבת את השימוש בDiss המכני והאנזימטית העדיןטכניקות ociation לשמר את הכדאיות ויושרה של סמנים תאיים ו תאיים בלויקוציטים מבודד מהרקמות האנושיות בממשק אימהי-העוברי. מלבד immunophenotyping, תרבית תאים, ומיון תא, היישומים העתידיים של פרוטוקול זה הם רבים ומגוונים. בעקבות פרוטוקול זה, יכולים לשמש לויקוציטים המבודדים כדי לקבוע מתילציה DNA, ביטוי של גני המטרה, במבחנה פונקציונלי יקוציט (כלומר, phagocytosis, רעיל, התפשטות תאי T, וגמישות, וכו &#39;), והייצור של מיני חמצן מגיבים בממשק אימהי-העוברי. בנוסף, באמצעות הפרוטוקול המתואר, מעבדה זו הייתה מסוגלת לתאר לויקוציטים החדשים והנדירים בממשק אימהי-העוברי.

. הנתיחה של רקמות אנושיות בממשק האימהי-עוברי (basalis decidua וparietalis decidua) מוצגת באיור 1 הליך זה כולל את הנתיחה של הצלחת הבסיסית, הכוללת את basalis decidua (איור 1 א - ד). Basalis decidua מתקבל על ידי הסרת villi השליה (הצד עוברי) מצלחת הבסיס (איור 1 ג). Parietalis decidua ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface at JoVE.com

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

בידוד של לויקוציטים מממשק האדם-האימהי העוברי

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

isolation-of-leukocytes-from-the-human-maternal-fetal-interface

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.8K Views.  NICHD/NIH/DHHS. Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis. 

Video: Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

בידוד של המוח, שחדר Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; עכברי אנקה נגוע

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and neurodegenerative diseases but assessing changes in bioenergetic function in patients is challenging.&#160;Although diseases such as diabetes or atherosclerosis present clinically with specific organ impairment, the systemic components of the pathology, such as hyperglycemia or inflammation, can alter bioenergetic function in circulating leukocytes or platelets. This concept has been recognized for some time but its widespread application has been constrained by the large number of primary cells needed for bioenergetic analysis.&#160;This technical limitation has been overcome by combining the specificity of the magnetic bead isolation techniques, cell adhesion techniques, which allow cells to be attached without activation to microplates, and the sensitivity of new technologies designed for high throughput microplate respirometry.&#160;An example of this equipment is the extracellular flux analyzer. Such instrumentation typically uses oxygen and pH sensitive probes to measure rates of change in these parameters in adherent cells, which can then be related to metabolism. Here we detail the methods for the isolation and plating of monocytes, lymphocytes, neutrophils and platelets, without activation, from human blood and the analysis of mitochondrial bioenergetic function in these cells. In addition, we demonstrate how the oxidative burst in monocytes and neutrophils can also be measured in the same samples. Since these methods use only 8-20 ml human blood they have potential for monitoring reactive oxygen species generation and bioenergetics in a clinical setting.

Blood leukocytes and platelets can be used as a marker of overall bioenergetic health of an individual and so have the potential to monitor pathological processes and the impact of treatments. Here&#160;we describe a method to isolate and measure mitochondrial function and the oxidative burst in these cells.

Bioenergetics וחמצוני פרץ: הפרוטוקולים לבידוד ולהערכה של לויקוציטים אדם וטסיות הדם

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

בידוד של אדם מונוציטים ידי זוגי Gradient צנטריפוגה והבידול שלהם להמקרופאגים בתיקי תרבית תאים מצופים טפלון

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

ניתוח ההשפעות של תאי סטרומה על הגיוס של לויקוציטים מתזרים

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

בידוד של לויקוציטים מרקמות Murine בממשק האם והעובר

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

בידוד של ההסתננות Leukocytes מעור העכבר באמצעות אנזימתי לעכל והפרדת צבע

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

שלית Decidual אדם תרבויות איברים ללמוד זיהומים בבית הממשק האם והעובר

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low numbers of DCs present per tissue. Yet, as the phenotype and function of DCs is modified by the tissue environment, it is necessary to analyze tissue resident DC populations, since blood derived DCs incompletely reflect the complexities of DCs in tissues. Here we present a protocol to isolate DCs from the human female reproductive tract (FRT) using hysterectomy specimens that allows both phenotypical and functional analyses. The protocol consists of tissue digestion to generate a single cell mixed cell suspension, followed by positive magnetic bead selection. Our tissue digestion protocol does not cleave surface markers, which allows phenotypical and functional analysis of DCs in the steady state, without overnight incubation or cell activation. This protocol can be adapted for the isolation of other immune cell types or isolation of DCs from other tissues.

We describe here a method to isolate and purify dendritic cells from different anatomical compartments in the human female reproductive tract for the evaluation of their phenotypical and functional characteristics. This method can be adapted to isolate other immune cells or dendritic cells from other mucosal tissues.

בידוד של תאים דנדריטים האדם באיברי הרבייה הנקביים ללימודי פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר ופונקציונלי

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...