저자는이 연구에 사용 된 인간의 표본에 대 한 기증자, RCWIH BioBank 마운트 시 나이 병원/UHN 산부인과 부서 및 산부인과 감사 하 고 싶습니다. 우리는 잿 물 실험실, 특히 그녀의 방법 개발에 대 한 박사 캐롤라인 덩크의 회원을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 버로우즈 환영 기금 (부여 #1013759)에 의해 지원 됩니다.

Placentae 선택 제왕 섹션을 겪고 노동 여성에 건강 한 용어에서 수집 됩니다. 수집, 처리, 그리고 인간의 샘플의 일회용 마운트 시 나이 병원 윤리 위원회의 지침을 준수 합니다. 서 면된 동의 각 환자에 게 서 얻어진 다. 이 연구는 마운트 시 나이 병원에서 연구 윤리 위원회에 의해 승인 됩니다.
1입니다. 준비
참고: 모든 단계 증기 두건에서 실시 되어야 하 고 모든 수술 장비 통해 압력솥 증기 두건에 배치 하기 전에 소독 해야 합니다. (병, 50 mL 튜브, 등) 다른 모든 자료는 70% 에탄올 용액으로 살 균 해야 합니다. 항상 착용 개인 보호 장비에 항상 유해 쓰레기 (연구실 코트, 장갑, 긴 머리를 다시 묶어, 등)와 함께 작업 하는 경우.
<ol><li>
효소 소화 솔루션 (최종 솔루션: 200 mL)
	<ol>
<li>플라스틱의 HBSS-180 mL / 500 mL 비 커에 살 균 감동적인 자석을 추가 하 고 플레이트 실 온에서 교 반에-.</li>
		<li>밖으로 무게 추가 하 고 다음 HBSS/솔루션에 천천히 순차적으로: 20 mL FBS, 400 mg 콜라 2 ([최종] = 2 mg/mL), 20 mg 간장 콩 트립 신 억제제 ([최종] = 0.1 mg/mL), 30 mg DNase 1 ([최종] = 0.15 mg/mL), 및 200mg BSA ([최종] = 1 mg/mL)</li>
		<li>감동 중간 속도를 설정 하 고 10-20 분 (교 반 하면서 주석 포 일 또는 파라핀 필름 커버) 파문 혼합물 허용.</li>
		<li>플라스틱 퍼 널을 사용 하 여 250 mL 유리 병에 혼합된 솔루션을 부 어 하 고 증기 두건에.</li>
		<li>플라스틱 가기 여과 장치 (0.22 μ m 멤브레인 필터, 500 mL), aliquot 20 mL 50 mL 튜브 (총 10 관) 및 사용까지-20 ° C에서 저장소를 통해 솔루션을 전달 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RPMI 1640 미디어 (세척 솔루션 및 10% 완전 한 성장 매체는 2%)
	<ol>
<li>RPMI 1640와 FBS 증기 두건에서 유리 병에 결합 합니다.</li>
		<li>2 %FBS 솔루션, 490 mL와 10 mL FBS RPMI 1640의 결합.</li>
		<li>10 %FBS 솔루션 RPMI 1640 450 mL 및 50 mL FBS 결합 하 여.</li>
		<li>Normocin의 500 μ RPMI 미디어와 FBS (50 mg/mL 재고, 0.05 mg/mL 작업 농도)를 포함 하는 이전 단계에서 500 mL 유리병에 플라스틱.</li>
		<li>사용까지 4 ° C에서 500 mL 유리병에는 0.22 μ m 멤브레인 필터 및 저장소를 통해 미디어를 전달 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실험을 시작 하기 전에 30 분 배치의 약 20 mL 수 37 ° C 비드 욕조에 효소 소화 솔루션 냉동, 2 %FBS 37 ° C 비드 욕조에 10% FBS RPMI 1640 미디어 락 물 목욕 설정 하 고 37 ° C로 설정 2 세대, 그리고 설정 4 ° c 온도 제어 원심 분리기</li>
</ol>2. Decidual 조직 용어 Placental 세포 막에서의 수집
<ol><li>HBSS 병 장소 + +, HBSS-/-5 50 mL 튜브 랙 연기 후드 아래에. HBSS 25 mL를 플라스틱 + + 1 개의 관에.</li>
	<li>
Gloved 손을 사용 하 여, 꺼내 용어 태 반 수술 실 극장에서 수송을 위해 사용 하는 컨테이너에서. 기저귀 패드 (어머니 쪽)에 태를 놓고 태아 막이 위와 집게를 사용 하 여 밖으로 확산.
	<ol>
<li>증기 두건에 겹치는 기저귀 패드를 하다.</li>
		<li>별도 기저귀를 사용 하 여 그래서 어머니 쪽 얼굴 태를 플립.</li>
		<li>고 막 파열의 지점을 찾아 전개 하 여 fumehood 표면에 평평 하다 막 수 있도록 절 개. 참고: 막 태에서 철수는, 일단은 decidua 얼굴 뒤에 amnion 레이어와 chorion 레이어에 휴식 될 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Chorion 25 mL HBSS 포함 50 mL 튜브에 장소에서 decidual 조직을 긁어 신중 하 게 플라스틱 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 + +.</li>
	<li>적당 한 압력으로 멤브레인을 다쳤어요. 그것은 chorion 오염 발생할 수 있습니다 너무 많은 압력을 적용 되지 않습니다. 뿐만 아니라, 일부 decidual 셀을 포함 하는 이러한 작은 혈전을 수집 합니다. 주의: decidual 컬렉션 후 태 고 해야 합니다 생물 플라스틱 상자에 포장 (제도적 규칙)에 따라 적절 한 처리 하기 전에-20 ° C 냉동 고에 얼. 피 묻은 기저귀 패드 인감 꽉 비닐 봉투에 포장 하 고 생물 안전 상자에서 삭제 해야 합니다.</li>
</ol>3. 세탁기 및 효소 소화 Decidual 조직의
<ol><li>부드럽게 손으로 50 mL 튜브를 흔들어 하 메 마른 견본 (소변) 컨테이너에 휴식 250 μ m 금속 체 (250 μ m, 크기 60 메쉬)를 통해 전달 하 여 수집 된 조직 세척.</li>
	<li>HBSS로 두 번 세척을 반복 + +와 두 번 HBSS-/-각 세척에 대 한 신선한 튜브에. (최종 HBSS-세척 /-칼슘과 마그네슘 HBSS에 존재의 제거에 대 한 수 있습니다 + +는 그렇지 않으면 다음 효소 소화 과정을 방해). 참고입니다. 세척 단계 동안 chorion 조직 오염 decidual 조직 색상에 핑크 빛과 chorion 동안 비정 질 이며 백색, 밀도, 힘 줄은 명백한 될 것입니다. 따라서, chorion 오염 집게와 함께 쉽게 제거할 수 있습니다.</li>
	<li>필요에 따라 decidual 조직이 두꺼운 경우 무 균 10 cm 직경 페 트리 접시에 그것을 전송 하 고 접시에 두 개의 반대 scalpels와 조직의 말하다 계속 합니다.</li>
	<li>
효소 소화 솔루션의 조직/mL의 100 mg을 포함 하는 살 균 50 mL 튜브에 씻어 조직 배치 (준비 참조).
	<ol>
<li>참조 점으로 decidual 조직의 수준 50 mL 튜브에 5-10 mL 마크에 도달 하면 확인 합니다.</li>
		<li>효소 소화 솔루션 (단계 1.1에서에서 Prepared)의 약 20 mL를 사용 하 여 전체 기간 태아 막에서 수집한 총 decidua 소화.</li>
	</ol>
</li>
	<li>파라핀 영화와 튜브의 뚜껑을 봉인 (튜브를 단단히 밀봉 하 고 포장 모자와 튜브의 상단 주위 파라핀 필름) 문화에서 후드를 떨고 물 목욕 (145 rpm에서에서 20 분 동안 37 ° C에서 decidual 조직을 품 어 2 세대).</li>
	<li>부 화, 후 파라핀 필름을 제거 하 고 소화 조직 70% 에탄올을 포함 하는 튜브의 표면 소독 연기 후드 아래. 짧게 손으로 튜브 흔들.</li>
	<li>새로운 살 균 견본 콘테이너로 금속 체 (250 μ m, 크기 60 메쉬)을 통해 세포 현 탁 액을 수집 합니다. 효소 반응을 중지 RPMI + 10 %FBS 포함 0.1 %normocin 동등한 볼륨 (20 mL)와 희석. 원심 분리 단계 4.1 직접 진행 합니다.</li>
	<li>필요한 경우, 나머지 소화 되지 않은 조직 20 mL 신선한 효소 소화 솔루션의 새로운 50 mL 튜브에 다시 놓고 소화 (20 분, 물 목욕을 떨고 37 ° C)를 반복 합니다.</li>
	<li>두 번째 소화 필요한 경우 얼음 (무 균 유지 파라핀 필름 커버)에 셀 서 스 펜 션 첫 번째 튜브를 놓습니다. 3.5-3.6 단계를 반복 하 고 두 셀 정지를 결합.</li>
</ol>4. 단일 셀 서 스 펜 션 생성
<ol><li>세포 현 탁 액 (420 g, 4 ° C, 11 분) 원심</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 resuspend RPMI + 2 %FBS 포함 0.1 %normocin ("워시 버퍼") 40 mL에 셀. 참고: 셀 펠 릿 느슨한 하 고 붉은 혈액 세포 오염 때문 젤라틴, 발음 주의 상쾌한 것입니다. 수동 피 펫을 상위 단계의 제거 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>11 분 4 ° C에서 420 g에서 원심 분리를 반복 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 (참고 단계 4.2 했 듯이)는 상쾌한을 제거 하 고 워시 버퍼의 5 mL에 셀 펠 릿 resuspend 같은 튜브에 35 mL의 적혈구 세포의 용 해 버퍼를 추가. 참고: 펠 릿이 크거나 매우 살 벌 한, 그것은 수 분할 적혈구 세포 단계에 대 한 두 개의 튜브로 추가 하 여 워시 버퍼의 10 mL를 추가 하 고 두 개의 튜브를 똑같이 나누어 적혈구 세포의 용 해 버퍼의 35 mL 각 튜브를.</li>
	<li>20 분 시작 하 고 붉은 혈액 세포를 lyse에 외피의 끝에 짧게 소용돌이 tube(s)에 대 한 얼음에 품 어.</li>
	<li>4 ° c.에 11 분 420 g에서 원심</li>
	<li>신중 하 게, 제거는 상쾌한 고 워시 버퍼의 40 mL에 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>세포 세포 덩어리를 제거 하는 70 μ m 나일론 필터를 통해 전달 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 11 분 420 g에서 원심 분리기</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 완전 한 매체의 10 mL에 셀 펠 릿 resuspend (RPMI 10% + 0.1 %normocin 포함 하는 FBS).</li>
	<li>
Trypan 파랑 염료-제외 hemocytometer 절차 아래에 설명된대로 사용 하 여 셀의 개수:
	<ol>
<li>문화 후드 부드럽게 trypan 블루와 결합 하기 전에 철저 하 게 혼합 하기 위하여 세포 현 탁 액 3 배 아래로 플라스틱. 1.5 ml에서 튜브 준비 세포 현 탁 액, 1:2 (trypan 블루 솔루션의 결합 20 μ)과 20 μ decidual 세포 현 탁 액의 희석. 조심 스럽게 몇 번 (이 솔루션은 불 임) 위아래로 pipetting으로 trypan 블루 셀 솔루션을 혼합.</li>
		<li>위에 유리 coverslip와 현미경의 스테이지는 hemocytometer를 놓습니다. 참고: Hemocytometer 트리플 라인에 의해 분할의 큰 사각형 9 개에 게 그것에 격자와 현미경 슬라이드입니다. 각 큰 광장 1 m m2의 면적을가지고 그리고 챔버에 액체의 깊이 0.1 m m. 따라서, 각 큰 사각형을 채울 수 있는 액체의 볼륨은 1mm * 1mm * 0.1 m m = 0.1 m m3= 10-4 mL.</li>
		<li>천천히 전체 슬라이드 (정지 전에 혼합 잘 채우고) 동안 셀 혼합 분산을 모 세관 행동을 수 있도록 hemocytometer의 홈으로 trypan 블루 셀 혼합물의 10 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>(10 배 확대)에서 현미경으로 세포를 확인 하 고 trypan 블루 (이들은 실행 가능한 세포)는 hemocytometer의 4 개의 큰 외부 사각형에 제외 된 모든 화이트/그린 셀. 라인을 터치 하는 셀을 계산 하는 경우 그 터치 오른쪽 및 위쪽 라인 하지만 왼쪽 및 아래쪽 라인을 만지고 그 들만 계산 합니다. 어두운 파란색 셀;를 계산 하지 않음 파란색 셀이 죽은 trypan blue 염료 관통할 수 있다 쉽게 플라즈마 세포 막을 통해 세포질으로 나타냅니다.</li>
		<li>세포 현 탁 액 (X)의 1 mL에 가능한 셀의 수 계산: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57443/57443eq1v2.jpg"> 2 = 희석 비율 10000 변환 계수 = (1 mL = 1 c m3 = 10, 000 * 0.1 m m3)</li>
	</ol>
</li>
	<li>Decidual 셀 RPMI + 10%에서 바람직한 최종 농도를 희석 FBS (성장 매체). 참고: 조직 문화 도금, 플라스틱 2 * 106 셀/잘 플라스틱 6 잘 플레이트, 10 cm 플라스틱 격판덮개로 10 * 106 세포 또는 유리 coverslip 75000 셀.</li>
</ol>

<ol>
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저자 공개할 게 없다

여기에 설명 된 프로토콜은 비용은 매우 간단 하 기본 decidual 세포를 고립 시키기를 위한 효과적인 방법 전체 인간의 용어 placentae의 태아 세포 막에서 수집 하는 시간을 보여 줍니다. 이 프로토콜의 성공은 두 가지 중요 한 요소, (1) 태아 막 및 (2) 치료는 decidual 세포 프로토콜 통해 처리의 chorion 계층에서 근 근이 살아가고 decidual의 효율에 따라 달라 집니다. 그것은 중요 한 chorion 조직 오염 보장 하 ...

가장 적극적인 성인 여성 조직 중 하나 endometrium 난소 호르몬, 에스트로겐 (E2)과 황 체 호르몬 (P4)에 의해 자극에 대 한 응답에서 각 생리 주기를 개장 하는 극적인 겪 습. 일컬어 임신 endometrium decidua P4 기반 차별화 E2 지배 증식 단계 결과로 postovulatory 단계의 끝에 의해 형성 되는 매우 중요 한 생식 조직 이다. Decidual 셀 성공적인 blastocyst 이식 한 태아 이식 모성 관용을 유지 하기 위한 utero placental 인터페이스의 개발을 위한 호르몬 요인의 분 비에 대 한 책임이 있습니다.
Decidualization는 주입 및 후속 decidual 나선형 동맥의 리 모델링 필요 합니다. 자궁내 막 기질 세포 decidualization을, P4 및 캠프, 통제 생리 주기1의 후반 luteal 단계를 겪는 다. 이 프로세스는 주위 혈관 및 개장 하는 맥 관 구조에 규제를 밀매 하는 백혈구의 역할을 제안 하는 기질에 걸쳐 확산 시작 됩니다. 이 세포 변환 원형 형태, 증가 핵 크기 및 거친 바인딩과 그물 및 Golgi 기구2의 확장 특징 이다. Decidualized stromal 세포 paracrine 요인 blastocyst 이식 지원 수 있으며 수많은 호르몬 (즉, prolactin), 신생 성장 인자, 인슐린 성장 인자 의무적인 단백질-1의 분 비에 의해 특징 (IGFBP-1), 스타 글란 딘 (PG) E (세포내 캠프의 자극), cytokines, 세포 외 기질 구성 요소 및 태 반 착상 및 개발3,,45,6에 대 한 필수적인 영양소 .
Decidual 셀 인구 decidualized stromal 세포와 전적으로 이루어진 하지 하지만 또한 큰, 임신 특정 decidual 백혈구 인구를 포함 되어 있습니다. Decidualization 과도 지역화 된 부 종 및 자연적인 살인자 (NK) 세포, T 세포, 수지상 세포, 대 식 세포의 유입을 포함 됩니다. 가장 큰 백혈구 부분 모집단은 자 궁 NK 세포, cytokines의 소스는 decidua 및 신생 요인 decidualization 과정에서 원조 하 고 증가 수 있습니다 침투 모든 모성 백혈구의 약 50-70%를 구성 임신7전체 수입니다. 대 식 세포, 면역 세포의 두 번째로 큰 부분 모집단을 되 고 이식 사이트 발견 하 고 임신8증가. Cytokines의 근원 그리고 성장 요소 (CSF-1)9, 종양 괴 사 인자 α (TNFα)10 및 스타 글란 딘을 자극 하는 식민지 같은 요인 (PG) E11.
임신, 내내 그리고 기간 노동 전에 decidua cytokines 및 발산 모성 주변 백혈구 활성화 및 노동 시작 자 궁 조직으로 마이그레이션하기에 대 한 책임의 주요 원천이 다. 동물 연구를 보여주는 수많은 프로 염증 성 cytokines 있습니다 마우스 decidua에 최대 통제 노동, 동안와 같은 TNF-, 일리노이-6, 일리노이-12, IL-1b12. 인간의 decidua에서 프로 염증 성 cytokines 일리노이-1b, 일리노이-6와 IL-8 (주요 호 중구 chemoattractant) 노동13에 비해 노동 하는 동안 더 높은 식 전시. 이러한 decidual 조직14;으로 활성화 및 백혈구의 유입에서 cytokines 결과 분 비 myometrial 4-fold, 가 두 인접 한 자 궁 조직 사이 활성화의 나타내는 더 큰 앞 decidual 침투 기간 노동, 동안 decidual 대 식 세포와 두 인간 호 중구 침투와 쥐에서 증가 볼 15. 백혈구 침투 이러한 PGs myometrium16의 동기 수축 활성화의 생산, 매트릭스 metalloproteinases (MMPs) 막 시작17,18, 파열 뿐만 아니라 증폭 자 궁 활성화 과정 ('cytokine 폭풍우') 프로 염증 성 cytokines.
Decidual 세포 이식 과정, 초기 임신 기간에 노동의 활성화에 참여 하는 고에 산 모-신생아 공차를 유지에 중요 한 역할을 하는 등의 많은 중요 한 기능으로 인해 다른 병 리 중 발생할 수 있는 임신입니다. 예를 들어, 회귀 이식 실패와 반복 임신 손실 (1) 불 임; decidual 성숙의 오류 로부터 발생할 수 있습니다. (2) 자궁내 성장 금지 (IUGR)과 부적 절 한 개발 및 부전 decidua/태 반 또는; decidual myometrial에 손상 된 혈관 변환의 자간 전 증 (3) 조산 뿐만 아니라 있는 조기 decidual 활성화에서 발생할 수 있습니다.
이러한 주요 질환, 인간 생체 내에 연구의 윤리적이 고 실질적인 제한 함께 비추어 이해의 목적으로 생체 외에서 분석을 위해 필수적 이다 기본 인간 decidual 세포 라인을 설립 하 고 임신 합병증의 임상 관리를 개선. 따라서, 우리의 연구의 목적은 높은 셀 생산량 및 생존 기간 placentae의 태아 세포 막에서 수집 된 인간의 기본 decidual 셀의 격리에 대 한 허용 하는 프로토콜을 개발 했다. 이 현재 프로토콜 명확 하 게 설명 합니다 시간 및 비용 effective 메서드는 세포 decidual의 특정 하위의 분리에 대 한 생체 외에서 분석의 다양 한 사용 될. 풍부의 특성화 및 기간과 비교를 첫 번째 또는 두 번째 임신에서 decidual 부분 모집단의 표현 형 인간의 임신 기간 내내 그들의 역할을 정의 하는 데 중요 하다.

<table><tbody><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution with calcium and magnesium</td><td>Prepared in facility (LTRI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution without calcium and magnesium</td><td>Prepared in facility (LTRI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diaper pads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Large surgical scissors</td><td>AL Medical</td><td>2018-12-20.</td><td></td></tr><tr><td>Large surgical forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-18</td><td></td></tr><tr><td>Plastic disposable cell scraper (25 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>250 mm (size 60 mesh) metal sieve</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1020-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Disposable scalpel with plastic handle (#21)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td></td></tr><tr><td>Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz)</td><td>VWR</td><td>25384-146</td><td></td></tr><tr><td>Nylon filter (70 mm)</td><td>VWR/Corning</td><td>21008-952</td><td></td></tr><tr><td>Erythrocyte lysis buffer</td><td>Qiagen</td><td>79217</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, 0.4% solution</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Reichert</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media</td><td>Invitrogen</td><td>11835-055</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Wisent</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>Normocin (50mg/ mL)</td><td>Invivogen</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL)</td><td>Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase 2, lyophilized powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>Soy bean trypsin inhibitor, powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9003-250mg</td><td></td></tr><tr><td>DNase powder</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA powder)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Spinning disc confocal microscope - Leica DMI 6000B</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Flow cytometer - Image Stream MK2</td><td>Amnis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IDEA software</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>APC-conjugated Vimentin antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>IC2105A</td><td></td></tr><tr><td>APC H7-conjugated CD45 antibody</td><td>BD</td><td>641399</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated Cytokeratin antibody</td><td>MACs Miltenyi Biotec</td><td>130-080-101</td><td></td></tr><tr><td>PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody</td><td>Novus</td><td>NBP2-47941PCP</td><td></td></tr><tr><td>eFluor450 Fixable Viability dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65-0863-14</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin primary antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7558</td><td></td></tr><tr><td>CD45 primary antibody</td><td>Dako</td><td>M0701</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeratin primary antibody</td><td>Dako</td><td>M0821</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeratin 7 primary antibody</td><td>Dako</td><td>M7018</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>Goat IgG</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2028</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A10036</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 secondary antibody</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-11058</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of primary human decidual cells from the fetal membranes of term placentae

Decidua, 일컬어 임신 endometrium, 비판적으로 중요 한 생식 조직 이다. Decidualized stromal 세포와 면역 세포의 주로 구성 decidual 세포는 호르몬 및 염증 성 요소는 성공적인 blastocyst 주입, placental 개발에 대 한 중요 한 역할의 분 비에 대 한 책임은 용어 및 preterm 노동의 개시입니다. 많은 임신 합병증은 다른 세포 인구 decidua 구성의 정밀한 균형의 물결에서 발생할 수 있습니다. 특정 decidual 세포 유형의 비율 변경 수 있습니다 이러한 중요 한 프로세스를 방해 하 고 배아 이식 실패, 자궁내 성장 제한, 자간 전 증 임신의 심각한 합병증 개발의 위험을 증가 하 고 preterm 노동입니다. 여기에 설명 된 프로토콜 비용 및 기본 인간 decidual 세포의 고립에 대 한 효과적인 방법 용어 placentae의 태아 세포 막에서 수집 하는 시간을 보여 줍니다. 결합 하 여 효소 소화와 부드러운 기계적 장애 decidual 조직, 고수익 decidual 셀 chorion 오염 거의 없이 함께 얻은 것입니다. 중요 한 것은, 격리 decidual 셀 특징 이었다 (stromal 세포 (55-60%), 백혈구 (35%), trophoblast (0.01%) 세포 또는 상피 (1%)) 유지 높은 생존 능력 (80%)는 멀티 컬러 이미징 흐름 cytometry 분석 결과 의해 확인 되었다. 이 프로토콜에 decidua parietalis 이며 첫 번째 및 두 번째 임신 placentae을 적용할 수 있습니다. 절연, 일단 decidual 세포는 다양 한 임신 합병증에 다른 decidual 셀 부분 모집단의 역할을 이해 하는 것을 목표로 하는 실험적인 응용 프로그램에 대 한 사용할 수 있습니다.

효율성과 격리 된 셀의 유효성을 검사, 그들은 두 가지 방법으로 특징 했다: cytometry와 immunocytochemistry (ICC). 4 세포 인구를 표적으로 했다; 팬 백혈구 마커 CD45 decidual 면역 세포를 식별 하는 데 사용 되었다, cytokeratin 상피/내 피 세포를 감지 하는 데 사용 했다 및 cytokeratin 7 어떤 감지 하는 데 사용 되었다 마지막으로, decidualized stromal 세포 안티 vimentin 항 체에 의해 발견 된 잠?...

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Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

이 프로토콜은 응용 프로그램 (예: immunocytochemistry, cytometry, 등)의 다양 한 사용 될 수 있는 기간 placentae의 태아 세포 막에서 수집한 기본 인간 decidual 세포의 고립에 대 한 메서드를 보여 줍니다 목표로 임신 합병증에 다른 세포 인구의 역할 연구

기간 Placentae의 태아 세포 막에서 기본 인간 Decidual 세포의 고립

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

14.1K 조회수.  University of Toronto. 이 프로토콜은 응용 프로그램 (예: immunocytochemistry, cytometry, 등)의 다양 한 사용 될 수 있는 기간 placentae의 태아 세포 막에서 수집한 기본 인간 decidual 세포의 고립에 대 한 메서드를 보여 줍니다 목표로 임신 합병증에 다른 세포 인구의 역할 연구

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siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend diseases related to pregnancy. In this protocol, human primary villous cytotrophoblasts freshly isolated from placentas through a standard DNase/trypsin protocol are microporated with small interfering RNA (siRNA). This approach provided greater efficiency for siRNA transfection when compared to a lipofection-based method. Transfected cells can subsequently be analyzed by standard Western blot within a time frame of 3-4 days post-transfection. In addition, using cultured primary villous cytotrophoblasts, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) analysis was optimized and performed on extracts from days 1 to 4. The use of these cultured primary cells and the protocol described allow for an evaluation of the implication of specific genes and transcription factors in the process of villous cytotrophoblast differentiation into a syncytiotrophoblast-like cell layer. However, the limited time span allowable in culture precludes the use of methods requiring more time, such as generation of a stable cell population. Therefore testing of this cell population requires highly optimized gene transfer protocols.

This protocol describes a method for efficiently transfecting siRNA in freshly isolated human villous cytotrophoblasts using microporation and identifying DNA-protein complexes in these cells. Transfected cells can be monitored by Western blot and EMSA analyses during the 4-day culture time.

갓 고립 된 인간의 산모 Cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 및 EMSA 분석

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

연구

유전학

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

발생학

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density centrifugation, media gradient isolation and immunomagnetic purification. As observed in vivo, mononucleated villous cytotrophoblast cells in primary culture differentiate into multinucleated syncytiotrophoblast cells after 72 hr. Compared to normoxia (8% O2), villous cytotrophoblast cells that undergo hypoxia/reoxygenation (0.5% / 8% O2) undergo increased oxidative stress and intrinsic apoptosis, similar to that observed in vivo in pregnancy complications such as preeclampsia, preterm birth, and intrauterine growth restriction. In this context, primary villous trophoblasts cultured under hypoxia/reoxygenation conditions represent a unique experimental system to better understand the mechanisms and signalling pathways that are altered in human placenta and facilitate the search for effective drugs that protect against certain pregnancy disorders. Human villous trophoblasts produce melatonin and express its synthesizing enzymes and receptors. Melatonin has been suggested as a treatment for preeclampsia and intrauterine growth restriction because of its protective antioxidant effects. In the primary villous cytotrophoblast cell model described in this paper, melatonin has no effect on trophoblast cells in normoxic state but restores the redox balance of syncytiotrophoblast cells disrupted by hypoxia/reoxygenation. Thus, human villous trophoblast cells in primary culture are an excellent approach to study the mechanisms behind the protective effects of melatonin on placental function during hypoxia/reoxygenation.

This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.

인간의 기본 영양막 세포 멜라토닌에 대해 저산소증의 보호 효과를 연구하기 위해 세포 배양 모델 / 재산 소화에 의한 혼란

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

태반에서 조혈 줄기 세포의 분리 및 분석

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

생물학

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

마우스 자궁 내막 상피와 기질 세포의 분리에 대한<em&gt; 체외</em&gt; 탈락

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

세포 지질 방울의 분리 : 효모 세포와 인간의 태반에서 시작 두 정화 기술

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

생체공학

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for embryo implantation into the uterine lining of the maternal womb. Improper decidualization has been established as a root cause for implantation failure and subsequent early embryo miscarriage. Therefore, understanding the molecular mechanisms underlying decidualization is advantageous to improving the rate of successful births. In vivo based studies of artificial decidualization are often limiting due to ethical dilemmas associated with human research, as well as translational complications within animal models. As a result, in vitro assays through primary cell culture are often utilized to explore the modulation of decidualization via hormones. This study provides a detailed protocol for the isolation of HESC and subsequent artificial decidualization via the supplementation of hormones to the culturing medium. Further, this study provides a well-designed method to knockdown any gene of interest by utilizing lipid-based siRNA transfections. This protocol permits the optimization of culture purity as well as product yield, thereby maximizing the ability to utilize this model as a reliable method to understand the molecular mechanisms underlying decidualization, and the subsequent quantification of secreted agents by decidualized endometrial stromal cells.

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a validated and optimized procedure for the isolation and culture of human endometrial stromal cells to conduct in vitro decidualization assay. Further, this study provides a detailed method to efficiently knockdown a specific gene using siRNAs in human endometrial stromal cells.

생체 외에서 Decidualization에 대 한 인간의 자궁내 막 기질 세포의 고립

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

인간의 산모 - 태아 인터페이스에서 백혈구의 분리

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

면역학 및 감염병학

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

분리, 냉동 보존 및 문화 임상 응용 프로그램에 대한 인간 양막 상피 세포

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

의학

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

기본 마우스 Trophoblast 셀 및 Trophoblast의 침략 분석의 절연

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...