עבודה זו מומן על ידי נוירו-ביו בע מ ברצוננו להודות Ferrati ג'ובאני ד ר ד ר סרג'יו ברוטונדו (נוירו-ביו) הערות, עצות על כתב היד.

מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו.
הערה: בחלק זה, רצף השלבים העיקריים שבוצעו במהלך ההליך ניסיוני, מרווח הזמן המוצע הינו מסופק (איור 1). יתר על כן, תיאור צעד אחר צעד של הפרוטוקול בתוספת לוח המחשה, מציג פעולות קריטיות ועד המוח להסרת רקמות המגון לאחר תקופת הדגירה (איור 2). הפרטים לגבי חומרים ו הוראות לבנות את המנגנון ואת השלב שלאחר מכן לניתוח WB הם שתואר לעיל22.
1. כלי ניתוח, Vibratome הגדרות והכנה לטיפול
הערה: בצע את השלבים הבאים לפני תחילת ההליך ניסיוני:
<ol><li>להכין שני שונים מלאכותי מוחי שדרתי נוזלים (aCSFs), אחד משמש את המוח עם פרוסות ותיאר השני לשלב הדגירה כאמור29. בקצרה, ריכוז העבודה (ב mmol) aCSFs שני מיועדים כלנית חדד "חותך": 120 NaCl, 5 אשלגן כלורי, 20 NaHCO3, 2.4 CaCl2, 2 MgSO4, 1.2 ח'2PO4ו- 10 גלוקוז; 6.7 HEPES מלח וחומצה HEPES 3.3; pH: 7.1. זמן כלנית חדד "רישום": 124 NaCl, 3.7 אשלגן כלורי, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1.3 ח'2PO4ו גלוקוז 10; pH: 7.1.</li>
	<li>מערבבים היטב את הפתרונות ואז לשים קרח, חמצן של כלנית חדד עם פרוסות על מנת שיהיה קר בעת הסרת את המוח ואת חלוקתה עוקבות. לשמור בטמפרטורת החדר (RT), אספקת חמצן חנה המבר ההקלטה.</li>
	<li>מניחים את המכשירים מתחת למכסה המנוע לנתיחה עבור הסרת עריפת ראש ומוח, קרי, גיליוטינה, ערכת חיתוך כירורגי (מספריים, מלקחיים, להבים), מרית.</li>
	<li>הגדר את פרמטרי vibratome על-ידי בחירת פרוסה בעובי (300 מיקרומטר בהכנה זו) ואת התדירות-7 ואת המהירות ב-6. הוספת תא vibratome בחלל המתאים שלה, להקיף אותו עם קרח.</li>
	<li>. פתח את הברז carbogen (95% או2, 5% CO2) לחמצן את "חיתוך" (חנה המבר) במהלך חלוקתה המוח בחר את קצב זרימה מינימלית, סביב 2 mL/min.</li>
	<li>קח שני צינורות 15-mL כדי להכין את התנאים כדי לבדוק. הוסף בשפופרת אחת 10 מיליליטר "רישום" כלנית חדד לבד (קבוצת הביקורת) וב -האחר, 10 מ"ל של כלנית חדד"רישום"מועשר T30-ריכוז של 2 מיקרומטר (קבוצת מטופלים). מערבולת שני צינורות, לשמור אותם על קרח עד השימוש בהם במסגרת שלב הכנת ההתקנה (סעיף 3).</li>
</ol>2. הרדמה, המוח החילוץ וחלוקת
הערה: במחקר זה, 9 פראי סוג P14 הגברית Wistar חולדות שימשו. המוח החילוץ וחלוקת הבאים מהווים חלק הכרחי של הפרוטוקול מאז הם במהירות לבצע (במרחק של 10 דקות) על מנת למנוע או לפחות להאט תהליכי ניוון רקמות.
<ol><li>להוסיף 1.5 מ ל 100% w/w של איזופלוריין על שכבה כותנה אל החדר אינדוקציה, למקם את. החיה בפנים, סגור את המכסה. המתן עד החיה עמוק הוא מורדם, המאשרת רפלקס פדלים, העדר, אז לכרות את החיה באמצעות הגיליוטינה.</li>
	<li>. תמשיך הראש של החיה בתוך סיר המכילה קרח לחבר חנה המבר במהלך השלב הסרת המוח (איור 2 א -C).</li>
	<li>תחתכי את העור על פני הגולגולת עם להב כירורגי, ואז לחתוך את הגולגולת באמצעות מספריים בעקבות האמצע, מן החלק האחורי והמשך anteriorly עד שהגיע העצם מעל מכשול (איור 2 א).</li>
	<li>משוך רוחבית שני הצדדים של הגולגולת בעזרת זוג מלקחיים כדי לקבל גישה אל המוח (איור 2B). הכנס מרית ventrally אל המוח, סקופ בעדינות החוצה, ושומרים את שזה להתייבש תוך קר כקרח יצחק "חותך" גרגיר במשך כ 5 דקות (איור 2C).</li>
	<li>תשליך את המוח על נייר סינון, לחתוך את המוח הקטן באמצעות להב (איור דו-ממדי). הדבק את המוח בצורה אנכית על הדיסק vibratome להוסיפו בתוך החדר אופטים, למלא אותו קר כקרח "חותך" כלנית חדד ו לספק חמצן (2E איור).</li>
	<li>. להתאים את מרווח חיתוך ולהמשיך חלוקתה המוח (2F איור). לאסוף את הסעיפים המכיל אזור מעניינים, כמו מחצה המדיאלי (MS), פס אלכסוני של ברוקה (DBB) ולאחר הסובסטנציה innominata (SI), כפי שתואר לעיל22. מלמעלה למטה, שלוש פרוסות להכיל את rostral (R), בינוני (I), (ג) סימטרית, חלק BF (איור 2G).</li>
	<li>לחלק לאורך קו האמצע כל מקטע עם מספריים קטנות, קבלת שני סימונים hemislices (איור 2 H), משמש בנפרד הפיקוח ואת תנאי שטופלו על אותו מישור אנטומיים.</li>
	<li>לשמור את hemisections בבית הבליעה vibratome למשך 5-10 דקות, ולאחר מכן להעביר אותם באמצעות פיפטה מזכוכית לתוך סיר מבעבע המכיל הקלטה כלנית חדד. שמור ב RT כ 30 דקות כדי להתאושש.</li>
	<li>למלא, בינתיים, שלוש מבחנות זכוכית עם 3 מ"ל של הקלטה חנה המבר לבד (בעבר להכין בשלב 1.6 עבור קבוצת הביקורת), שלוש מבחנות עם 3 מ של חנה המבר מועשר T30 (בעבר להכין בשלב 1.6) עבור קבוצת מטופלים.</li>
</ol>3. הגדרת הכנה
<ol><li>להעביר את hemisections לתוך צלוחיות זכוכית המתאימים שלהם (איור 2I) על מנת לקבל שלושה hemislices רצופים (כולל אזור BF rostral ביניים, סימטרית) עבור קבוצת הביקורת (מסגרת ירוקה, איור 2J) שלהם התאמת עמיתיהם עבור קבוצת מטופלים (מסגרת אדומה, איור 2J).</li>
	<li>העברה על רקמת המוח עם שתי מברשות שונות, אחת hemislices שליטה והשניה עבור עמיתיהם שטופלו, כדי למנוע כל זיהום בין תנאי.</li>
	<li>חותם כל בקבוקון זכוכית עם מכסה המתאים, מציגים את המחט oxygenating (21 גרם) (דמות 2J). לחבר את הצינור הראשי של המנגנון המקור carbogen (איור 2 K). לספק חמצן hemislices לאורך כל תקופת הדגירה עם קצב זרימה מינימלית של 2 מ לדקה על מנת למנוע כל תנועה של רקמת המוח, פגיעה מכנית אפשרית במהלך הניסוי. תתחיל הדגירה 5 שעות. בצע את השלבים 3.1-3.3 בתוך 5 דקות. הערה: סימון לעתים קרובות (כל 15-20 דקות) אם החמצן המסופקת לתוך כל הבקבוקונים, כי הזרימה שלו לא זזה הרקמה מלמטה.</li>
</ol>4. דוגמת המגון
<ol><li>מפסיקים את זרימת החמצן לאחר הדגירה ולהסיר את כל המכסים הבקבוקונים. להעביר את hemislices, באמצעות מברשות נכונה, לתוך צינורות 1.5 mL המכיל 250 µL מאגר פירוק, שמירה על הצינורות על קרח (איור 2 L). כדי להפוך את פירוק מאגר, לערבב PBS 1 x עם קוקטיילים מעכבי פוספטאז, פרוטאז מדולל-מטריים, והן homogenize הרקמה עם בקווקז שונים למניעת זיהום בין הדגימות. להשלים את פעולות אלה תוך 10-15 דקות.</li>
	<li>Centrifuge המוח lysate-1000 g x עבור 5 דקות ב 4 º C. להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינורות חדשים, שומרים את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>5. קריאה של חלבונים ריכוז וניתוח תספיג חלבון
<ol><li>לקבוע את ריכוז חלבון כל דגימה, לאחר מכן להכין את aliquots לניתוח תספיג כפי שתואר לעיל22.</li>
	<li>לבצע ניתוח סטטיסטי כדי להעריך את השפעת הטיפול על ביטוי חלבון.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+stageing+of+Alzheimer-related+changes.">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathologica. 82 (4), 239-259 (1991).</li><li>Schliebs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+forebrain+cholinergic+dysfunction+in+Alzheimer's+disease--interrelationship+with+beta-amyloid,+inflammation+and+neurotrophin+signaling.">Basal forebrain cholinergic dysfunction in Alzheimer's disease--interrelationship with beta-amyloid, inflammation and neurotrophin signaling.</a> Neurochemical Research. 30 (6-7), 895-908 (2005).</li><li>Schmitz, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+forebrain+degeneration+precedes+and+predicts+the+cortical+spread+of+Alzheimer's+pathology.">Basal forebrain degeneration precedes and predicts the cortical spread of Alzheimer's pathology.</a> Nature Communications. 7, 13249 (2016).</li><li>Fjell, A. M., McEvoy, L., Holland, D., Dale, A. M., Walhovd, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+normal+in+normal+aging?+Effects+of+aging,+amyloid+and+Alzheimer's+disease+on+the+cerebral+cortex+and+the+hippocampus.">What is normal in normal aging? Effects of aging, amyloid and Alzheimer's disease on the cerebral cortex and the hippocampus.</a> Progress in neurobiology. 117, 20-40 (2014).</li><li>Kov&#225;cs, T., Cairns, N. J., Lantos, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+centres+in+Alzheimer's+disease:+olfactory+bulb+is+involved+in+early+Braak's+stages.">Olfactory centres in Alzheimer's disease: olfactory bulb is involved in early Braak's stages.</a> Neuroreport. 12 (2), 285-288 (2001).</li><li>Winblad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defeating+Alzheimer's+disease+and+other+dementias:+a+priority+for+European+science+and+society.">Defeating Alzheimer's disease and other dementias: a priority for European science and society.</a> The Lancet Neurology. 15 (5), 455-532 (2016).</li><li>Herrup, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+case+for+rejecting+the+amyloid+cascade+hypothesis.">The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis.</a> Nat Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).</li><li>De Strooper, B., Karran, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+Phase+of+Alzheimer's+Disease.">The Cellular Phase of Alzheimer's Disease.</a> Cell. 164 (4), 603-615 (2016).</li><li>Scheltens, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease.">Alzheimer's disease.</a> Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).</li><li>Arendt, T., Br&#252;ckner, M. K., Lange, M., Bigl, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+acetylcholinesterase+and+butyrylcholinesterase+in+Alzheimer's+disease+resemble+embryonic+development-A+study+of+molecular+forms.">Changes in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in Alzheimer's disease resemble embryonic development-A study of molecular forms.</a> Neurochemistry International. 21 (3), 381-396 (1992).</li><li>Auld, D. S., Kornecook, T. J., Bastianetto, S., Quirion, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+and+the+basal+forebrain+cholinergic+system:+relations+to+&#946;-amyloid+peptides,+cognition,+and+treatment+strategies.">Alzheimer's disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to &#946;-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies.</a> Progress in Neurobiology. 68 (3), 209-245 (2002).</li><li>Arendt, T., Bruckner, M. K., Morawski, M., Jager, C., Gertz, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+neurone+loss+in+Alzheimer's+disease:+cortical+or+subcortical?.">Early neurone loss in Alzheimer's disease: cortical or subcortical?.</a> Acta Neuropathol Commun. 3, 10 (2015).</li><li>Mesulam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cholinergic+Lesion+of+Alzheimer's+Disease:+Pivotal+Factor+or+The+Cholinergic+Lesion+of+Alzheimer's+Disease:+Pivotal+Factor+or+Side+Show?.">The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or Side Show?.</a> Learn Mem. , 43-49 (2004).</li><li>Schliebs, R., Arendt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cholinergic+system+in+aging+and+neuronal+degeneration.">The cholinergic system in aging and neuronal degeneration.</a> Behavioural Brain Research. 221 (2), 555-563 (2011).</li><li>Mesulam, M. M., Mufson, E. J., Wainer, B. H., Levey, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+cholinergic+pathways+in+the+rat:+An+overview+based+on+an+alternative+nomenclature+(Ch1-Ch6).">Central cholinergic pathways in the rat: An overview based on an alternative nomenclature (Ch1-Ch6).</a> Neuroscience. 10 (4), 1185-1201 (1983).</li><li>Mesulam, M., Mufson, E. J., Levey, A. I., Wainer, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+innervation+of+cortex+by+the+basal+forebrain:+cytochemistry+and+cortical+connections+of+the+septal+area,+diagonal+band+nuclei,+nucleus+basalis+(substantia+innominata),+and+hypothalamus+in+the+rhesus+monkey.">Cholinergic innervation of cortex by the basal forebrain: cytochemistry and cortical connections of the septal area, diagonal band nuclei, nucleus basalis (substantia innominata), and hypothalamus in the rhesus monkey.</a> J Comp Neurol. 214 (2), 170-197 (1983).</li><li>Greenfield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+and+targeting+the+basic+mechanism+of+neurodegeneration:+The+role+of+peptides+from+the+C-terminus+of+acetylcholinesterase:+Non-hydrolytic+effects+of+ache:+The+actions+of+peptides+derived+from+the+C-terminal+and+their+relevance+to+neurodegenerat.">Discovering and targeting the basic mechanism of neurodegeneration: The role of peptides from the C-terminus of acetylcholinesterase: Non-hydrolytic effects of ache: The actions of peptides derived from the C-terminal and their relevance to neurodegenerat.</a> Chemico-Biological Interactions. 203 (3), 543-546 (2013).</li><li>Garcia-Rat&#233;s, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(I)+Pharmacological+profiling+of+a+novel+modulator+of+the+&#945;7+nicotinic+receptor:+Blockade+of+a+toxic+acetylcholinesterase-derived+peptide+increased+in+Alzheimer+brains.">(I) Pharmacological profiling of a novel modulator of the &#945;7 nicotinic receptor: Blockade of a toxic acetylcholinesterase-derived peptide increased in Alzheimer brains.</a> Neuropharmacology. 105, 487-499 (2016).</li><li>Eimerl, S., Schramm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantity+of+calcium+that+appears+to+induce+neuronal+death.">The quantity of calcium that appears to induce neuronal death.</a> Journal of neurochemistry. 62 (3), 1223-1226 (1994).</li><li>Greenfield, S., Vaux, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commentary+Parkinson's+Disease,+Alzheimer's+Disease+and+Motor+Neurone+Disease:+Identifying+a+Common+Mechanism.">Commentary Parkinson's Disease, Alzheimer's Disease and Motor Neurone Disease: Identifying a Common Mechanism.</a> Science. 113 (3), 485-492 (2002).</li><li>Badin, A. S., Morrill, P., Devonshire, I. M., Greenfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(II)+Physiological+profiling+of+an+endogenous+peptide+in+the+basal+forebrain:+Age-related+bioactivity+and+blockade+with+a+novel+modulator.">(II) Physiological profiling of an endogenous peptide in the basal forebrain: Age-related bioactivity and blockade with a novel modulator.</a> Neuropharmacology. 105, 47-60 (2016).</li><li>Brai, E., Stuart, S., Badin, A. -. S., Greenfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Ex+Vivo+Model+to+Investigate+the+Underlying+Mechanisms+in+Alzheimer's+Disease.">A Novel Ex Vivo Model to Investigate the Underlying Mechanisms in Alzheimer's Disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 291 (2017).</li><li>Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+slices+as+models+for+neurodegenerative+disease+and+screening+platforms+to+identify+novel+therapeutics.">Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics.</a> Current neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).</li><li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+A+review.">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).</li><li>Jensen, M. S., Lambert, J. D. C., Johansen, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recordings+from+rat+hippocampus+slices+following+in+vivo+brain+ischemia.">Electrophysiological recordings from rat hippocampus slices following in vivo brain ischemia.</a> Brain Research. 554 (1-2), 166-175 (1991).</li><li>Ferrati, G., Martini, F. J., Maravall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Adenosine+Receptor-Mediated+Regulation+of+Diverse+Thalamocortical+Short-Term+Plasticity+in+the+Mouse+Whisker+Pathway.">Presynaptic Adenosine Receptor-Mediated Regulation of Diverse Thalamocortical Short-Term Plasticity in the Mouse Whisker Pathway.</a> Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-9 (2016).</li><li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSDI:+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics.">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).</li><li>Badin, A. S., John, E., Susan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+spatio-temporal+bioactivity+of+a+novel+peptide+revealed+by+optical+imaging+in+rat+orbitofrontal+cortex+in+vitro:+Possible+implications+for+neurodegenerative+diseases.">High-resolution spatio-temporal bioactivity of a novel peptide revealed by optical imaging in rat orbitofrontal cortex in vitro: Possible implications for neurodegenerative diseases.</a> Neuropharmacology. 73, 10-18 (2013).</li><li>Greenfield, S. A., Badin, A. S., Ferrati, G., Devonshire, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+rat+brain+suggests+a+previously+missing+link+between+top-down+and+bottom-up+nervous+system+function.">Optical imaging of the rat brain suggests a previously missing link between top-down and bottom-up nervous system function.</a> Neurophotonics. 4, 31213 (2017).</li><li>Opitz-Araya, X., Barria, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Organotypic hippocampal slice cultures.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (48), (2011).</li><li>Gong, C. -. X., Lidsky, T., Wegiel, J., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolically+active+rat+brain+slices+as+a+model+to+study+the+regulation+of+protein+phosphorylation+in+mammalian+brain.">Metabolically active rat brain slices as a model to study the regulation of protein phosphorylation in mammalian brain.</a> Brain Research Protocols. 6 (3), 134-140 (2001).</li></ol>

המחברים מצהירים אינטרסים כלכליים מתחרים. סוזן א גרינפילד הוא מייסד נשיא מוגבלת נוירו-ביו, חברה בבעלות פרטית, מחזיק במניות החברה. כוח המוח עמנואלה, אנטונלה Cogoni עובדים של נוירו-ביו בע מ

ההיבט העיקרי של פרוטוקול זה, המבוסס על טכניקת המוח ומבוססת ex-vivo , מאפשר לבחון באופן סינכרוני שני hemislices סימונים, המתקבל אותו מישור אנטומיים, ניטור התגובה שלהם לאחר היישום של ספציפי תנאי (לשלוט או לטפל); זה מציע לכן פרדיגמה נסיונית מבוקר חזק ככל האפשר. האפשרות של הערכת פעם, מינון-ו באופן ס?...

המודעה היא שמחלה כרונית המאופיינת על ידי ליקוי ניווניות הדרגתית להשפיע על אזורים שונים במוח, כגון entorhinal קליפת (EC), BF, ההיפוקמפוס (HC) וכן הריח הנורה (אבוב)1,2,3, 4,5. כך שהאח של AD התפתחות להוביל ירידה קוגניטיבית מתקדמת, גורם מחלה זו הצורה הנפוצה ביותר של דמנציה, והיוו כ-70% של המקרים כל6. למרות ניסיונות נרחב להבין בשלבים הראשונים גורם לספירה, אין כרגע אינדיקציה ניסיוני מוגדר שחקרתי אותם. בנוסף, התיאוריה המקובלת ביותר - "עמילואיד ההשערה" - נחקרת יותר ויותר מאז הוא אינו מספק פרופיל מלא להסביר את pathobiology לספירה, ולא מטרה התרופות הוכיח יעילות7,8 ,9.
תיאוריה חלופית אשר מקבל תשומת לב גדלה והולכת מרמז כי המנגנון הראשוני המתרחשים במהלך הקשורים ניוון מוחיים הקשורים מקבץ עצביים רגישים בעיקר לספירה3,10,11 , 12 , 13 , 14. רכזת הסלולר הטרוגנית זו הקיפה במסגרת הפרויקטים BF, המוח האמצעי, גזע המוח, באזורים מרובים, כגון ה EC, HC ו- OB15,16. למרות המגוון שלה מורפולוגיה עצביים, סינתזה נוירוטרנסמיטר, הגרעין של תאים משתף תכונה נפוצה לבטא כאב, אשר יכול להיות גם של פונקציה אנזימטי17,18. התפקיד-קלאסי זה כמו רומן איתות מולקולה שמתווכת סידן (Ca2 +) מזרימה נוירונים אשר יכול לחוות אירועים עם מחלות או רעילים ביחס במינון2 + Ca, זמינות ו עצביים בגיל17,18 , 19.
במהלך הקשורים ניוון מוחיים, אובדן תאי שנצפה יכול להיות לכן קשור עם זה פונקציה שאינה אנזימטי17,18,20, אשר אינה משרתת פפטיד 30mer (T30) ביקע מ כאב קרבוקסילי 20. בקנה אחד עם תוצאות קודמות, נישא על תרבית תאים וההכנות אופטי הדמיה18,21 , הפגנו, באמצעות גישה חדשנית המבוססת על שמחוץ עכברוש המוח פרוסות המכילות מבנים BF, שהביאה T30 המודעה דמוי22. באופן ספציפי, מתודולוגיה חדשה זו מציעה תרחיש פיזיולוגית יותר מאשר תרבית תאים מאז זה משמר רבים מהמאפיינים של רקמות ללא פגע, ועד אנטומי שימור המעגלים, גם אם עבור חלון זמן של שעות. אנחנו מוחלים פרוטוקול זה לחקור את האירועים המתרחשים במהלך השלבים המוקדמים של הקשורים ניוון מוחיים, ניטור התגובה חריפה עם יישום T30.
למרות גוף גדול של הספרות על משתמש במוח פרוסות לחקור מסלולים מולקולריים נרמז נזקים עצביים או23,נוירוג'נסיס24, פרוטוקול זה מספק בפעם הראשונה מיידי יותר, רגיש הקריא בהשוואה לשימוש משותף של פרוסות organotypic. עם זאת, כפי שקורה organotypic מקטעים המוח, הליך חריפה פרוסה יכול גם להיות מאומץ למספר מטרות, כגון הערכת neuroprotective או מולקולות העצבים, גילוי ראשוני השינויים המולקולריים המתרחשים תהליך ספציפי, immunohistochemical ניתוח ולאחר מבחני תרופתי על מערכת העצבים המרכזית הקשורים פתולוגיות.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>S7653</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>P9333</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>S5761</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O))</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>63138</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>P5655</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>Hepes salt</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>H7006</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>Hepes acid</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>H3375</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>G7528</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>Calcium chloride dehydrate</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>223506</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>T30 peptide</td><td>Genosphere Biotechnologies, France</td><td></td><td>AChE-derived peptide tested</td></tr><tr><td>Surgical dissecting kit</td><td>World Precision Instruments, USA</td><td>Item #: MOUSEKIT</td><td>Brain removal step</td></tr><tr><td>Surgical blades</td><td>Swann-Morton, UK</td><td>BS 2982</td><td>Brain removal step</td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>11566873</td><td>Brain preparation for slicing</td></tr><tr><td>Glue</td><td></td><td></td><td>Brain preparation for slicing</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica, Germany</td><td>VT1000 S</td><td>Slicing</td></tr><tr><td>Brushes</td><td></td><td></td><td>Tissue handling</td></tr><tr><td>Oxygen canister</td><td></td><td></td><td>Sectioning and incubation phase</td></tr><tr><td>1x Phosphate buffer saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>BP2438-4</td><td>Homogenization step</td></tr><tr><td>Phosphatase inhibitors</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>1284-1650</td><td>Homogenization step</td></tr><tr><td>Protease inhibitors</td><td>Roche complete PIC, USA</td><td>4693116001</td><td>Homogenization step</td></tr><tr><td>Pestles</td><td>Starlab, UK</td><td>I1415-5390</td><td>Homogenization step</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce 660 nm Protein Assay</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>22660</td><td>Protein concentration</td></tr></tbody></table>

an alternative approach to study primary events in neurodegeneration using ex vivo rat brain slices

למרות מחקרים רבים המנסים לפתח מודלים אמינים בעלי חיים אשר המשקף העיקרית תהליכים הקשורים ניוון מוחיים הבסיסית, מעטים התקבלו באופן נרחב. כאן, אנו מציעים הליך חדש מקורי ידועים שמחוץ המוח פרוסה הטכניקה, אשר מציעה יישום קרוב ויוו-כמו לתרחיש יותר במבחנה הכנות, על חקירת האירועים בתחילת מפעילה ניוון תאים, כמו נצפתה מחלת אלצהיימר (AD). וריאציה זו כוללת צעדים לשחזור בקלות ופשוט, המאפשר שימור cytoarchitecture האנטומי של האזור שנבחר המוח ופונקציונליות המקומית שלה וחשש פיזיולוגיים. ניתן להשיג במגוון תחומים אנטומיים המוח באותו, מתן האפשרות לבצע ניסויים מרובים עם הטיפולים המדובר האתר - מינון-, באופן תלוי-זמן. מגבלות פוטנציאליים, אשר עלול להשפיע על התוצאות הקשורות מתודולוגיה זו קשורים שימור הרקמה, קרי, שמירה על שלמותה אנטומי במהלך השלבים הדגירה וגזירה, העובי סעיף, אשר יכול להשפיע על הניתוח הביוכימי ו- immunohistochemical. גישה זו יכולה להיות מועסק למטרות שונות, כגון חקר המנגנונים המולקולריים המעורבים בתנאים פיזיולוגיים או פתולוגית, והתרופות הקרנה או מבחני מנה-תגובה. לבסוף, פרוטוקול זה גם יכול להפחית את מספר בעלי חיים המועסקים במחקרים התנהגותיים. היישום דיווחו כאן שתוארו לאחרונה ובדק בפעם הראשונה ב- ex-vivo עכברוש המוח פרוסות המכילות הקדמי הבזליים (BF), אשר הוא אחד האזורים במוח מושפע בעיקר לספירה. באופן ספציפי, זה הוכח כי הממשל של פפטיד רעילים שמקורם את קצה קרבוקסילי של אצטילכולין אסטראז (AChE) יכול לבקש פרופיל כמו AD, מפעילה, לאורך ציר גישה antero-אחוריים BF, ביטוי דיפרנציאלי של חלבונים שינו לספירה, כגון הקולטן nicotinic alpha7 (α7-nAChR), phosphorylated טאו (p-טאו), עמילואיד ביתא (Aβ).

פרוטוקול המובאת כאן מציין כי הממשל של פפטיד רעילים, T30, שמחליש באופן תלוי-אתר הביטוי של α7-nAChR, p-טאו, ו Aβ במקטעים המכילים BF (איור 3 א). הקולטן nicotinic מציג עלייה משמעותית hemislice rostral שטופלו לעומת המקביל שליטה (פרוסה 1, p = 0.0310) (איור 3B), בעוד הפרוסה...

Watch this Scientific Journal Video about An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices at JoVE.com

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

אנו מציגים שיטה אשר יכול לספק עוד תובנות האירועים בתחילת שבבסיס הקשורים ניוון מוחיים, המבוססת על הטכניקה המוח הוקמה לשעבר-vivo , המשלב את היתרונות של ניסויים ב- vivo ו- in vitro לקשרי . יתר על כן, הוא מייצג הזדמנות ייחודית השוואה ישירה של קבוצת טיפול ללא טיפול באותו מישור אנטומיים.

גישה חלופית ללמוד העיקרי אירועים הקשורים ניוון מוחיים לשעבר Vivo עכברוש המוח בפרוסות

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

an-alternative-approach-to-study-primary-events-neurodegeneration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

6.9K Views.  Culham Science Centre. אנו מציגים שיטה אשר יכול לספק עוד תובנות האירועים בתחילת שבבסיס הקשורים ניוון מוחיים, המבוססת על הטכניקה המוח הוקמה לשעבר-vivo , המשלב את היתרונות של ניסויים ב- vivo ו- in vitro לקשרי . יתר על כן, הוא מייצג הזדמנות ייחודית השוואה ישירה של קבוצת טיפול ללא טיפ?...

Video: An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

תרבויות Organotypic Slice ללימודים של אחרי לידה נוירוגנזה

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Developmental Biology

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

פורסים תרבות Organotypic של E18 מוח החולדה

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Biology

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

הכנת פרוסות בהיפוקמפוס של חולדות חריפה העכברים הטרנסגניים לחקר שינויים Synaptic במהלך ההזדקנות עמילואיד פתולוגיה

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

הפעלת יתר רעיל גירוי של המוח כMicroslices<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של שבץ

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Medicine

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

המוח פרוס Biotinylation:<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גישה למדוד סחר חלבון פלזמה ממברנה אזור ספציפי בתאי עצב בוגרים

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

תרבויות Organotypic Slice ניתוח של עצבים וכלי דם שיפוץ בEntorhino-היפוקמפוס

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

הכנת פרוסות המוח חריפה באמצעות אופטימיזציה N-מתיל-D-שיטת שחזור מגן glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Preparing Acute Brain Slices from the Dorsal Pole of the Hippocampus from Adult Rodents

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of cellular and synaptic properties. Nevertheless, there is an ever increasing need to perform correlated analyses between different experimental modes in addition to slice electrophysiology, for example: immunohistochemistry, molecular biology, in vivo imaging or electrophysiological recording; to answer evermore complex questions of brain function. However, making meaningful conclusions from these various experimental approaches is not straightforward, as even within relatively well described brain structures, a high degree of sub-regional variation of cellular function exists. Nowhere is this better exemplified than in the CA1 of the hippocampus, which has well-defined dorso-ventral properties, based on cellular and molecular properties. Nevertheless, many published studies examine protein expression patterns or behaviorally correlated in vivo activity in the dorsal extent of the hippocampus; and explain findings mechanistically with cellular electrophysiology from the ventro-medial region. This is further confounded by the fact that many acute slice electrophysiological experiments are performed in juvenile animals, when other experimental modes are performed in more mature animals. To address these issues, this method incorporates transcardial perfusion of mature (&#62;60 day old rodents) with artificial cerebrospinal fluid followed by preparation of modified coronal slices including the septal pole of the dorsal hippocampus to record from CA1 pyramidal cells. This process leads to the generation of healthy acute slices of dorsal hippocampus allowing for slice-based cellular electrophysiological interrogation matched to other measures.

The purpose of this protocol is to describe a method to produce slices of the dorsal hippocampus for electrophysiological examination. This procedure employs perfusion with chilled ACSF prior to slice preparation with a near-coronal slicing angle which allows for preservation of healthy principal neurons.

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

חריף המוח עכבר חותכת לחקור פעילות רשת היפוקמפוס ספונטנית

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Neuronal Death Assay to Evaluate Cell Death in Ex Vivo Epilepsy Model

Source: Carvalho, M., et al., <a href="https://app.jove.com/v/61330">A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures.</a> J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the technique of assessing neuronal death in rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Neuronal death occurs via evolving epileptic seizures &#8212; resembling in vivo epilepsy &#8212; and is detected through dual-staining of the dead cells using propidium iodide and immunofluorescence.

גישה חלופית ללמוד העיקרי אירועים הקשורים ניוון מוחיים לשעבר Vivo עכברוש המוח בפרוסות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video