FG נתמכת על ידי Associazione Italiana לכל החיפוש אחר לה סול Cancro (IG 2016Id.18842), קרן Cariplo (גרנט 2014-0655) דל'אנג'לו Regionale לכל la החיפוש אחר Biomedica (FRRB). איז נתמך על-ידי NIH גרנט 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 גרנט, הרווארד בית הספר לרפואה מילטון נמצאו פרסי מחקר בכיר CCFA (412708), אלינור, החוף Miles תכנית העמיתים יום הנישואין ה-50 שלהם, את (קרן Cariplo 2014-0859).

כל ההליכים היו מאושרים תחת טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש הוועדה (IACUC) ולא פעלו תחת פיקוחו של המחלקה של משאבים בעלי חיים לילדים חולים (קשת) בבית החולים לילדים בבוסטון או אושרו על-ידי האיטלקי משרד הבריאות והופיע תחת מוסדיים חיה טיפול הוועדה ב האוניברסיטה של מילאנו-ביקוקה.
1. הכנה ג אלביקנס
<ol><li>תרבות ג אלביקנס, זן CAF3-113, צינורות המכילות בינוני עשיר (דקסטרוז peptone תמצית שמרים (YEPD), תמצית שמרים 1% (w/v), 2% (w/v) מה נשארתי Peptone, 2% (w/v) גלוקוז) בתוספת uridine (50 מ"ג/ליטר) ב 25 º C. בתנאים אלה אלביקנס ג גדל כמו שמרים. הערה: זנים אחרים אלביקנס ג יכול לשמש, כגון זן SC5314 אלביקנס ג 13לבודד קליני. מאז לאחרונה הראו כי התהליך כיבית הנגרמת על ידי הפעלת מערכת החיסון המולדת14, תיאורטית כל זן אלביקנס ג המתחזק את רכיבי קיר התא והן המבנה, כמו גם היכולת מקורם ההקרנות hyphal, יכול לשמש.</li>
	<li>נטר את התרבות על ידי ספירת הריכוז הסלולר באמצעות מנתח מונה תא.</li>
	<li>הקציר התרבות כאשר הוא מגיע ריכוז של 8 x 106 תאים למ"ל. לחלופין, השתמש ספקטרופוטומטרים כדי למדוד את יתר600. הערה: בדרך כלל, ערך של יתר600 = 1 מקביל ריכוז השמרים של 3 x 107 תאים למ"ל, אך מומלץ טיטור.</li>
	<li>Resuspend התרבות YEPD-uridine בינוני, באמצעות HEPES (50 מ מ, pH 7.5) כסוכן מאגר, דגירה התרבות ב 37 ° C כדי לעודד היווצרות hyphae. בדוק היווצרות hyphal תחת מיקרוסקופ בהגדלה X 100. צורה hyphal היא גלויה 5 שעות לאחר culturing ב 37 מעלות צלזיוס; עם זאת, להשתמש התאים 16 h לאחר דגירה ב 37 מעלות צלזיוס כאשר האחוז hyphal מגיע כמעט 95% של התרבות הכולל.</li>
	<li>להעשיר עוד את ההכנה בריכוז hyphal, צנטריפוגה aliquots של התרבות-3,300 g x עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב- PBS סטרילי-ריכוז של עונה 1 פרק 108 hyphae/mL....</li>
</ol>2. הזרקת עורי עמוק
<ol><li>24 שעות לפני ההליך זיהום, עזים ומתנגד העכברים עם זריקה בקרום הבטן של קטאמין (80-100 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/ק"ג), ואז מגלחים את האגף של העכברים באמצעות של קוצץ חשמלי. הערה: לאחר כל נוהל הכרוכים בהרדמה, הנח העכברים תחת מנורת חימום עד הם התאוששו ביעילות.</li>
	<li>שאר העכברים במשך 24 שעות ביממה למנוע כל דלקת עקב תהליך הגילוח.</li>
	<li>24 שעות לאחר הניתוח גילוח, עזים ומתנגד העכברים עם זריקה בקרום הבטן של קטאמין (80-100 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/ק"ג).</li>
	<li>בדוק את רפלקס כפה על מנת להבטיח כי העכברים הם מרדימים עמוקות. להעריך את רפלקס פאו מאת בחוזקה צובט את כף הרגל. אם ההרדמה מושגת, החיה לא להרגיש כאב, לא זזה.</li>
	<li>מזריקים hyphae אלביקנס ג ב למחרת עמוק באמצעות מזרק אינסולין 0.3 mL עם מחט 30 G x 8 מ מ נפח סופי של 50 µL הזרקה, המקביל 5 x 106 hyphae הזרקה.<ol>
<li>משוך את העור של האגף מגולח מתוח בעזרת שתי אצבעות כדי להזריק את עוצמת הקול ישירות בלמחרת היום עמוק. הכנס את המחט עם זווית של 10-15° עם שפוע של המחט פונה כלפי מעלה.</li>
		<li>בזווית זו, המחלה להיות מוזרק עם עומק של 300-500 מיקרומטר. כדי להבטיח שההזרקה מבוצעת טוב, בדוק האחסון מוזרק יוצר בליטה זה נספג כמה דקות לאחר ההזרקה. הערה: בליטה נוצרו לאחר הזריקה יהיה של 1 ס מ.2. זהו האזור יוסר בנקודת הזמן המיועד לבדיקה היסטולוגית או מולקולרית.</li>
		<li>נקודות זמן על פחות מ 24 שעות (מומלץ) לסמן את האזור של זיהום עם עט מרקר, מאז המכשול הקים עם ההזרקה נמשכת לכמה דקות, אחרי אשר נספגות. עבור נקודות זמן של 24 שעות או יותר, שלב זה אינו נדרש, כי אולקוס או ציסטה יהיה גלוי בבירור.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. לטעום איסוף והכנה היסטולוגית מכתים
<ol><li>המתת חסד העכברים על פי הנהלים מוסדיים.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים כירורגיים, משוך את העור בגבול של אתר מוזרק, שסומן קודם לכן עם טוש. באמצעות מספריים כירורגיים, לסלק את האתר הנגוע על ידי חיתוך העור אחרי קו מסומן. הערה: להיות זהירים להפריד את העור הצפק בעזרת המספריים עגול.</li>
	<li>לטבול את העור של תבנית הבסיס חד פעמי מלא עם טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) במתחם, עם הצד הפנימי של העור כלפי מעלה. להקפיא את הדגימה של חנקן נוזלי עד למתחם הופך לבן. לא נותנים החנקן הנוזלי לכסות המדגם לפני זה קפוא לחלוטין כפי שזה היה פוגע. המדגם. הערה: זהירות! במהלך שלב 3.3, ללבוש מגן הפנים להגנה מפני חנקן נוזלי.</li>
	<li>אם הדגימות לא משמשים מיד להכנה שקופיות, במהירות לאחסן אותם ב- 80 ° c הערה: דוגמאות שניתן לאחסן ב- 80 ° C ללא הגבלת זמן.</li>
</ol>4. הכנה של שקופיות
<ol><li>לחצי את הדגימה כדי להכין את הפרוסות היסטולוגיה החל המרכז של המדגם.</li>
	<li>חותכים 5-מיקרומטר פרוסות עבות עם cryostat. הערה: עבור דגימות עור, הטמפרטורה של cryostat לא צריך להיות גבוה מ-25 מעלות צלזיוס. טמפרטורה גבוהה יותר תגרום התכה חלקית של ה-H-OCT ומתוחזק ולכן הדגימות לא להיות בתנוחה הנכונה במהלך ההליך חיתוך.</li>
	<li>השתמש שקופיות מיקרוסקופ הטעון חיובית כדי לאסוף את הפרוסות.</li>
	<li>אם הפרוסות שנאספו לא משמשים מיד לאחר ההכנה, לאחסן אותם ב-20 ° C. בשלב זה, פרוסות שניתן לאחסן ב-20 ° C ללא הגבלת זמן.</li>
</ol>5. hematoxylin & אאוזין מכתים
<ol><li>כתם השקופיות על-ידי טבילה hematoxylin של גיל עבור 4 דק לשטוף את השקופיות פועל מי ברז למשך 5 דקות.</li>
	<li>כתם שהשקופיות על-ידי טבילה אאוזין Y לפתרון מינימלית 1 לשטוף את השקופיות פועל ברז מים במשך 5 דקות יש לשטוף את השקופיות בעזרת מים מזוקקים לפני שתמשיך את הפרוטוקול.</li>
	<li>מייבשים על ידי טבילה באופן סדרתי הגדלת ריכוזי אתנול פתרונות (50%, 70%, 80%, 95%, 100%). לטבול את השקופיות 15 s בכל הפתרונות אתנול.</li>
	<li>לנקות את השקופיות למשך לפחות 2 דקות על ידי טבילה סוכן סליקה היסטולוגית.</li>
	<li>לטעון את השקופיות בעזרת הרכבה בינונית, שער גולשת.</li>
	<li>לרכוש תמונות של השקופיות עם סורק שקופיות מיקרוסקופ בהגדלה גדולה-X 40.</li>
</ol>6. חומצה המחזורית-שיף (PAS) מכתים
<ol><li>לתקן השקופיות עם אצטון % ≥99.5 בטמפרטורת החדר במשך דק 1. שטיפת בשקופיות זורמים מהברז עבור 1 דקות.</li>
	<li>כתם השקופיות על-ידי טבילה בפתרון המחזורית חומצה (1 g/dL) עבור 5 דק שטיפת בשקופיות 3 שינויים של מים מזוקקים.</li>
	<li>כתם השקופיות על-ידי טבילה ריאגנט של שיף במשך 15 דקות לשטוף את השקופיות פועל מי ברז למשך 5 דקות.</li>
	<li>כתם על השקופיות על-ידי טבילה hematoxylin של גיל עבור 5 דק. לשטוף את השקופיות מפעיל ברז ל 30 s.</li>
	<li>מייבשים את השקופיות על-ידי טבילה 3 שינויים של 100% אתנול. לטבול את השקופיות 15 s בכל פעם.</li>
	<li>לנקות את השקופיות למשך לפחות 2 דקות על ידי טבילה סוכן סליקה היסטולוגית.</li>
	<li>לטעון את השקופיות בעזרת הרכבה בינונית, שער גולשת.</li>
	<li>לרכוש תמונות של השקופיות עם סורק שקופיות מיקרוסקופ.</li>
</ol>7. לטעום איסוף והכנה החילוץ-RNA
<ol><li>המתת חסד העכברים על פי הנהלים מוסדיים. הסר את דגימות עור כמו שלב 3.2.</li>
	<li>לטבול את הדגימות צינור כובע הצמד 2 מ"ל עם 1 מ"ל של ריאגנט לחילוץ thiocyanate-פנול-כלורופורם חומצה guanidinium. הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן, ניתן לאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לחתוך את הדגימה לחתיכות של 0.2 ס מ2 באמצעות מלקחיים כירורגיים. הערה: זהירות! רוב ריאגנטים עבור בידוד ה-RNA הם רעילים מוטגניות. צעדים 7.3 7.4 חייב להיעשות תחת ברדס fume.</li>
	<li>לרסק את הדגימה עם מפעל חרוז במהירות של תנודות בשנייה 20 על 20 דק. לחלופין, קדר מכני יכול לשמש.</li>
	<li>בדוק את המגון יעיל של הדגימות וחיפש את הנוכחות של חתיכות שלמות של העור. חזור על שלב זה אם הדגימות לא הומוגני לגמרי.</li>
	<li>Centrifuge הדגימות-16,000 x g עבור 1 מינימלית לשמור את supernatants לחילוץ RNA וזורקים בגדר. שלב זה מבוצע כדי לחסל שיער ופסולת יכול לחסום את העמודות החילוץ.</li>
	<li>להמשיך עם החילוץ-RNA באמצעות עמודות טיהור רנ א14.</li>
	<li>השתמש ספקטרופוטומטרים לאמוד ריכוז וטיהור של RNA. אם RNA תמציות לא משמשים מיד להכנה cDNA, אחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Belkaid, Y., Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dialogue+between+skin+microbiota+and+immunity.">Dialogue between skin microbiota and immunity.</a> Science. 346 (6212), 954-959 (2014).</li><li>Kashem, S. W., Kaplan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+Immunity+to+Candida+albicans.">Skin Immunity to Candida albicans.</a> Trends Immunol. 37 (7), 440-450 (2016).</li><li>Havlickova, B., Czaika, V. A., Friedrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiological+trends+in+skin+mycoses+worldwide.">Epidemiological trends in skin mycoses worldwide.</a> Mycoses. 51, 2-15 (2008).</li><li>Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+Bloodstream+Infections+in+US+Hospitals:+Analysis+of+24,179+Cases+from+a+Prospective+Nationwide+Surveillance+Study.">Nosocomial Bloodstream Infections in US Hospitals: Analysis of 24,179 Cases from a Prospective Nationwide Surveillance Study.</a> Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).</li><li>Romani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+to+fungal+infections.">Immunity to fungal infections.</a> Nat Rev Immunol. 4 (1), 11-24 (2004).</li><li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+Candida+infections.">Pathogenesis of Candida infections.</a> J Am Acad Dermatol. 31 (3), S2-S5 (1994).</li><li>MacCallum, D. M., Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+events+in+the+intravenous+challenge+model+for+experimental+Candida+albicans+infections+in+female+mice.">Temporal events in the intravenous challenge model for experimental Candida albicans infections in female mice.</a> Mycoses. 48 (3), 151-161 (2005).</li><li>Dai, T., Kharkwal, G. B., Tanaka, M., Huang, Y. -. Y., Bil de Arce, V. J., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+external+traumatic+wound+infections.">Animal models of external traumatic wound infections.</a> Virulence. 2 (4), 296-315 (2018).</li><li>Gaspari, A. A., Burns, R., Nasir, A., Ramirez, D., Barth, R. K., Haidaris, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD86+(B7-2),+but+not+CD80+(B7-1),+expression+in+the+epidermis+of+transgenic+mice+enhances+the+immunogenicity+of+primary+cutaneous+Candida+albicans+infections.">CD86 (B7-2), but not CD80 (B7-1), expression in the epidermis of transgenic mice enhances the immunogenicity of primary cutaneous Candida albicans infections.</a> Infect Immun. 66 (9), 4440-4449 (1998).</li><li>Koh, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+Candida+gastrointestinal+colonization+and+dissemination.">Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination.</a> Eukaryot Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).</li><li>Mear, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+Airway+Exposure+Primes+the+Lung+Innate+Immune+Response+against+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+through+Innate+Lymphoid+Cell+Recruitment+and+Interleukin-22-Associated+Mucosal+Response.">Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response.</a> Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2014).</li><li>Leoni, G., Neumann, P. -. A., Sumagin, R., Denning, T. L., Nusrat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair:+role+of+immune-epithelial+interactions.">Wound repair: role of immune-epithelial interactions.</a> Mucosal Immunol. 8 (5), 959-968 (2015).</li><li>Fonzi, W. A., Irwin, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isogenic+strain+construction+and+gene+mapping+in+Candida+albicans.">Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans.</a> Genetics. 134 (3), 717-728 (1993).</li><li>Santus, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+infections+are+eliminated+by+cooperation+of+the+fibrinolytic+and+innate+immune+systems.">Skin infections are eliminated by cooperation of the fibrinolytic and innate immune systems.</a> Sci Immunol. 2 (15), (2017).</li><li>Florescu, D. F., Brostrom, S. E., Dumitru, I., Kalil, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+Skin+Abscess+in+a+Heart+Transplant+Recipient.">Candida albicans Skin Abscess in a Heart Transplant Recipient.</a> Infect Dis Clin Pract. 18 (4), 243-246 (2010).</li><li>Pradeu, T., Cooper, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+danger+theory:+20+years+later.">The danger theory: 20 years later.</a> Front Immunol. 3, 287 (2012).</li><li>Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+play+in+four+acts:+Staphylococcus+aureus+abscess+formation.">A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation.</a> Trends Microbiol. 19 (5), 225-232 (2011).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן אנחנו תיאר שיטה של זיהום אלביקנס ג ללמוד תהליך דלקתי שמאותחלת הכניסה פטרייתי ב למחרת היום עמוק.
אף-על-פי להצטברות של העור הוא אירוע נדיר יחסית על זיהום אלביקנס ג 15, הזרקה של הפטרייה ישירות בלמחרת היום עמוק מאפשר לא רק חקר היווצרות מורסה מונחה-פטריי?...

גוף האדם מכוסה עם מספר גבוה מאוד של מיקרואורגניזמים. לפני השטח של העור הוא בית הגידול של כמעט מיליון חיידקים לכל סנטימטר מרובע1. מספר זה, עם זאת, אינו משקף על המגוון המלא של מיקרואורגניזמים והצנרות העור. בנוסף חיידקים, גוף האדם הוא התנחלו על ידי מינים פטרייתי רבים, כולל אלביקנס ג, שזה מסוגל לשרוד הן את הרירית והן את העור ברמה2.
בשנים האחרונות גדל מאוד האחוז של אנשים שאובחנו עם זיהומים פטרייתיים. זאת בעיקר בשל העלייה במספר אנשים immunocompromised, קרי, חולי HIV-חיובי. וכלפי מטופלים עברו כימותרפיה או תרופות לדיכוי המערכת החיסונית לאחר השתלת3. במחקר מעקב שנערך בארצות הברית, Wisplinghoff. et al. הראה כי 9.5% של זיהומים nosocomial למחזור הדם שנגרמו על ידי זנים של קנדידה 4. עקב המופע מוגברת של זיהומים פטרייתיים, במיוחד בגלל האחוז מוגברות של קנדידה מינים נמצאו במהלך זיהומים למחזור הדם, הבנת איך הפתוגן הזה בורח השליטה של מערכת החיסון היא מאוד חשוב.
ג אלביקנס הוא בפטריה dimorphic שגדלה בצורות מורפולוגיות שונות כגון שמרים, blastospores, pseudohyphae ו- hyphae בהתאם לתנאים סביבתיים5. בצורתו hyphal, אלביקנס ג מציג את הקיבולת הגבוהה שלו invasiveness ויש לו את היכולת לחדור את אפיתל6.
זיהומים אלביקנס ג נחקרו באמצעות מספר גישות ניסיוניות. המודל הנפוץ ביותר של זיהום הוא הזרקה תוך ורידי של שמרים אלביקנס ג 7. עם זאת, מודל זה לא להתחשב בכל התהליכים זה יקרה לפני הפטריה מצליח להתפשט למחזור הדם. מודל נוסף מנצל היכולת של אלביקנס ג לפלוש האפיתל. בשיטה זו, המכונה גם נייר דגם8, פותחה על ידי Gaspari et al. . ב 19989, מורכב באמצעות נייר חול כדי תשפשפו את העור, וכך למנוע את הקרנית לפני החלת אלביקנס ג. הליך זה מאפשר את הפטרייה לחדור האפיתל, ובכך מאפשר ניתוח פולשני ביכולות של הפתוגן הזה. לבסוף, דגמים אחרים של זיהומים במערכת העיכול10 ו כלי הנשימה11 השתמשו במחקרים שונים.
היווצרות פצע (כמו דגם נייר חול) גורמת את ההפעלה של כמה מסלולים, כולל תא החיסון גיוס והפעלה, על מנת לקדם את תהליך הריפוי12. זה יכול לשנות או להסתיר את התגובה החיסונית במיוחד elicited נגד המחלה, ובכך מוביל משתנה מתערב תוצאות.
כאן נתאר שיטת דלקת עור זה מונע היווצרות פצע הראשונית ואת של אינדוקציה של סביבה דלקתית הבזליים. כדי לשמור על המבנה אפיתל ללא פגע, ישירות נזריק אלביקנס ג בצורתה hyphal ב למחרת היום עמוק. אף-על-פי זריקה אחת יכול להפיק דלקת קלה, הכמות של דלקת מוגבלת, מוגבל לעומת היווצרות פצע פתוח כמו דגם נייר חול. הגישה כי אנו מתארים כאן מאפשר המחקר של התגובה החיסונית לזיהום פטרייתי, התפשטה תוך הימנעות הסביבה דלקתית מוגזמת ולא קיימים נגרם נזק מכני.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB4053L</td>
			<td>warm in 37 &#176;C bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-OCT compound</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td>R0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill&#39;s Hematoxilyn</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td>09-178-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution, alcoholic</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td>09-209-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>scharlau</td>
			<td>ET00232500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citro-HISTOCLEAR</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td>R0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt, mounting medium</td>
			<td>bio-optica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAS staining system</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>395B-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology</td>
			<td>Applichem PanReac</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>8451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Applichem PanReac</td>
			<td>A1070,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tubes 2 mL</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>30121597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Wear eye protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Counter-Particle Count</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5415 R</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC 3000 Microtome Cryostat</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLiser</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base mould disposable</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td>2781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged bio microscope slides</td>
			<td>bio-optica</td>
			<td>09-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips 24 x 50 mm</td>
			<td>thermo scientific</td>
			<td>11911998</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deep dermal injection as a model of candida albicans skin infection for histological analyses

העור הוא איבר מאוד מורחבת של הגוף, עקב זה משטח גדול, ללא הרף ייחשף מיקרואורגניזמים. נזק לעור יכול בקלות להוביל דלקות הדרמיס והתוצאה בתורו, יכול, להיות הפצת פתוגנים למחזור הדם. הבנת איך מערכת החיסון נלחם זיהומים בשלב מוקדם מאוד, איך המחשב המארח יכול לחסל פתוגנים היא צעד חשוב כדי להגדיר את הבסיס עבור התערבויות טיפוליות עתידיות. כאן נתאר מודל של זיהום קנדידה אלביקנס שיכולים להמחיש את התהליכים המתרחשים מוקדם במהלך זיהום, כולל בעת המחלה עברה את מחסום האפיתל, כמו גם את התגובה החיסונית שהפיק את אלביקנס ג הפלישה. השתמשנו מודל זיהום זה כדי לבצע ניתוח היסטולוגית המציגים את התאים החיסוניים זה לחדור את העור, כמו גם את הנוכחות ואת לוקליזציה של המחלה. הדגימות שנאספו לאחר הזיהום ניתן לעבד לחילוץ RNA.

באמצעות ההזרקה של המחלה ישירות בלמחרת היום עמוק, המורפולוגיה מבנית של רקמת נשאר שלם (איור 1 א').
שמירה על העור המבנית מאפשרת הגילוי של תאים חיסוניים ולוקליזציה שלהם באתר של זיהום. ההגדלה גבוה יותר באיור איור 1B</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses at JoVE.com

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

עמוק עורי הזרקת כמו מודל של קנדידה אלביקנס דלקת עור עבור ניתוחים היסטולוגית

כאן נתאר פרוטוקול המאפשר ניתוח היסטולוגית ומולקולרית של דגימות עור לאחר ההזרקה intradermal קנדידה אלביקנס . פרוטוקול זה שומר על שלמות המבנה של העור ומאפשר הלוקליזציה של תאים חיסוניים רקמות-תושב או שזה עתה מגויסים, כמו גם את ההתפלגות הפתוגן.

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

deep-dermal-injection-as-model-candida-albicans-skin-infection-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

10.6K Views.  University of Milano-Bicocca. כאן נתאר פרוטוקול המאפשר ניתוח היסטולוגית ומולקולרית של דגימות עור לאחר ההזרקה intradermal קנדידה אלביקנס . פרוטוקול זה שומר על שלמות המבנה של העור ומאפשר הלוקליזציה של תאים חיסוניים רקמות-תושב או שזה עתה מגויסים, כמו גם את ההתפלגות הפתוגן.

Video: Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third most common infection in US hospitals. Different manifestations of candidiasis are associated with biofilm formation, both on host tissues and/or medical devices (i.e. catheters). Biofilm formation carries negative clinical implications, as cells within the biofilms are protected from host immune responses and from the action of antifungals. We have developed a simple, fast and robust in vitro model for the formation of C. albicans biofilms using 96 well microtiter-plates, which can also be used for biofilm antifungal susceptibility testing. The readout of this assay is colorimetric, based on the reduction of XTT (a tetrazolium salt) by metabolically active fungal biofilm cells. A typical experiment takes approximately 24 h for biofilm formation, with an additional 24 h for antifungal susceptibility testing. Because of its simplicity and the use of commonly available laboratory materials and equipment, this technique democratizes biofilm research and represents an important step towards the standardization of antifungal susceptibility testing of fungal biofilms.

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

We describe a simple, rapid and robust method for the formation of Candida albicans biofilms using 96 well microtiter plates and its utility in antifungal susceptibility testing of cells within biofilms.

96 microtiter ובכן פלייט מבוססי שיטה ליצירת ניטור ובדיקה של רגישות נגד פטריות קנדידה אלביקנס Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

שימוש<em&gt; Mellonella Galleria</em&gt; כאורגניזם מודל לחקר<em&gt; הלגיונלה pneumophila</em&gt; זיהום

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

לומד קהילות חיידקים<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של אינטראקציה בתיווך בין מארח<em&gt; קנדידה אלביקנס</em&gt; ו<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; באיירווייס

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus formation in veins remain obscure. Lack of mobility (e.g., after surgery or long-haul flights) is one of the main factors leading to DVT. The pathophysiological consequence of the lack of mobility is blood flow stagnation in venous valves. Here, a model is described that mimics such flow disturbance as a thrombosis-driving factor. In this model, partial flow restriction (stenosis) in the inferior vena cava (IVC) is created. Closure of about 90% of the IVC lumen for 48 h results in development of thrombi structurally similar to those in humans. The similarities are: i) most of the thrombus volume is red, i.e., consists of red blood cells and fibrin, ii) presence of a white part (lines of Zahn), iii) non-denuded endothelial monolayer, iv) elevated plasma D-Dimer levels, and v) possibility to prevent thrombosis by low molecular weight heparin. Limitations include variable size of thrombi and the fact that a certain percentage of wild-type mice (0 - 35%) may not produce a thrombus. In addition to visual observation and measurement, thrombi may be visualized by non-invasive technologies, such as ultrasonography, which allows for monitoring the dynamics of thrombus development. At shorter time points (1 - 6 h), intravital microscopy may be applied to directly observe events (e.g., recruitment of cells to the vessel wall) preceding thrombus formation. Use of this method by several teams around the world has made it possible to uncover basic mechanisms of DVT initiation and identify potential targets that might be beneficial for its prevention.

We describe here stenosis in the inferior vena cava as a murine model of deep vein thrombosis. This model recapitulates blood flow restriction, one of the major triggers of venous thrombosis in humans.

היצרות של הכלילי התחתון: מודל מאתר של פקקת ורידים עמוקה

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן Microfluidic אוטומטי

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of experimental models needs to be as rigorous as that applied for human samples. Indeed, drawing reliable and accurate conclusions is critically influenced by the quality of tissue section preparation. Here, we describe a protocol for histopathological analysis of murine tissues that implements several automated steps during the procedure, from the initial preparation to the paraffin embedding of the murine samples. The reduction of methodological variables through rigorous protocol standardization from automated procedures contributes to increased overall reliability of murine pathological analysis. Specifically, this protocol describes the utilization of automated processing and embedding robotic systems, routinely used for the tissue processing and paraffin embedding of human samples, to process murine specimens of intestinal inflammation. We conclude that the reliability of histopathological examination of murine tissues is significantly increased upon introduction of standardized and automated techniques.

Lack of standardization for murine tissue processing reduces the quality of murine histopathological analysis as compared to human specimens. Here, we present a protocol to perform histopathological examination of murine inflamed and uninflamed colonic tissues to show the feasibility of robotic systems routinely used for processing and embedding&#160;human samples.

באמצעות מערכות רובוטיות כדי לעבד ולהטביע דגימות מאתר חוקן עבור ניתוחים היסטולוגית

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of ...

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic growth of C. albicans SN425, the inoculums grew on Yeast Nitrogen Base media. For biofilm formation, RPMI 1640 media, which have high concentrations of amino acids, were applied to help biofilm growth. Biofilms of 48 h were treated twice a day for a period of 1 min with a non-coherent light device (red light; wavelength = 635 nm; energy density = 87.6 J&#183;cm-2). As a positive control (PC), 0.12% chlorhexidine (CHX) was applied, and as a negative control (NC), 0.89% NaCl was applied to the biofilms. Colony forming units (CFU), dry-weight, soluble and insoluble exopolysaccharides were quantified after treatments. Briefly, the protocol presented here is simple, reproducible and provides answers regarding viability, dry-weight and extracellular polysaccharide amounts after red light treatment.

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcome of red light application on the growth of Candida albicans biofilm. A non-coherent red light device with the wavelength of 635 nm and energy density of 87.6 J&#183;cm-2 was applied throughout the growth of Candida albicans biofilms for 48 h.

פוטותרפיה יומי עם אור אדום כדי לווסת קנדידה אלביקנס Biofilm צמיחה

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

ויזואליזציה של קנדידה אלביקנס במערכת העיכול מוריין באמצעות פלורסנט היברידיזציה באתרו

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch from yeast-form growth to hyphal growth. Cells initiating this process become adherent to surfaces as well as to each other, with the resulting development of a biofilm colony. This commonly occurs not only on mucosal tissue surfaces in yeast infections, but also on medical implants such as catheters. It is well known that biofilm cells are resistant to antifungal drugs, and that cells that shed from the biofilm can lead to dangerous systemic infections. Biofilms range from heavily translucent to opaque due to refractive heterogeneity. Therefore, fungal biofilms are difficult to study by optical microscopy. To visualize internal structural, cellular, and subcellular features, we clarify fixed intact biofilms by stepwise solvent exchange to a point of optimal refractive index matching. For C. albicans biofilms, sufficient clarification is attained with methyl salicylate (n = 1.537) to enable confocal microscopy from apex to base in 600 &#181;m biofilms with little attenuation. In this visualization protocol we outline phase contrast refractometry, the growth of laboratory biofilms, fixation, staining, solvent exchange, the setup for confocal fluorescence microscopy, and representative results.

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

To view and quantify the internal features of Candida albicans biofilms, we prepare fixed intact specimens that are clarified by refractive index matching. Then, optical sectioning microscopy can be used to obtain three-dimensional image data though the full thickness of the biofilm.

הבהרת והדמיה של קנדידה ביוביאמים

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...