המחברים מבקשים להודות אמילי Mairey ועמנואל Donnadieu לקביעת הראשונית מעלה של ההליך.

1. התא המארח האדם תרבית החיידקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות HUVECs מעבר בין 1 ו - 9 ב 37 מעלות בתוך חממה humidified עם 5% (v / v) CO 2. מעבר התאים כאשר הם גישה מפגש 80% עם טריפסין / EDTA לספק תרבויות תחזוקה על 75 ס&quot;מ 2 צלוחיות תרבות ותרבויות ניסיוני בתאי זרימה חד פעמיות (μ-שקופיות VI). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משיכה בינוני מן צלוחיות להיות passaged, לשטוף את התאים עם 10 מ&quot;ל של PBS, לשלוף ולהחליף אותו עם 1.5 מ&quot;ל של טריפסין / EDTA. אפשר לנתק את התאים בתרבית תאים החממה למשך 5 דקות בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף התאים עם 10 מ&quot;ל של מדיום תרבית תאים לתוך צינור איסוף 15 מ&quot;ל. גלולה התאים עם צנטריפוגה 5 דקות (ב g 200), בטמפרטורת החדר. להשעות את התאים מ&quot;ל 4 של אנדו-SFM בתוספת 10% (v / v) FBS לספור אותם על חדר Malassez, על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הציגו 30 μl של 6 תאים 1x10 HUVEC לכל ההשעיה מ&quot;ל לתוך התעלה (3x10 4 סה&quot;כ) ולאפשר לתאים לדבוק במשך 3 שעות ב 37 מעלות ב חממה humidified עם אווירה של 5% (v / v) CO 2. הוספת נפח נוסף של 120 μl של אנדו-SFM למלא את הבארות. תאים צריכים להקים monolayer subconfluent (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול נ meningitidis להביע GFP (במקרה הזה 8013 זן GFP להביע בשליטת היזם IPTG-ועין מתנהלת), על צלחות אגר GCB המכיל תוספים קלוג&#39;ס 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל של chloramphenicol ב 37 ° C באווירה לחות המכיל 5% (v / v) CO 2 למשך 16 שעות. </li></ol> 2. הידבקות ראשונית של חיידקים בודדים לארח תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הריכוז של חיידקים גדל על צלחות אגר GCB כדי OD600 של 0.05 עם טרום חימם Endo-SFM המכיל 10% (v / v) FBS ו דגירה של 120 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באווירה לחות המכיל 5% (v / v) CO 2, תחת רועד עדין (130 סל&quot;ד). להשרות ביטוי של GFP על ידי הוספת 1 IPTG mM לתוך המדיום תרבות לתקופת הדגירה כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הפנויה μ-Slide על הבמה של מיקרוסקופ הפוך מצויד פלטפורמה מחומם כדי לשמור על הטמפרטורה מדגם ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים מראש חימם Endo-SFM בתוספת 2% (v / v) FBS לתוך כוס זכוכית סטרילית למלא מזרק 50 מ&quot;ל סטרילי עם המדיום הזה. חבר את צינורות &quot;כניסה&quot; אל המזרק ומלא על ידי החדרת בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את &quot;הכניסה&quot; צינור אל Slide-μ, עם טיפול, כדי למנוע החדרת אוויר לתוך החדר. לאחר מכן, לצרף את &quot;יציאה&quot; הצינור לקצה השני בזהירות למלא את הערוץ עם בינוני עד מרחק של כ 1 ס&quot;מ &quot;יציאה&quot; את החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את OD600 חיידקים להסתגל 0.15 ב Endo-SFM המכיל 2% (v / v) FBS. כדי להסתכל על חיידקים בודדים, אגרגטים כל חייב להיות מופרת על ידי vortexing נמרץ של המדגם חיידקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 100 μl של אנדו-SFM בתוספת 2% (v / v) FBS בינוני לתוך המאגר ולהוסיף 100 μl של הפתרון חיידקי נלקח מהחלק העליון של הפתרון vortexed להימנע הדגימה כל אגרגטים חיידקי הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להציג את נפח 200 μl אל Slide-μ ידי סיבוב שסתום להזריק את החיידקים אל תוך החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הציגו Endo-SFM המכיל 2% (v / v) FBS, שמרו על 37 מעלות צלזיוס עם פלטפורמת מחוממת, החדרה באמצעות משאבת מזרק עם הלחץ גוזז תואם הידבקות של 0.044 dynes / 2 ס&quot;מ במשך 15 דקות. </li></ol> ראו למשל וידאו או 1 דמות 3. לאחר שלב זה, או לעבור סעיפים 3, 4 או 6. 3. כימות של הידבקות ראשונית של חיידקים בודדים לתאי המארח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הידבקות ראשונית במשך 15 דקות, לרכוש תמונות של עשרה שדות באקראי תוך הנוזל עדיין במחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח תמונות שנרכשו באמצעות תוכנת ImageJ 8, על מנת לקבל גישה המספר הממוצע של חיידקים adherant לכל שדה. הדבר נעשה באופן הבא: קודם כל, כל תמונה היא thresholded באמצעות &quot;סף&quot; חלון נמצא בתפריט &quot;תמונה&quot; כדי להדגיש את הפרט חיידקים פלורסנט דבקות, תוך מזעור רקע מהתאים. ואז, כל חיידק בודד נספרת, באמצעות Plug-In &quot;מונה Cell&quot; ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a> ). הנתונים עבור כל תמונה מדווחים גיליון אלקטרוני של Excel הם ממוצעים לכמת את מספר ממוצע של חיידקים חסיד לכל שדה. </li></ol> 4. מדידת התנגדות לזרימה של חיידקים בודדים חסיד לתאי המארח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנית מזרק משאבה הגדרת ליצור מתח גזירה החל 3-100 dynes / 2 ס&quot;מ במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתום 5 דקות, לרכוש ten שדות שנבחרו באקראי כמתואר בשלב 3.1, אבל עם הזרם נעצר יחסי ציבורIOR הרכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את התמונות רכשה כמתואר בשלב 3.2 ולכמת את המספר הממוצע של החיידקים הנותרים לכל שדה. </li></ol> 5. מדידת הצמיחה של חיידק חסיד מבודד microcolony <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הציגו Endo-SFM המכיל 10% (v / v) FBS, שמרו על 37 מעלות צלזיוס עם פלטפורמת מחוממת, החדרה באמצעות משאבת מזרק עם הלחץ גזירה נבחר למשך כמה שעות. הקלטת תמונות מיקרוסקופיה וידאו בזמן אמת על מסגרת אחת כל 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות מיקרוסקופיה וידאו, להפסיק את הלחץ גזירה ידי כיבוי משאבת מזרק, לרכוש 2-3 תמונות נוספות ולאחר מכן לעצור את רצף רכישת התמונה על התוכנה. דוגמה של שגשוג חיידקים ניתן לראות וידאו 2. </li></ol> 6. מדידת התנגדות לזרימה של microcolonies חיידקי חסיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר היווצרות של microcolonies גדול על פני הסלולר (step5.2) לרכוש 2-3 תמונות של תאים הן (לעומת שלב) חיידקים (על ידי ה-GFP-פלואורסצנטי) לפני יישום תזרים. במשך שארית של הניסוי, פרוטוקול הרכישה תפקח רק את הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת מתח גזירה גבוהה במשך 5 דקות (300-100 dynes / ס&quot;מ 2) ותמונות שיא בכל מסגרת אחת כל 5 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את המתח גזירה ידי כיבוי משאבת מזרק, לרכוש 2-3 תמונות נוספות ולאחר מכן לעצור את רצף רכישת התמונה על התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להסיר את צינור &quot;היציאה&quot; הראשונה ובזהירות, כדי למנוע ריקון ערוץ ולאחר מכן להוסיף מראש חימם בינוני טרי למלא את בארות לפני הסרת צינורות &quot;כניסה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע כמותית את השפעת הלחץ גזירה על עמידות חיידקים, assay ציפוי יכול להתבצע כדלקמן: לאסוף את הנותרים בינוני לשטוף את μ-Slide פעמיים עם 120 μl של PBS, אשר מסיר את המדיום הנותרים מערוץ (שוטף הן ) נאסף גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את התאים הנגועים עם תוספת של 50 μl של טריפסין / EDTA במשך 5 דקות ב 37 מעלות ו לערבב את זה עם מדגם מנותקת ההשעיה שנאסף בשלב הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע דילולים סדרתי PBS ואת הצלחת שבריר 10 μl לצלחות GCB אגר, בשלושה עותקים, על מנת לקבוע את מספר יחידות המושבה להרכיב (CFU) ביום שלמחרת, לאחר דגירה של הצלחות ב 37 ° C באינקובטור עם 5% (v / v) CO 2. </li></ol> וידאו 3 ו -4 להשוות את המתח סוג בר עם מוטציה pilV. 7. ניתוק מן חיידקית microcolonies <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק תאים בתא זרימה על ידי חזרה על שלבים 2.1-2.8 ולאפשר הזיהום להמשיך במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חיידקים מאוגד על ידי הגדלת זרימת dynes 10 / 2 ס&quot;מ לתקופה של 2 דקות ולאפשר זיהום להימשך 2h. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמצום זרימת 0.15 dynes / 2 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל שעה, לאסוף ירידה של מדיום יוצא של החדר לזרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע דילולים סדרתי של דגימות צלחת אותם על צלחות אגר GCB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת מספר יחידות המושבה להרכיב (CFU) ביום שלמחרת, לאחר דגירה של הצלחות ב 37 ° C באינקובטור עם 5% (v / v) CO 2. </li></ol> 8. נציג תוצאות <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig1.jpg" /> איור 1: שלבים שונים של monolayer סלולרי שניתן לצפות ומדד בנוכחות זרימה בהליך. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig2.jpg" /> איור 2: monolayer תא האנדותל בחדר זרימה בתחילת הניסוי (היעדר לחץ גזירה). כ -50 לתאי אנדותל מאורגנים monolayer משנה ומחוברות. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig3.jpg" /> איור 3: ייצוג גרפי של הידבקות ראשונית של חיידקים על פני השטח הסלולר. ערכים עבור שלושת השדות מסומנים כדי לתת מושג על וריאציה בשדה אל השדה צפוי (0044 dynes / ס&quot;מ 2). וידאו 1. ויזואליזציה של הידבקות ראשונית של חיידקים על monolayer הסלולר כפונקציה של זמן (0044 dynes / ס&quot;מ 2). GFP-להביע את החיידקים הבאים את הכיוון של המדיום זורם. הסרט מואץ פי 60, את משך הזמן האמיתי של הסרט הוא 10 דקות. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video1.mov">לחץ כאן כדי לראות את הוידאו.</a> וידאו 2. החיידקים לאחר הדבקה ראשונית הורשו להתרבות על פני הסלולר לתקופה של 7 שעות (1000 מואץ פי). <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video2.mov">לחץ כאן כדי לראות את הוידאו.</a> וידאו 3. לאחר הפצת נשק על פני השטח הסלולר המכונאיהתנגדות של אל microcolonies נבדק על ידי הגדלת רמת הלחץ גזירה dynes עד 10 / 2 ס&quot;מ 5 דקות אבל microcolonies סוג בר עמידים מואץ פי 60. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video3.mov">לחץ כאן כדי לראות את הוידאו.</a> וידאו 4. Microcolonies שיצרו מוטנט pilV הם שיבשו להגביר את זרימת (10 dynes / ס&quot;מ 2). מוטציה זו אינה מצליחה להשפיע על שיפוץ של קרום פלזמה תחת microcolonies ולכן היא יותר רגישה ללחץ מוגבר גזירה (וידאו מואץ פי 60) 5. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video4.mov">לחץ כאן כדי לראות את הוידאו.</a>

<ol>
	<li>Mairey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+microcirculation+shear+stress+levels+determine+Neisseria+meningitidis+attachment+sites+along+the+blood-brain+barrier.">Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier.</a> J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).</li><li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+Principles+of+Vascular+Beds.">Design Principles of Vascular Beds.</a> Circ Res. 77, 1017-1023 (1995).</li><li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow.">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16, 31-42 (2009).</li><li>Tissot, O., Pierres, A., Foa, C., Delaage, M., Bongrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motion+of+cells+sedimenting+on+a+solid+surface+in+a+laminar+shear+flow.">Motion of cells sedimenting on a solid surface in a laminar shear flow.</a> Biophys J. 61, 204-215 (1992).</li><li>Mikaty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+bacterial+pathogen+induces+host+cell+surface+reorganization+to+resist+shear+stress.">Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress.</a> PLoS Pathog. 5, e1000314-e1000314 (2009).</li><li>Chamot-Rooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modification+of+pili+upon+cell+contact+triggers+N.+meningitidis+dissemination.">Posttranslational modification of pili upon cell contact triggers N. meningitidis dissemination.</a> Science. 331, 778-782 (2011).</li><li>Soyer, M., Dum&#237;nil, G., Christodoulides, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+under+shear+stress.">Bacterial adhesion under shear stress.</a> Neisseria meningitidis: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). , (2011).</li><li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+to+target+cells+enhanced+by+shear+force.">Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force.</a> Cell. 109, 913-923 (2002).</li><li>Tchesnokova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-enhanced+binding+of+intestinal+colonization+factor+antigen+I+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli.">Shear-enhanced binding of intestinal colonization factor antigen I of enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 76, 489-502 (2010).</li><li>Konto-Ghiorghi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+for+pilus+in+adherence+to+epithelial+cells+and+biofilm+formation+in+Streptococcus+agalactiae.">Dual role for pilus in adherence to epithelial cells and biofilm formation in Streptococcus agalactiae.</a> PLoS Pathog. 5, e1000422-e1000422 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

חשיבותה של מתח גזירה ובדרך כלל היבטים מכניים בביולוגיה הוא יותר ויותר מוכר. למשל המאפיינים דבק המותאמים ביותר של משפחת selectin של חלבונים בתהליך של הידבקות לימפוציטים, מתגלגלים על הקיר וסקולרית הוכר על ידי החדרת מתח גזירה בתהליך. ההליך המתואר לעיל היה להחיל את meningitidis גראם שליליים Neisseria חיידקים אבל צריך לחול על מגוון רחב של פתוגנים. חשיבותה של מתח גזירה הוכח גם ומזיקים ואתרי זיהום אחרים. הדבקה חיידקית מותנה מתח גזירה תוארה על ידי מחקר של adhesin FimH למצוא Escherichia coli uropathogenic (UPEC) 9. בדומה Selectins, את האינטראקציה בין FimH ואת התא המארח שלה קולטן הוצגה להיות מחוזקת על ידי גזירה-Induced כוחות מכניים 9 ו adhesin CfaE של enterotoxigenic E.coli דווחה גם לתווך הידבקות לתאי האפיתל במעי באמצעות גזירה תלויי מנגנון 10. דיווחנו, באמצעות זרימה למינרית assay קאמרית פרוטוקול המתוארת בפרק זה כי סטרפטוקוקוס agalactiae פילי היו חיוניים הדבקות של הפתוגן הזה לתאי האפיתל בתנאים תזרים 11. מחקרים אלה מאשרים כי קאמרית תזרים assay שלנו הוא כלי שימושי לחקר התא הפתוגן אינטראקציות מארח תחת תנאים של לחץ גזירה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> μ-Slide VI 0.4 ערכה תזרים </td><td> IBIDI </td><td> 80606 </td></tr><tr><td> מזרק 50 מ&quot;ל Plastipak Luer-Lock </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> Tygon R3603 Tubing 3.2 x 4.8mm </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> R3603 </td></tr><tr><td> 3 כיווני שסתום, 2 luer נקבה luer זכר </td><td> Bio-Rad </td><td> 7328103 </td></tr><tr><td> משאבת מזרק </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> PHD 2000 </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ הפוך, ניקון </td><td> ניקון </td><td> Eclipse T i </td></tr><tr><td> מצלמת CCD </td><td> Hamamatsu </td><td> ORCA 285 CCD או ORCA 3-CCD </td></tr><tr><td> ImageJ תוכנה </td><td> NIH </td><td> Freeware ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) </td></tr></tbody></table>

introducing shear stress in the study of bacterial adhesion

במהלך זיהומים חיידקיים רצף של אינטראקציות מתרחשות בין פתוגן לבין המארח שלו. הידבקות חיידקים על פני השטח התא המארח היא לעתים קרובות הצעד הראשוני של קביעת בפתוגנזה. למרות ניסויי הדבקה נלמדת בעיקר בתנאים סטטיים הידבקות למעשה מתקיים בנוכחות זורם נוזל. המפגשים הראשונים בין חיידקים המארח שלהם לעתים קרובות להתרחש ברמת הרירית, הפה, הריאות, המעיים, עיניים, וכו &#39;שבו הריר זורם על פני השטח של תאים אפיתל. מאוחר יותר זיהום, פתוגנים מדי פעם הגישה את זרימת הדם ולגרום למחלות מסכנות חיים כגון אלח דם, דלקת קרום המוח septicemia ו. המאפיין של זיהומים אלה הוא היכולת של פתוגנים אלה לתקשר עם לתאי אנדותל בנוכחות של מחזורי הדם. הנוכחות של הזורם, הריר נוזל או דם, למשל, קובע הדבקה כי זה יוצר כוח מכני על הפתוגן. כדי לאפיין את ההשפעה של זורמים זה נוזל בדרך כלל מתייחס המושג גזירה של מתח, שהוא הכוח המופעל משיק ליחידת שטח על ידי נוזל מרגש ליד קיר נייח, שבאה לידי ביטוי dynes / 2 ס&quot;מ. עוצמות הלחץ גזירה להשתנות במידה רבה בהתאם לסוג כלי שונה, גודל, איבר, מיקום וכו &#39;(000-100 dynes / ס&quot;מ 2). השאלה של נימי דם יכול להגיע נמוכה מאוד להדגיש ערכים גזירה ואף להפסיק באופן זמני במשך תקופות שנעו בין כמה שניות עד מספר דקות 1. בצד השני של הספקטרום הלחץ גזירה arterioles יכול להגיע 100 dynes / 2 2 ס&quot;מ. ההשפעה של הלחץ גזירה על תהליכים ביולוגיים שונים הודגמה בבירור במהלך האינטראקציה של לויקוציטים עם 3 האנדותל כמו למשל. כדי לקחת בחשבון פרמטר זה מכני בתהליך של הידבקות חיידקים לקחנו את היתרון של הליך ניסיונית המבוססת על שימוש של זרימה חד פעמיות קאמרית 4. התאים גדלים מארח בחדר זרימה וחיידקים פלורסנט מוצגים בזרימת נשלט על ידי משאבת מזרק. אנחנו בתחילה התמקדה החקירה שלנו על פתוגן חיידקי Neisseria meningitidis, חיידק גראם שליליים אחראי על זיהום ודלקת קרום המוח. ההליך המתואר כאן מאפשר לנו לחקור את ההשפעה של הלחץ גזירה על היכולת של החיידקים: לדבוק 1 תאים, להתרבות על פני התא 5 ו לנתק ליישב אתרים חדשים 6 (איור 1). מידע טכני משלימה ניתן למצוא התייחסות 7. ערכי הלחץ שאר המוצגים כאן נבחרו בהתבסס על הניסיון הקודם שלנו 1 ו לייצג ערכים בספרות. הפרוטוקול אמור לחול על מגוון רחב של פתוגנים עם התאמות מסוימות בהתאם למטרות המחקר.

Watch this Scientific Journal Video about Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion at JoVE.com

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

בתהליך ההדבקה, צעד מפתח הוא הדבקה של פתוגנים עם תאים המארח. ברוב המקרים שלב זה הידבקות מתרחשת בנוכחות הלחץ המכני שנוצר על ידי זרימת נוזל. אנו מתארים טכניקה מציגה הלחץ גזירה כפרמטר חשוב במחקר של הידבקות חיידקים.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

introducing-shear-stress-in-the-study-of-bacterial-adhesion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.5K Views.  INSERM U970. בתהליך ההדבקה, צעד מפתח הוא הדבקה של פתוגנים עם תאים המארח. ברוב המקרים שלב זה הידבקות מתרחשת בנוכחות הלחץ המכני שנוצר על ידי זרימת נוזל. אנו מתארים טכניקה מציגה הלחץ גזירה כפרמטר חשוב במחקר של הידבקות חיידקים.

Video: Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

ב Assay חוץ גופית של הידבקות חיידקים על תאים אפיתל היונקים

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

אנושי עכבר מודל ללמוד זיהומים חיידקיים מיקוד microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

תזרים הידבקות Assay ללמוד יקוציט גיוס לבדית אדם סינוסי תנאי האנדותל של מתח שאר

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

סטטי הידבקות Assay לחקר Integrin ההפעלה בT לימפוציטים

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

במבחנת in vivo המודל ללמוד הידבקות חיידקים לכלי השיט וול תנאי זרימה תחת

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

שיטות לעכב קטריאלי Pyomelanin ייצור וקבעו את הגידול המקביל ברגישות לסטרס חמצונים

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Assay הדבקה תחת מאמץ גזירה לחקר T לימפוציטים-הדבקה אינטראקציות מולקולה

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin acquisition at the bacterial cell surface plays in resistance to the host immune system. Flow cytometry experiments identified human plasma vitronectin as a ligand for the bacterial receptor outer membrane protein H of Haemophilus influenzae type f. An enzyme-linked immunosorbent assay was employed to characterize the protein-protein interactions between purified recombinant protein H and vitronectin, and binding affinity was assessed using bio-layer interferometry. The biological importance of the binding of vitronectin to protein H at the bacterial cell surface in evasion of the host immune response was confirmed using a serum resistance assay with normal and vitronectin-depleted human serum. The importance of vitronectin in bacterial adherence was analyzed using glass slides with and without vitronectin coating, followed by Gram staining. Finally, bacterial adhesion to human alveolar epithelial cell monolayers was investigated. The protocols described here can be easily adapted to the study of any bacterial species of interest.

This report describes protocols for characterizing interactions between bacterial outer membrane proteins and the human complement regulator vitronectin. The protocols can be used to study the binding reactions and biological function of vitronectin in any bacterial species.

מבחני ללמוד את התפקיד של Vitronectin הידבקות חיידקים עמידות סרום

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of infected cells, including organelle ultrastructure, cytoskeletal network organization, as well as cellular processes such as Stress Granule (SG) formation. The characterization of how pathogens subvert host processes is an important and integral part of the field of pathogenesis. While variable phenotypes may be readily visible, the precise analysis of the qualitative and quantitative differences in the cellular structures induced by pathogen challenge is essential for defining statistically significant differences between experimental and control samples. SG formation is an evolutionarily conserved stress response that leads to antiviral responses and has long been investigated using viral infections1. SG formation also affects signaling cascades and may have other still unknown consequences2. The characterization of this stress response to pathogens other than viruses, such as bacterial pathogens, is currently an emerging area of research3. For now, quantitative and qualitative analysis of SG formation is not yet routinely used, even in the viral systems. Here we describe a simple method for inducing and characterizing SG formation in uninfected cells and in cells infected with a cytosolic bacterial pathogen, which affects the formation of SGs in response to various exogenous stresses. Analysis of SG formation and composition is achieved by using a number of different SG markers and the spot detector plug-in of ICY, an open source image analysis tool.

We describe a method for the qualitative and quantitative analysis of stress granule formation in mammalian cells after the cells are challenged with bacteria and a number of different stresses. This protocol can be applied to investigate the cellular stress granule response in a wide range of host-bacterial interactions.

ניתוח Immunofluorescence של גרגר מתח גיבוש לאחר האתגר בקטריאלי של תאים יונקים

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...