FG é suportado pela Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 2016Id.18842), Fundação Cariplo (Grant 2014-0655) e Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB). IZ é suportado pelo NIH grant 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 grant, Harvard Medical escola Milton encontrou, CCFA Senior Research Awards (412708), a Eleanor e Miles Shore 50º aniversário Fellowship Program e a Fundação Cariplo ( 2014-0859).

Todos os procedimentos foram aprovados sob o cuidado de Animal institucional e uso Comité (IACUC) e operados sob a supervisão do departamento de recursos animais às crianças do Hospital (ARCH) no Hospital infantil de Boston, ou foram aprovados pelo italiano Ministério da saúde e executada sob o Animal conta Comissão institucional da Universidade de Milano-Bicocca.
1. preparação de c. albicans
<ol><li>Cultura C. albicans, estirpe CAF3-113, em tubos contendo meio rico (dextrose de peptona de extrato de levedura (YEPD), extrato de levedura 1% (p/v), 2% (p/v) de Bacto peptona, 2% (p/v) glicose) suplementado com uridina (50 mg/L) a 25 ° C. Nestas condições, c. albicans cresce como um fermento. Nota: Outras cepas de c. albicans podem ser usadas, tais como o clínico isolar c. albicans estirpe SC531413. Desde que nós recentemente demonstramos que o processo ulcerosa é induzido pela ativação do sistema imune inato14, teoricamente cada cepa de c. albicans que mantém seus componentes da parede celular e a estrutura, bem como a capacidade de origem hifas projeções, poderia ser usado.</li>
	<li>Monitore a cultura contando a concentração celular usando um analisador de contador de célula.</li>
	<li>Colha a cultura quando atinge uma concentração de cerca de 8 x 106 células/mL. Como alternativa, use um espectrofotômetro para medir o OD600. Nota: Normalmente, um valor de OD600 = 1 corresponde a uma concentração de levedura de 3 x 107 células/mL, mas recomenda-se titulação.</li>
	<li>Resuspenda a cultura em meio YEPD-uridina, usando o como agente tampão HEPES (50 mM, pH 7,5) e incubar a cultura a 37 ° C, para induzir a formação de hifas. Verifica a formação de hifas sob um microscópio com ampliação de 100 X. Formação das hifas é visível 5h após cultivo a 37 ° C; no entanto, use as células 16 h após incubação a 37 ° C, quando a porcentagem das hifas atinge quase 95% da cultura total.</li>
	<li>Para enriquecer ainda mais a preparação na concentração das hifas, alíquotas de centrífuga da cultura a 3.300 x g, durante 5 min. descartar o sobrenadante e resuspenda o pellet em PBS estéril na concentração de 1 x 108 hifas/mL.</li>
</ol>2. fundo dérmica injeção
<ol><li>24 h antes o processo de infecção, anestesiar os ratos com uma injeção intraperitoneal de cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (10mg/kg) e em seguida raspar o flanco dos ratos usando uma tosquiadeira elétrica. Nota: Após qualquer procedimento envolvendo anestesia, coloque os ratos sob uma lâmpada de aquecimento até que eles recuperaram eficientemente.</li>
	<li>Descanse os ratos por 24 h evitar qualquer inflamação devido ao processo de barbear.</li>
	<li>24 h após o procedimento de corte, anestesiar os ratos com uma injeção intraperitoneal de cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (10mg/kg).</li>
	<li>Verifica o reflexo de pata para garantir que os ratos são anestesiados profundamente. Avalie o reflexo da pata por beliscar-se firmemente a pata. Se a anestesia é alcançada, o animal não sente dor e não se move.</li>
	<li>Injete hifas de c. albicans no derma profunda utilizando uma seringa de insulina de 0,3 mL com agulha 30 x 8 mm em um volume final de 50 µ l/injeção, correspondente a 5 x 106 hifas/injeção.<ol>
<li>Puxe a pele do flanco raspada esticada usando dois dedos para injetar o volume diretamente no derma profunda. Introduza a agulha com um ângulo de 10-15° com o bisel da agulha voltado para cima.</li>
		<li>Com este ângulo, o patógeno será injetado com uma profundidade de aproximadamente 300-500 µm. Para garantir que a injeção é bem executada, verifique que o volume injetado forma um galo que é absorvido alguns min após a injeção. Nota: O galo formada após a injeção será de aproximadamente 1 cm2. Esta é a área que será removida em ponto de tempo designado, para análise histológica ou molecular.</li>
		<li>Para pontos de tempo de menos de 24 h (recomendado) marca a área da infecção com uma caneta, uma vez que a colisão que formou com a injeção persiste por alguns minutos, após o qual é absorvido. Para pontos de tempo de 24 h ou mais, esta etapa não é necessária, porque uma úlcera ou um cisto será claramente visível.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. recolha e preparação para a coloração histológica da amostra
<ol><li>Eutanásia nos ratos, de acordo com os procedimentos institucionais.</li>
	<li>Usando pinças cirúrgicas, puxe a pele na fronteira do local injetado, previamente marcada com a caneta marcador. Usando uma tesoura cirúrgica, impostos especiais de consumo do site infectado pelo corte da pele seguindo a linha marcada. Nota: Tenha cuidado para separar a pele do peritônio usando uma tesoura de ponta redonda.</li>
	<li>Mergulhe a pele em um molde base descartável cheio de temperatura de corte ideal (OCT) composta, com o lado interno da pele virada para cima. Congele a amostra em nitrogênio líquido até que o composto torna-se branco. Não deixe que o nitrogênio líquido cobrir a amostra antes de que é completamente congelado como isso iria danificar a amostra. Nota: cuidado! Durante a etapa de 3.3, use um protetor facial para proteção de nitrogênio líquido.</li>
	<li>Se as amostras não forem utilizadas imediatamente para a preparação de slide, armazená-los rapidamente a-80 ° C. Nota: As amostras podem ser armazenadas a-80 ° C indefinidamente.</li>
</ol>4. preparação de Slides
<ol><li>Corte a amostra ao meio para preparar as fatias para histologia a partir do centro da amostra.</li>
	<li>Corte fatias grossas de 5 µm com um criostato. Nota: Para amostras de pele, a temperatura do criostato não deve ser superior a-25 ° C. Uma temperatura mais alta poderia causar uma fusão parcial de H-OCT e, portanto, as amostras não serão mantidas na posição correcta durante o procedimento de corte.</li>
	<li>Use corrediças do microscópio carregados positivamente para coletar as fatias.</li>
	<li>Se as fatias coletadas não forem utilizadas logo após o preparo, armazene-os em-20 ° C. Neste ponto, as fatias podem ser armazenadas a-20 ° C indefinidamente.</li>
</ol>5. hematoxilina & eosina coloração
<ol><li>Mancha os slides por imersão em hematoxilina de Gill para 4 min. lavar as lâminas em água corrente por 5 min.</li>
	<li>Mancha que os slides por imersão em solução de eosina Y para 1 min. lavagem as lâminas em água corrente por 5 min. enxágue os slides usando água destilada antes de continuar o protocolo.</li>
	<li>Desidrata-se por imersão em serialmente, aumentando as concentrações das soluções de etanol (50%, 70%, 80%, 95%, 100%). Mergulhe os slides por 15 s em cada solução de etanol.</li>
	<li>Limpe os slides pelo menos 2 min por imersão em um despachante histológica.</li>
	<li>Monte as lâminas usando o meio de montagem e lamínulas.</li>
	<li>Adquirir imagens dos slides com um scanner de slides do microscópio com uma ampliação de 40 X.</li>
</ol>6. ácido periódico-Schiff (PAS) coloração
<ol><li>Fixe as lâminas com 99.5% de acetona em temperatura ambiente por 1 min. lavar as lâminas em água corrente por 1 min.</li>
	<li>Mancha os slides por imersão em solução de ácido periódico (1 g/dL) por 5 min. Lave os slides em 3 mudanças de água destilada.</li>
	<li>Mancha os slides por imersão em do reagente de Schiff durante 15 min. lavar as lâminas em água corrente por 5 min.</li>
	<li>Mancha os slides por imersão em hematoxilina de Gill, por 5 min. Lave as lâminas em água corrente por 30 s.</li>
	<li>Desidrate os slides por imersão em 3 alterações de 100% de etanol. Mergulhe os slides por 15 s de cada vez.</li>
	<li>Limpe os slides pelo menos 2 min por imersão em um despachante histológica.</li>
	<li>Monte as lâminas usando o meio de montagem e lamínulas.</li>
	<li>Adquirir imagens dos slides com um scanner de slides do microscópio.</li>
</ol>7. recolha e preparação para a extração do RNA da amostra
<ol><li>Eutanásia nos ratos, de acordo com os procedimentos institucionais. Remova as amostras de pele, como no passo 3.2.</li>
	<li>Mergulhe as amostras em um tubo de snap-cap 2 mL com 1 mL do reagente para a extração de ácido guanidínio tiocianato-fenol-clorofórmio. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui e as amostras podem ser armazenadas a-80 ° C.</li>
	<li>Corte a amostra em pedaços de aproximadamente 0,2 cm2 usando pinça cirúrgica. Nota: cuidado! A maioria dos reagentes para isolamento de RNA são tóxicos e mutagênicos. Passos, 7.3 e 7.4 deve ser feito sob uma coifa.</li>
	<li>Esmagar a amostra com uma fresa de grânulo a uma velocidade de 20 oscilações/s para 20 min. como alternativa, um oleiro mecânico pode ser usado.</li>
	<li>Verificar a homogeneização eficaz das amostras, procurando a presença de pedaços intactos da pele. Repita este passo se as amostras não são completamente homogeneizadas.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 16.000 x g por 1 min. Mantenha os sobrenadantes para extração do RNA e descartar a pelota. Esta etapa é realizada para eliminar o cabelo e detritos que possam obstruir as colunas de extração.</li>
	<li>Prosseguir com a extração do RNA usando o RNA purificação colunas14.</li>
	<li>Use um espectrofotômetro para avaliar a concentração e purificação de RNA. Se extratos de RNA não são usados imediatamente para a preparação do cDNA, armazenar as amostras a-80 ° C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Belkaid, Y., Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dialogue+between+skin+microbiota+and+immunity.">Dialogue between skin microbiota and immunity.</a> Science. 346 (6212), 954-959 (2014).</li><li>Kashem, S. W., Kaplan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+Immunity+to+Candida+albicans.">Skin Immunity to Candida albicans.</a> Trends Immunol. 37 (7), 440-450 (2016).</li><li>Havlickova, B., Czaika, V. A., Friedrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiological+trends+in+skin+mycoses+worldwide.">Epidemiological trends in skin mycoses worldwide.</a> Mycoses. 51, 2-15 (2008).</li><li>Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+Bloodstream+Infections+in+US+Hospitals:+Analysis+of+24,179+Cases+from+a+Prospective+Nationwide+Surveillance+Study.">Nosocomial Bloodstream Infections in US Hospitals: Analysis of 24,179 Cases from a Prospective Nationwide Surveillance Study.</a> Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).</li><li>Romani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+to+fungal+infections.">Immunity to fungal infections.</a> Nat Rev Immunol. 4 (1), 11-24 (2004).</li><li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+Candida+infections.">Pathogenesis of Candida infections.</a> J Am Acad Dermatol. 31 (3), S2-S5 (1994).</li><li>MacCallum, D. M., Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+events+in+the+intravenous+challenge+model+for+experimental+Candida+albicans+infections+in+female+mice.">Temporal events in the intravenous challenge model for experimental Candida albicans infections in female mice.</a> Mycoses. 48 (3), 151-161 (2005).</li><li>Dai, T., Kharkwal, G. B., Tanaka, M., Huang, Y. -. Y., Bil de Arce, V. J., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+external+traumatic+wound+infections.">Animal models of external traumatic wound infections.</a> Virulence. 2 (4), 296-315 (2018).</li><li>Gaspari, A. A., Burns, R., Nasir, A., Ramirez, D., Barth, R. K., Haidaris, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD86+(B7-2),+but+not+CD80+(B7-1),+expression+in+the+epidermis+of+transgenic+mice+enhances+the+immunogenicity+of+primary+cutaneous+Candida+albicans+infections.">CD86 (B7-2), but not CD80 (B7-1), expression in the epidermis of transgenic mice enhances the immunogenicity of primary cutaneous Candida albicans infections.</a> Infect Immun. 66 (9), 4440-4449 (1998).</li><li>Koh, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+Candida+gastrointestinal+colonization+and+dissemination.">Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination.</a> Eukaryot Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).</li><li>Mear, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+Airway+Exposure+Primes+the+Lung+Innate+Immune+Response+against+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+through+Innate+Lymphoid+Cell+Recruitment+and+Interleukin-22-Associated+Mucosal+Response.">Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response.</a> Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2014).</li><li>Leoni, G., Neumann, P. -. A., Sumagin, R., Denning, T. L., Nusrat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair:+role+of+immune-epithelial+interactions.">Wound repair: role of immune-epithelial interactions.</a> Mucosal Immunol. 8 (5), 959-968 (2015).</li><li>Fonzi, W. A., Irwin, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isogenic+strain+construction+and+gene+mapping+in+Candida+albicans.">Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans.</a> Genetics. 134 (3), 717-728 (1993).</li><li>Santus, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+infections+are+eliminated+by+cooperation+of+the+fibrinolytic+and+innate+immune+systems.">Skin infections are eliminated by cooperation of the fibrinolytic and innate immune systems.</a> Sci Immunol. 2 (15), (2017).</li><li>Florescu, D. F., Brostrom, S. E., Dumitru, I., Kalil, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+Skin+Abscess+in+a+Heart+Transplant+Recipient.">Candida albicans Skin Abscess in a Heart Transplant Recipient.</a> Infect Dis Clin Pract. 18 (4), 243-246 (2010).</li><li>Pradeu, T., Cooper, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+danger+theory:+20+years+later.">The danger theory: 20 years later.</a> Front Immunol. 3, 287 (2012).</li><li>Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+play+in+four+acts:+Staphylococcus+aureus+abscess+formation.">A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation.</a> Trends Microbiol. 19 (5), 225-232 (2011).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui nós descrevemos um método de infecção de c. albicans para estudar o processo inflamatório que é iniciado após a entrada de fungosa no derma profunda.
Mesmo que a formação de abscesso da pele é um evento relativamente raro em cima de infecção de c. albicans 15, injeção do fungo diretamente no derma profunda permite não só o estudo da formação de abscesso orientada por fungos, mas também a análise de imune específica células qu...

O corpo humano é coberto com um número extremamente elevado de microorganismos. A superfície da pele é o habitat de quase 1 milhão de bactérias por centímetro quadrado1. Este número, no entanto, não reflete a completa variedade de microorganismos que coloniza a pele. Além de bactérias, o corpo humano é colonizado por muitas espécies de fungos, incluindo c. albicans, que é capaz de sobreviver tanto as mucosas e a pele de nível2.
Nos últimos anos, a percentagem de pessoas diagnosticadas com infecções fúngicas aumentou enormemente. Isto é principalmente devido ao maior número de pessoas imunodeprimidas, ou seja, pacientes HIV-positivos e pacientes que passaram por quimioterapia ou drogas imunossupressoras após transplante3. Em um estudo de vigilância realizado nos Estados Unidos, Wisplinghoff et al mostrou que 9,5% das infecções nosocomiais corrente sanguínea foram causadas por espécies de Candida 4. Devido à maior ocorrência de infecções fúngicas e especialmente devido à elevada percentagem de Candida espécies encontradas durante infecções na corrente sanguínea, compreender como este patógeno escapa do controle do sistema imunológico é extremamente importante.
C. albicans é um fungo dimórfico que cresce em diferentes formas morfológicas tais como levedura, vermiforme, pseudo-hifas e hifas consoante as condições ambientais5. Na sua forma hifal, c. albicans mostra sua mais alta capacidade de invasividade e tem a capacidade de penetrar o epitélio6.
C. albicans infecções têm sido estudadas usando várias abordagens experimentais. O modelo mais comum de infecção é a injeção intravenosa de c. albicans levedura7. No entanto, este modelo não leva em consideração todos os processos que acontecer antes que o fungo consegue espalhar-se para a corrente sanguínea. Outro modelo aproveita a capacidade de c. albicans para invadir o epitélio. Este método, também conhecido como, o papel da areia modelo8, foi desenvolvido por Gaspari et al . em 1998,9e consiste no uso de papel da areia para friccionar a pele, eliminando assim o estrato córneo antes de aplicar a c. albicans. Este procedimento permite que o fungo penetrar o epitélio, possibilitando assim a análise das habilidades invasivas deste patógeno. Finalmente, outros modelos de infecções para o gastrointestinal10 e respiratórias11 têm sido utilizados em diferentes estudos.
A formação de uma ferida (como no modelo de papel da areia) provoca a ativação de várias vias, incluindo o recrutamento de células imunes e ativação, a fim de promover a cura do processo12. Isto pode alterar ou mascarar a resposta imune suscitou especificamente contra o patógeno, conduzindo assim a confundir os resultados.
Aqui nós descrevemos um método de infecção da pele que evita a formação de ferida inicial e a indução de um ambiente inflamatório basal. Para manter a estrutura epitelial intacta, injetamos diretamente c. albicans em sua forma hifas no derma profunda. Mesmo que uma única injeção pode provocar inflamação suave, a quantidade de inflamação é limitada e restrito em comparação com a formação de uma ferida aberta, como no modelo de papel da areia. A abordagem que descrevemos aqui permite o estudo da resposta imune à infecção fúngica e disseminação, evitando o ambiente inflamatório pré-existente e excessivo causado por danos mecânicos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB4053L</td>
			<td>warm in 37 &#176;C bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-OCT compound</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td>R0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill&#39;s Hematoxilyn</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td>09-178-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution, alcoholic</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td>09-209-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>scharlau</td>
			<td>ET00232500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citro-HISTOCLEAR</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td>R0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt, mounting medium</td>
			<td>bio-optica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAS staining system</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>395B-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology</td>
			<td>Applichem PanReac</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>8451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Applichem PanReac</td>
			<td>A1070,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tubes 2 mL</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>30121597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Wear eye protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Counter-Particle Count</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5415 R</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC 3000 Microtome Cryostat</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLiser</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base mould disposable</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td>2781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged bio microscope slides</td>
			<td>bio-optica</td>
			<td>09-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips 24 x 50 mm</td>
			<td>thermo scientific</td>
			<td>11911998</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deep dermal injection as a model of candida albicans skin infection for histological analyses

A pele é um órgão extremamente estendido do corpo e, devido a esta grande superfície, é continuamente exposto a microorganismos. Danos de pele podem facilmente levar a infecções na derme, que por sua vez, pode, resultar na disseminação de patógenos para a corrente sanguínea. Compreender como o sistema imunológico combate infecções na fase inicial e como o host pode eliminar os patógenos, é um passo importante para definir a base para futuras intervenções terapêuticas. Aqui descrevemos um modelo de infecção por Candida albicans que pode visualizar os processos que ocorrem durante uma infecção, incluindo quando o patógeno já passou a barreira epitelial, bem como a resposta imune provocada pela de c. albicans invasão. Usamos este modelo de infecção para realizar análises histológicas que mostram as células imunitárias que se infiltrar a pele, bem como a presença e a localização do patógeno. As amostras coletadas após a infecção pode ser processada para extração de RNA.

Através da injecção de patógeno diretamente no derma profunda, a morfologia estrutural do tecido permanece intacta (figura 1A).
A manutenção da integridade estrutural da pele permite a detecção de células do sistema imunológico e sua localização no local da infecção. A maior ampliação mostrada na figura 1B revela que o abscesso é composto principalmente...

Watch this Scientific Journal Video about Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses at JoVE.com

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Profunda dérmica injeção como um modelo de Candida albicans de infecção da pele para análise histológica

Aqui descrevemos um protocolo que permite a análise histológica e molecular de amostras de pele após injeção intradérmica de Candida albicans . Esse protocolo mantém a integridade estrutural da pele e permite a localização do tecido-residente ou recém recrutadas células do sistema imunológico, bem como a distribuição do patógeno.

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

deep-dermal-injection-as-model-candida-albicans-skin-infection-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

10.7K visualizações.  University of Milano-Bicocca. Aqui descrevemos um protocolo que permite a análise histológica e molecular de amostras de pele após injeção intradérmica de Candida albicans . Esse protocolo mantém a integridade estrutural da pele e permite a localização do tecido-residente ou recém recrutadas células do sistema imunológico, bem como a distribuição do patógeno.

Vídeo: Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third most common infection in US hospitals. Different manifestations of candidiasis are associated with biofilm formation, both on host tissues and/or medical devices (i.e. catheters). Biofilm formation carries negative clinical implications, as cells within the biofilms are protected from host immune responses and from the action of antifungals. We have developed a simple, fast and robust in vitro model for the formation of C. albicans biofilms using 96 well microtiter-plates, which can also be used for biofilm antifungal susceptibility testing. The readout of this assay is colorimetric, based on the reduction of XTT (a tetrazolium salt) by metabolically active fungal biofilm cells. A typical experiment takes approximately 24 h for biofilm formation, with an additional 24 h for antifungal susceptibility testing. Because of its simplicity and the use of commonly available laboratory materials and equipment, this technique democratizes biofilm research and represents an important step towards the standardization of antifungal susceptibility testing of fungal biofilms.

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

We describe a simple, rapid and robust method for the formation of Candida albicans biofilms using 96 well microtiter plates and its utility in antifungal susceptibility testing of cells within biofilms.

A 96 Bem microtitulação Método da Placa com base para a Formação Monitoramento e Teste de susceptibilidade antifúngica de Candida albicans Biofilmes

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Imunologia e Infecção

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Utilização de<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como um organismo modelo para estudar<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infecção

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Estudar comunidades microbianas<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um modelo de interação mediada por anfitrião entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nas Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus formation in veins remain obscure. Lack of mobility (e.g., after surgery or long-haul flights) is one of the main factors leading to DVT. The pathophysiological consequence of the lack of mobility is blood flow stagnation in venous valves. Here, a model is described that mimics such flow disturbance as a thrombosis-driving factor. In this model, partial flow restriction (stenosis) in the inferior vena cava (IVC) is created. Closure of about 90% of the IVC lumen for 48 h results in development of thrombi structurally similar to those in humans. The similarities are: i) most of the thrombus volume is red, i.e., consists of red blood cells and fibrin, ii) presence of a white part (lines of Zahn), iii) non-denuded endothelial monolayer, iv) elevated plasma D-Dimer levels, and v) possibility to prevent thrombosis by low molecular weight heparin. Limitations include variable size of thrombi and the fact that a certain percentage of wild-type mice (0 - 35%) may not produce a thrombus. In addition to visual observation and measurement, thrombi may be visualized by non-invasive technologies, such as ultrasonography, which allows for monitoring the dynamics of thrombus development. At shorter time points (1 - 6 h), intravital microscopy may be applied to directly observe events (e.g., recruitment of cells to the vessel wall) preceding thrombus formation. Use of this method by several teams around the world has made it possible to uncover basic mechanisms of DVT initiation and identify potential targets that might be beneficial for its prevention.

We describe here stenosis in the inferior vena cava as a murine model of deep vein thrombosis. This model recapitulates blood flow restriction, one of the major triggers of venous thrombosis in humans.

Estenose da veia Cava Inferior: um modelo murino de trombose venosa profunda

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Visualização da formação de biofilmes de Candida albicans , usando um dispositivo Microfluidic automatizada

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of experimental models needs to be as rigorous as that applied for human samples. Indeed, drawing reliable and accurate conclusions is critically influenced by the quality of tissue section preparation. Here, we describe a protocol for histopathological analysis of murine tissues that implements several automated steps during the procedure, from the initial preparation to the paraffin embedding of the murine samples. The reduction of methodological variables through rigorous protocol standardization from automated procedures contributes to increased overall reliability of murine pathological analysis. Specifically, this protocol describes the utilization of automated processing and embedding robotic systems, routinely used for the tissue processing and paraffin embedding of human samples, to process murine specimens of intestinal inflammation. We conclude that the reliability of histopathological examination of murine tissues is significantly increased upon introduction of standardized and automated techniques.

Lack of standardization for murine tissue processing reduces the quality of murine histopathological analysis as compared to human specimens. Here, we present a protocol to perform histopathological examination of murine inflamed and uninflamed colonic tissues to show the feasibility of robotic systems routinely used for processing and embedding&#160;human samples.

Usando sistemas robóticos para processar e incorporar Colônica murino amostras para análise histológica

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of ...

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic growth of C. albicans SN425, the inoculums grew on Yeast Nitrogen Base media. For biofilm formation, RPMI 1640 media, which have high concentrations of amino acids, were applied to help biofilm growth. Biofilms of 48 h were treated twice a day for a period of 1 min with a non-coherent light device (red light; wavelength = 635 nm; energy density = 87.6 J&#183;cm-2). As a positive control (PC), 0.12% chlorhexidine (CHX) was applied, and as a negative control (NC), 0.89% NaCl was applied to the biofilms. Colony forming units (CFU), dry-weight, soluble and insoluble exopolysaccharides were quantified after treatments. Briefly, the protocol presented here is simple, reproducible and provides answers regarding viability, dry-weight and extracellular polysaccharide amounts after red light treatment.

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcome of red light application on the growth of Candida albicans biofilm. A non-coherent red light device with the wavelength of 635 nm and energy density of 87.6 J&#183;cm-2 was applied throughout the growth of Candida albicans biofilms for 48 h.

Diária fototerapia com luz vermelha para regular crescimento de biofilme de Candida albicans

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

Visualização de candida albicans no trato gastrointestinal murina usando fluorescente in situ hibridização

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch from yeast-form growth to hyphal growth. Cells initiating this process become adherent to surfaces as well as to each other, with the resulting development of a biofilm colony. This commonly occurs not only on mucosal tissue surfaces in yeast infections, but also on medical implants such as catheters. It is well known that biofilm cells are resistant to antifungal drugs, and that cells that shed from the biofilm can lead to dangerous systemic infections. Biofilms range from heavily translucent to opaque due to refractive heterogeneity. Therefore, fungal biofilms are difficult to study by optical microscopy. To visualize internal structural, cellular, and subcellular features, we clarify fixed intact biofilms by stepwise solvent exchange to a point of optimal refractive index matching. For C. albicans biofilms, sufficient clarification is attained with methyl salicylate (n = 1.537) to enable confocal microscopy from apex to base in 600 &#181;m biofilms with little attenuation. In this visualization protocol we outline phase contrast refractometry, the growth of laboratory biofilms, fixation, staining, solvent exchange, the setup for confocal fluorescence microscopy, and representative results.

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

To view and quantify the internal features of Candida albicans biofilms, we prepare fixed intact specimens that are clarified by refractive index matching. Then, optical sectioning microscopy can be used to obtain three-dimensional image data though the full thickness of the biofilm.

Esclarecendo e Imagem Candida albicans Biofilmes

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...