이 방법은 HIV 프로 바이러스 및 다른 세포 모형의 유전 조성을 결정하는 것과 같은 HIV 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 특히 유전적으로 손상되지 않고 잠재적으로 복제 능력이있는 사람들을 식별합니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 HIV 감염 세포에서 거의 전체 길이 HIV 프로 바이러스를 증폭시킨 다음 다음 세대 염기서열에 의해 이것들을 순서화할 수 있다는 것입니다.
먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 모든 버퍼를 준비합니다. 세포 펠릿을 얻고 백만 세포당 100 마이크로리터의 리시스 버퍼를 추가하십시오. 위아래로 파이프를 통해 섞는다.
1시간 동안 섭씨 55도에서 열 사이클러에 배양한 다음 섭씨 85도를 15분 동안 추가하여 세포를 분해합니다. 단일 HIV-1 DNA 프로바이러스 증폭을 시작하려면 텍스트 프로토콜 중 하나에 나열된 바와 같이 첫 번째 라운드 PCR에 대한 시약을 혼합한다. 96 개의 잘 PCR 플레이트에 85 개의 우물에 38 마이크로 리터를 추가하고이 플레이트를 PCR 1로 레이블을 지정합니다.
그 후, PCR 1 플레이트를 게놈 DNA의 첨가를 위해 지정된 명확한 영역으로 이동한다. 삼액염염을 사용하여 유전체 DNA를 1 대 3대 1대 81의 비율로 희석하여 각 희석제의 45마이크로리터를 준비하도록 합니다. 각 샘플에 희석된 게놈 DNA 2개와 각 음량 조절에 염산염 산염 2개를 첨가합니다.
양수 컨트롤을 제외한 플레이트 전체를 잘 밀봉하십시오. 다음으로, 양수 제어의 추가를 위해 지정된 영역으로 이동합니다. 양수 제어의 마이크로리터 2개를 해당 우물에 추가한 다음 플레이트를 완전히 밀봉합니다.
PCR 플레이트 스피너를 사용하여 잠시 PRC 1 플레이트를 회전시키고 우물 의 측면에서 잔류 내용을 당깁니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 열 사이클러에서 PCR 1 플레이트를 실행합니다. 다음으로, 테이블 1에 나열된 대로 PCR의 두 번째 라운드에 대한 시약을 혼합합니다.
이 PCR 2 믹스의 28 마이크로 리터를 새로운 96 웰 PCR 플레이트의 85 우물에 추가합니다. 이 플레이트를 PCR 2로 레이블을 지정합니다. 플레이트 스피너를 사용하여 PCR 1 플레이트를 잠시 회전하여 우물 의 측면에서 잔류 내용을 당깁니다.
이 접시의 각 웰에 80 개의 미트리스 염산염을 추가합니다. 그 후, 뮤틀리 채널 파이펫을 사용하여 PCR 1 플레이트의 각 웰에서 PCR 2 플레이트의 해당 우물로 두 개의 마이크로리터를 전송합니다. 투명 접착제 랩으로 PCR 2 플레이트를 밀봉합니다.
플레이트 스피너에서 PCR 2 플레이트를 간단히 회전시합니다. 한편, PCR 1 플레이트를 영하 20도의 장기 보관용 열 밀봉 필름으로 밀봉하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 열 사이클러에서 PCR 2 플레이트를 실행합니다.
그런 다음 잠시 PCR 2 플레이트를 회전하여 우물 의 측면에서 잔류 내용을 끌어 당깁니다. 멀티 채널 파이펫을 사용하여 각 우물에 60 마이크로리터의 미산염을 추가합니다. 다음으로, 에티듐 브로마이드를 함유한 1% 아가로즈 젤을 잘 프리캐스트한 48개의 48개에 각각 15마이크로리터를 실행합니다.
증폭된 제품과 대략적인 크기를 포함하는 우물을 식별하고 젤 이미지를 저장합니다. 그 후, 우물의 30% 이하가 증폭된 제품에 대해 긍정적이지 않은 희석을 결정합니다. 먼저 플레이트 스피너를 사용하여 PCR 2 플레이트를 잠시 회전시키고 우물 의 측면에서 잔류 내용을 당깁니다.
증폭된 제품을 함유한 우물에서 40마이크로리터를 새로운 96웰 미디 플레이트의 해당 우물로 옮기. 다음으로 자기 사료 기반 정화 키트를 설정하여 마그네틱 구슬을 실온으로 가져와 80 %의 신선한 용액을 준비합니다. 구슬이 실온 소용돌이에 도달하면 철저히 재중단되었는지 확인합니다.
멀티 채널 파이펫을 사용하여 미디 플레이트의 각 웰에 40 마이크로리터의 증폭 된 제품에 40 마이크로 리터의 구슬을 추가하십시오. 10번 위아래로 부드럽게 파이펫을 섞어 섞는다. 실온에서 5분간 배양하세요.
그런 다음 접시를 자기 스탠드로 옮기고 2 분 동안 쉬게하십시오. 이 후, 제거하고 상체를 폐기합니다. 플레이트가 여전히 스탠드에 있는 동안 각 웰에 80% 에탄올 용액의 200마이크로리터를 추가하여 구슬을 씻으시다.
실온에서 30초 동안 배양한 다음 상체를 제거하고 폐기합니다. 에탄올을 첨가하는 것부터 상퍼를 버리는 것까지 이 세척 과정을 한 번 반복합니다. 멀티 채널 파이펫을 사용하면 과도한 에탄올이 제거됩니다.
구슬을 15분 동안 건조시키세요. 이 후 스탠드에서 플레이트를 제거합니다. 각 웰에 용출 버퍼 30 마이크로리터를 넣고 10번 위아래로 부드럽게 파이펫을 섞습니다.
실온에서 2분간 배양하세요. 접시를 마그네틱 스탠드에 다시 놓고 2분 동안 쉬게 합니다. 멀티 채널 파이펫을 사용하여, 새로운 96 웰 PCR 플레이트의 해당 우물에 상체의 25 마이크로 리터를 전송합니다.
다음으로, 스펙트럼 광계를 사용하여 각 증폭된 DNA 제품의 대략적인 농도를 결정하고 기록한다. 이중 좌초 된 DNA 정량화 키트를 설정하고 멸균 DNAs가없는 물에서 버퍼를 1 번 희석시. 완충제의 마이크로리터 99마이크로리터를 평평한 바닥 조직 배양 판에 적절한 수의 빈 우물에 넣습니다.
그런 다음 3개의 빈 우물에 버퍼 100 마이크로리터를 추가합니다. 측정될 각 증폭 된 제품에 대해 버퍼를 포함하는 각 우물에 삼중 정제된 DNA의 마이크로 리터 1 개를 추가합니다. 람다 이중 좌초 DNA10 마이크로리터 당 두 나노 그램에서 10 주름을 희석하여 표준을 준비하기 위해 마이크로 리터 당 제로 나노 그램을 가리킵니다.
각 이중 좌초 DNA 표준의 100 마이크로리터를 3개의 우물에 추가합니다. 버퍼로 꽃염료를 1~200개를 희석시다. 샘플, 빈 또는 표준이 포함된 각 웰에 100마이크로리터를 빠르게 추가하고 위아래로 파이펫팅하여 혼합합니다.
그 후, 빛과의 접촉을 피하기 위해 호일로 접시를 덮습니다. 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 플로레스징 방출을 기록합니다. 기록된 측정을 사용하여 각 샘플에서 이중 좌초 된 DNA의 농도를 결정합니다.
그런 다음 각 정제된 제품을 물로 희석하여 마이크로리터당 2나노그램의 제로포인트 농도로 희석합니다. 중첩 된 PCR에 따라 증폭 된 제품은 1 % 아가로즈 젤로 실행됩니다. PCR의 초기 품질은 컨트롤을 검사하여 결정할 수 있습니다.
증폭된 제품을 포함하는 음의 제어가 오염을 나타내고 증폭된 제품 없이 양수 컨트롤이 충분하지 않은 것을 나타냅니다. 단일 증폭 된 프로 바이러스를 포함하는 엔드 포인트 희석에서 실행되는 우물만 시퀀싱을 위해 고려됩니다. 다른 길이의 여러 증폭 된 프로 바이러스를 포함하는 우물은이 단계에서 시각화 할 수 있지만, 시퀀싱을 위해 선택해서는 안됩니다.
드 노보 어셈블리의 경우, 조립된 연속지의 품질은 충분한 깊이와 균일한 커버리지를 위해 평가될 수 있다. 혼합 된 인구는 또한 고르지 않은 범위의 존재에 의해이 단계에서 식별 될 수있다. 한 참가자로부터 격리된 시퀀스의 시각적 표현은 시퀀스의 97%가 결함이 있음을 나타냅니다.
이펙터 및 과도 메모리 CD4 양성 T 셀에서 발견되는 온전한 서열. 이 절차를 시도하는 동안 제한 희석에서 얻은 증폭 된 제품만, 즉 우물의 30 % 이상이 양성이며 단일 프로 바이러스를 포함하고 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 증폭 된 제품은 HIV 프로 바이러스의 유전 적 구성을 결정하기 위해 서열화 될 수 있습니다.
개발 후, 이 기술은 유전적으로 손상되지 않은 HIV 프로바이러스 및 치료에 있는 환자에 있는 다른 세포 모형의 분포를 탐구하기 위하여 HIV의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다 유전적으로 손상되지 않고 잠재적으로 복제 유능한 proviruses 숨기는 곳에 결정하기 위하여. HIV 감염 된 세포와 함께 작업 하는 것은 위험 할 수 있으며 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하 고 인증 된 실험실 작동이 절차를 수행 하는 동안 항상 취해야 하는 예방 조치.
