Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du VIH, telles que la détermination de la composition génétique des provirus vih et des différents types de cellules. En particulier l’identification de ceux qui sont génétiquement intacts et potentiellement la réplication compétente. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle nous permet d’amplifier des provirus VIH presque pleine longueur à partir de cellules infectées par le VIH unique, puis de les séquencer par séquençage de prochaine génération.
Pour commencer, préparez tous les tampons tels qu’ils sont décrits dans le protocole de texte. Obtenez une pastille cellulaire et ajoutez une centaine de microlitres de tampon de lyse par million de cellules. Mélanger en pipetant de haut en bas.
Lyse les cellules en couveant dans un cycleur thermique à 55 degrés Celsius pendant une heure, puis ajouter 85 degrés Celsius pendant 15 minutes. Pour commencer à amplifier les provirus de l’ADN vih-1, mélanger les réacollants pour le PCR du premier tour comme indiqué dans le tableau un du protocole de texte. Ajouter 38 microlitres à 85 puits dans une plaque PCR de 96 puits et étiqueter cette plaque comme PCR 1.
Après cela, déplacez la plaque PCR 1 vers une zone claire désignée pour l’ajout d’ADN génomique. L’utilisation du trichlorure dilue périodiquement l’ADN génomique d’un rapport de un à trois pour un rapport de un à 81 en s’assurant de préparer 45 microlitres de chaque dilution. Ajouter deux microlitres d’ADN génomique dilué à chaque puits d’échantillon et deux microlitres d’hydrochlorure de tris à chaque puits de contrôle négatif.
Sceller toute la plaque à l’exception du puits de contrôle positif. Ensuite, déplacez-vous vers une zone désignée pour l’ajout du contrôle positif. Ajouter deux microlitres du contrôle positif au puits correspondant, puis sceller complètement la plaque.
Utilisez une essoreuse à plaques PCR pour faire tourner brièvement la plaque PRC 1 et retirer tout contenu résiduel des côtés des puits. Exécutez la plaque PCR 1 dans le cycleur thermique tel que décrit dans le protocole de texte. Ensuite, mélangez les reagents pour le deuxième tour de PCR comme indiqué dans le tableau un.
Ajouter 28 microlitres de ce mélange PCR 2 à 85 puits d’une nouvelle plaque PCR bien 96. Étiquetez cette plaque comme PCR 2. À l’aide d’une essoreuse à plaques, faites tourner brièvement la plaque PCR 1 pour retirer tout contenu résiduel des côtés des puits.
Ajouter 80 microlitres d’hydrochlorure tris à chaque puits de cette plaque. Après cela, utilisez une pipette mutli-canal pour transférer deux microlitres de chaque puits de la plaque PCR 1 aux puits correspondants dans la plaque PCR 2. Sceller la plaque PCR 2 avec une enveloppe adhésive claire.
Faites tourner brièvement la plaque PCR 2 dans la essoreuse de plaque. Pendant ce temps, sceller la plaque PCR 1 avec un film d’étanchéité à la chaleur pour un stockage à long terme à moins 20 degrés Celsius. Exécutez la plaque PCR 2 dans un cycleur thermique tel que décrit dans le protocole de texte.
Ensuite, tournez brièvement la plaque PCR 2 pour retirer tout contenu résiduel des côtés des puits. À l’aide d’une pipette multicanal, ajouter 60 microlitres d’hydrochlorure de tris à chaque puits. Ensuite, exécutez 15 microlitres de chaque puits sur deux 48 gels d’agarose préfabricés de 48 puits qui contiennent du bromure d’éthidium.
Identifiez les puits contenant le produit amplifié et leurs tailles approximatives et enregistrez l’image du gel. Après cela, déterminer la dilution à laquelle pas plus de 30 pour cent des puits sont positifs pour le produit amplifié. Tout d’abord, utilisez une essoreuse à plaques pour faire tourner brièvement la plaque PCR 2 et retirer tout contenu résiduel des côtés des puits.
Transférer 40 microlitres des puits contenant du produit amplifié vers les puits correspondants d’une nouvelle plaque midi de 96 puits. Ensuite, établissez un kit de purification à base d’alimentation magnétique en vous assurant d’amener les perles magnétiques à température ambiante et de préparer une nouvelle solution de 80 pour cent d’éthanol. Une fois que les perles atteignent la température ambiante vortex pour s’assurer qu’ils sont complètement résuspendus.
À l’aide d’une pipette multicanal, ajouter 40 microlitres de perles aux 40 microlitres de produits amplifiés dans chaque puits de la plaque midi. Mélanger en faisant glisser doucement de haut en bas 10 fois. Incuber à température ambiante pendant cinq minutes.
Ensuite, transférez la plaque sur un support magnétique et laissez-la reposer pendant deux minutes. Après cela, retirez et jetez le surnatant. Avec la plaque encore sur le stand, laver les perles en ajoutant deux cents microlitres de la solution éthanol à 80 pour cent à chaque puits.
Incuber à température ambiante pendant 30 secondes, puis retirer et jeter le surnatant. Répétez ce processus de lavage une fois, de l’ajout de l’éthanol au rejet du surnatant. À l’aide d’une pipette multicanal, éliminer tout excès d’éthanol.
Laisser sécher l’air des perles pendant 15 minutes. Après cela, retirez la plaque du support. Ajouter 30 microlitres de tampon d’élitution à chaque puits et mélanger en pipetting doucement de haut en bas 10 fois.
Incuber à température ambiante pendant deux minutes. Remettre la plaque sur le support magnétique et laisser reposer pendant deux minutes. À l’aide d’une pipette multicanal, transférer 25 microlitres du supernatant aux puits correspondants d’une nouvelle plaque PCR de puits 96.
Ensuite, utilisez un photomètre spectra pour déterminer et enregistrer la concentration approximative de chaque produit d’ADN amplifié. Mettez en place une double trousse de quantification de l’ADN échouée et diluez le tampon à une fois dans de l’eau stérile sans ADN. Ajouter 99 microlitres du tampon à un nombre approprié de puits vides dans une plaque de culture de tissu à fond plat.
Ensuite, ajoutez une centaine de microlitres de tampon à trois puits vierges. Pour chaque produit amplifié à mesurer ajouter un microlitre d’ADN purifié en triplicate à chaque tampon contenant bien. Diluer l’ADN double brin lambda 10 fois de deux nanogrammes par microlitre au point zéro nanogrammes par microlitre pour préparer les normes.
Ajouter une centaine de microlitres de chaque norme d’ADN à double brin à trois puits. Diluer le colorant de florescence d’un à deux cents avec tampon. Ajoutez rapidement une centaine de microlitres à chaque puits qui contient un échantillon, blanc ou standard et mélangez en pipetting de haut en bas.
Après cela, couvrir la plaque de papier d’aluminium pour éviter tout contact avec la lumière. À l’aide d’un lecteur de microplaque, enregistrez l’émission de florescence. Utilisez les mesures enregistrées pour déterminer la concentration d’ADN double brin dans chaque échantillon.
Ensuite, diluer chaque produit purifié avec de l’eau à une concentration de zéro point deux nanogrammes par microlitre. Après pcr imbriqué, les produits amplifiés sont exécutés sur un gel d’agarose d’un pour cent. La qualité initiale du PCR peut être déterminée en inspectant les commandes.
Comme les contrôles négatifs contenant des produits amplifiés indiquent une contamination et que les contrôles positifs sans produit amplifié indiquent une amplification insuffisante. Seuls les puits fonctionnent à la dilution du point final qui contiennent des provirus amplifiés simples sont considérés pour le séquençage. Bien que les puits contenant plusieurs provirus amplifiés de différentes longueurs puissent être visualisés à ce stade, ils ne devraient pas être sélectionnés pour le séquençage.
Pour l’assemblage de novo, la qualité des contigs assemblés peut être évaluée pour une profondeur et une evenness suffisantes de couverture. Les populations mixtes peuvent également être identifiées à ce stade par la présence d’une couverture inégale. La représentation visuelle des séquences isolées d’un participant révèle que 97 p. 100 de leurs séquences sont défectueuses.
Avec des séquences intactes trouvées dans l’effecteur et la mémoire transitoire CD4 cellules T positives. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que seuls les produits amplifiés obtenus à la dilution limitative, c’est-à-dire là où pas plus de 30 pour cent des puits sont positifs, contiennent un seul provirus. À la suite de cette procédure, des produits amplifiés peuvent être séquencés pour déterminer la composition génétique des provirus anti-VIH.
Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine du VIH pour explorer la distribution de provirus génétiquement intacts du VIH et de différents types de cellules chez les patients sous traitement afin de déterminer où se cachent les provirus génétiquement intacts et potentiellement réplicateurs compétents. N’oubliez pas que le travail avec les cellules infectées par le VIH peut être dangereux et que des précautions telles que le port d’équipement de protection individuelle approprié et le travail d’un laboratoire certifié doivent toujours être prises pendant l’exécution de cette procédure.
