אנו מודים אטסשי המייאוואקי וחמאת הירושי לעצה שלהם על הניסויים elAbSca, צ'ארלס Yokoyama לעריכה של כתב היד, Ohshima אריקו, מיוקי Kishino לסיוע טכני שלהם. עבודה זו נתמך על ידי קרנות מחקר של RIKEN תוצרת הארץ, Grants-in-Aid למחקר מדעי של משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, טכנולוגיה (MEXT) של יפן כדי תוצרת הארץ (אזורים חדשני "Mesoscopic Neurocircuitry"; 22115004), אס (25890023).

כל ההליכים ניסיוני היו אושרה על ידי RIKEN Wako חיה ניסויים ועדת ועדת הבטיחות של הניסוי רקומביננטי RIKEN גנטי, שבוצעה על פי הנחיות המוסדי של מתקנים בעלי חיים של מדע המוח RIKEN המכון.
1. הכנת הדמיה צ'יימברס
<ol><li>
הדמיית חדר19
	<ol>
<li>באמצעות יריעות גומי סיליקון, להכין חדר עם עובי של 5 מ מ, רצפת לוחות בעוביים שונים. בנוסף, מכינים צלחות פטרי עם או בלי זכוכית תחתון (איור 1 א').</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מרווח פרוסה
	<ol>
<li>להכין את מפרידי להחזיק דגימות, באמצעות יריעות גומי סיליקון עם עובי של 0.5 מ מ (איור 1C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. מעקב הזרקה
הערה: לבצע זריקות לתוך פונס (2.1) או רקתי עליון (2.2). זריקה לתוך הנוירונים הקרנה מוחי תת תווית פונס באזור המוח רחב כולל האזורים חזותי, מנוע, תוך הזרקה לתוך הנוירונים הקרנה מוחי תת תוויות רקתי עליון באזור החזותי. לניסויים שליטה, להזריק תמיסת. סאלין במקום כולירה fluorescently התווית על-ידי יחידת משנה של הרעלן B. לשם קיום תנאי סטרילי להשתמש בכפפות פלסטיק לנקות עם אתנול וציוד מעוקר.
<ol><li>
לעשות זריקות לתוך פונס של עכברים בוגרים.
	<ol>
<li>לצייר µL 1 של כולירה fluorescently התווית על-ידי יחידת משנה של הרעלן B (25 µg/µL ב- PBS) לתוך מזרק G המילטון 26.</li>
		<li>במקום משאבת מזרק על המזרק.</li>
		<li>מקם את המזרק ואת משאבת את הכלי המחזיק תחמן על מכשיר stereotaxic. להטות manipulator 12° posteriorly מן הציר האנכי.</li>
		<li>עזים ומתנגד זכר או נקבה בוגרת עכבר (C57BL/6J או Tlx3-cre/Ai9) על ידי הזרקת סודיום פנטוברביטל intraperitoneally (60 מ"ג/ק"ג משקל גוף) או על ידי מתן איזופלוריין (2-3%). המתן עד העכבר הופך ללא תגובה כאשר זנבו הוא צבט עם מלקחיים, המציין כי העכבר הוא מורדם לחלוטין.</li>
		<li>הנח את העכבר על הכלי stereotaxic.</li>
		<li>הסר בזהירות את השיער בעזרת סכין גילוח כדי למנוע זיהום ולחתוך 10 מ מ של הקרקפת כך bregma ואת למדא גלויים. לנהל 0.1 מ"ל של לידוקאין 1% באמצעות פיפטה. לקבוע את הזווית של הראש על-ידי התאמת המיקום האנכי של פיו על הכלי stereotaxic כך bregma ואת למדא באותה הרמה-z.</li>
		<li>להתאים את המיקום של manipulator על-ידי הזזה על הכלי stereotaxic כך קצה המזרק הוא קרוב bregma ולהקליט את המיקום של manipulator. . משכי את המזרק על-ידי הזזת כלי המחזיק על manipulator</li>
		<li>להזיז manipulator 5.4 מ"מ posteriorly ו- 0.4 מ מ רוחבית. לקדם את המזרק כך הטיפ הוא קרוב נקודת הכניסה על הגולגולת. . משכי את המזרק ולסמן את נקודת הכניסה.</li>
		<li>במיקום המסומן, לקדוח חור בקוטר של-1 מ מ.</li>
		<li>הכנס קצה המזרק דרך החור כך העומק טיפ הוא 6.9 מ מ יותר מאשר זה נמדד ב- bregma.</li>
		<li>מזריקים µL 1 של המשדרים באמצעות המשאבה ב 0.2 µL/דקה.</li>
		<li>הסר את המזרק המוח.</li>
		<li>במידת הצורך, לכסות את המוח החשוף עם רסיסי microfibrillar עוצר דימום, דבק מיידית.</li>
		<li>לשטוף את המוח החשוף באמצעות תמיסת מלח הנכללת פיפטה כדי למנוע זיהום, תפר את הקרקפת.</li>
		<li>הסר את העכבר הכלי stereotaxic. לאפשר את העכבר כדי להתאושש מן ההרדמה באינקובטור ב 30 הלעפה תרוטרפמט, בדרך כלל עבור 1 h. אין להשאיר את העכבר ללא השגחה עד זה שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות. להחזיר את העכבר מחברתם של חיות אחרות אחרי זה הוא החלים לחלוטין.</li>
		<li>לשמור על העכבר 3 – 7 ימים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לעשות זריקות לתוך רקתי עליון של עכברים בוגרים.
	<ol>
<li>הכן על פיפטה מזכוכית בקוטר עצה של 30 עד 50 מיקרומטר.</li>
		<li>להתחבר על פיפטה מזכוכית מזרק המילטון דרך צינור פלסטיק (איור 2 א).</li>
		<li>למלא את פיפטה מזכוכית, צינור פלסטיק, המילטון מזרק עם הנוזל פרפין.</li>
		<li>במקום משאבת מזרק על המזרק.</li>
		<li>למקם את פיפטה מזכוכית manipulator ותטה manipulator 60° posteriorly מן הציר האנכי (איור 2B).</li>
		<li>לבצע 2.1.4–2.1.9. המיקום של manipulator הוא 1.4 מ מ אחורי, צדדי 0.5 מ מ ל למדא.</li>
		<li>במקום סרט פרפין פלסטיק קטן על הגולגולת ולאחר מכן לשים כ 1 µL של הפתרון מעקב על זה. במהירות לקדם את פיפטה מזכוכית ולמלא אותו לפחות 0.5 µL של הפתרון מעקב.</li>
		<li>הכנס את פיפטה מזכוכית כך העומק עצה היא 3.0 מ מ פני המוח.</li>
		<li>מזריקים µL 0.5 של המשדרים באמצעות המשאבה ב 0.2 µL/דקה.</li>
		<li>הסר את פיפטה מזכוכית של המוח.</li>
		<li>לבצע 2.1.13–2.1.16.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. קיבוע וגיזום
<ol><li>להזריק סודיום פנטוברביטל (60 מ"ג/ק"ג משקל גוף) intraperitoneally לתוך עכבר (C57BL/6J או Tlx3-cre/Ai9, עם או בלי הזריקה מעקב כפי שמתואר בשלב 2. המתן עד העכבר הופך ללא תגובה כאשר זנבו הוא צבט עם מלקחיים, המציין כי העכבר הוא מורדם לחלוטין.</li>
	<li>המתת חסד העכבר בצורה אנושית על ידי פרפוזיה transcardially העכבר20 עם סליין 0.9%.</li>
	<li>לתקן את העכבר20 על-ידי פרפוזיה 4% paraformaldehyde (PFA) במאגר פוספט 0.1 M (pH 7.5).</li>
	<li>
חותכים את הקרקפת בעזרת זוג מספריים כדי לחשוף את הגולגולת כפי שמתואר20.
	<ol>
<li>חותכים האמצע של הגולגולת החשופים בעזרת זוג מספריים. הסר את הגולגולת באמצעות מלקחיים.</li>
		<li>אם מסמנים את המיקום של bregma ולמבדה הינם הכרחיים, להסיר תחילה והזיז חצי אחד של הגולגולת. להכניס מחטים טונגסטן דק לתוך המוח-העמדות של bregma, למדה על הגולגולת שנותרו על המוח, ולאחר מכן הסר את הגולגולת הנותרים. הערה: המוח יכול להיות מאוחסן PBS ב 4 הלעפה תרוטרפמט.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
כדי לבצע נוגדן מכתים של נוירונים מעכבות, לחתוך את דגימות המוח לפרוסות.
	<ol>
<li>מניחים את הדגימה המוח על vibratome.</li>
		<li>חותכים פרוסות עד עבה ב- PBS בטמפרטורת החדר 500 מיקרומטר, המשך לצעד שלב 5 (שיטת e AbScal).</li>
	</ol>
</li>
	<li>אם הנוגדן מכתים מיותרים, קישוט לדוגמה המוח כדי חוסמת (עד 3 מ מ עובי) בעזרת סכין גילוח (איור 3), לשלב 4 (שיטת SeeDB). הערה: המוח יכול להיות מאוחסן PBS ב 4 ° C לאחר חיתוך או חיתוך. שיטת SeeDB עדיפה כאשר נוגדן מכתים אינה נחוצה מכיוון שהיא דורשת פחות זמן מאשר שיטת elAbSca.</li>
</ol>4. ניקוי ללא נוגדנים מכתים (שיטת SeeDB)
<ol><li>להעביר את הדגימה בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 50 מל המכיל 20 מ של 0.5% α-thioglycerol ו- 20% (w/v) פרוקטוז, דגירה זה במשך 4 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להעביר את הדגימה בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 50 מל המכיל 20 מ של 0.5% α-thioglycerol ו- 40% (w/v) פרוקטוז, דגירה זה במשך 4 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להעביר את הדגימה בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 50 מל המכיל 20 מ של 0.5% α-thioglycerol ו- 60% (w/v) פרוקטוז, דגירה זה במשך 4 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להעביר את הדגימה בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 50 מל המכיל 20 מ של 0.5% α-thioglycerol ו- 80% (w/v) פרוקטוז, תקופת דגירה זה של 12 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להעביר את הדגימה בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 50 מל המכיל 20 מ של 0.5% α-thioglycerol ו- 100% (w/v) פרוקטוז, תקופת דגירה זה של 12 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להעביר את הדגימה בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 50 מל המכיל 20 מ של 0.5% α-thioglycerol ו- 80.2% פרוקטוז (w/w), תקופת דגירה זה של 24 שעות ייבוש עדין בטמפרטורת החדר. הערה: לטפל המדגם בקפידה כדי לשמור על העיוותים קטן ככל האפשר. לא דגירה דגימות יותר הצביעו, כמו דגימות במהירות יכול להיות אטום.</li>
	<li>להטביע את הדגימה תא ההדמיה מלא עם הפתרון פרוקטוז 80.2% (איור 1B). במידת הצורך, לתקן את הדגימה על ידי לשים חתיכות קטנות של דבק גומי מסביב. אם החדר הוא עמוק מדי, לשים צלחת קומה בבית הבליעה לפני הצבת את הדגימות.</li>
	<li>מניחים על צלחת פטרי עם כיסוי זכוכית על תא הדמיה ולשים מים המנה, ואת התמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או שני הפוטונים עם זמן עובד מרחק אובייקטיבי טבילה במים. עירור אורכי גל ומסננים פליטה מתוארים בטבלה 1. אם יש צורך, להשתמש במה ממונע.</li>
</ol>5. ניקוי עם נוגדן מכתים (שיטת e AbScal)
<ol><li>להכין ריאגנטים כפי שמתואר בטבלה 2.</li>
	<li>להעביר את פרוסות בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 5 מ"ל המכיל 4 מ"ל של פתרון סרוק/eS0 ואת תקופת דגירה אותם של 12 שעות עם טלטול עדין ב 37 מעלות צלזיוס (איור 4B).</li>
	<li>להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל של פתרון סרוק/eA2 ואני דגירה הפרוסות עבור h 36 ברעידות עדין ב 37 º C.</li>
	<li>להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל של פתרון סרוק/eB4 ואני דגירה הפרוסות במשך 24 שעות ייבוש עדין ב 37 º C.</li>
	<li>להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל של פתרון סרוק/eA2 ואני דגירה הפרוסות במשך 12 שעות ייבוש עדין ב 37 º C.</li>
	<li>להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל ל- PBS, דגירה הפרוסות במשך 6 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הסר בזהירות את הפרוסות כדי צינור פלסטיק 2 מ"ל בעזרת מרית.</li>
	<li>דגירה עם ראשי נוגדנים (טבלה 3) ב 1 מ"ל של AbScale פתרון עבור 48-72 h ב 37 מעלות צלזיוס (איור 4C) ברעידות עדין.</li>
	<li>הסר בזהירות את הפרוסות כדי צינור פלסטיק מ ל בעזרת מרית.</li>
	<li>דגירה ב 4 מיליליטר AbScale פתרון 2 h 2 פעמים בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין.</li>
	<li>הסר בזהירות את הפרוסות כדי צינור פלסטיק 2 מ"ל בעזרת מרית.</li>
	<li>דגירה עם שכותרתו fluorescently משני נוגדנים (טבלה של חומרים, בטחונות) ב 1 מ"ל של AbScale פתרון עבור h 48-37 ° C עם טלטול עדין.</li>
	<li>בזהירות להסיר את פרוסות בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 5 מ"ל המכיל 4 מ"ל של הפתרון elAbSca, דגירה הפרוסות במשך 6 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל של הפתרון elAbSca, דגירה את הפרוסות לקבלת 2 h 2 פעמים עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להסיר את הפתרון מהצינור באמצעות פיפטה ולהוסיף 4 מ"ל של 4% PFA דגירה הפרוסות עבור h 1 ברעידות עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל ל- PBS, דגירה הפרוסות עבור h 1 ברעידות עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל של הפתרון סרוק/eS4, דגירה הפרוסות במשך 12 שעות ייבוש עדין ב 37 º C.</li>
	<li>מקם את מרווח על משטח זכוכית מניחים את הפרוסות מרווח, לטבול את הפרוסות עם פתרון סרוק/eS4. חותם את מרווח עם כיסוי זכוכית (איור 1D).</li>
	<li>שים מים על חיפוי זכוכית ועל התמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או שני הפוטונים עם זמן עובד מרחק אובייקטיבי טבילה במים. אם יש צורך, להשתמש במה ממונע. הערה: לבדוק החלקים עמוק של המדגם מסומנות באופן דומה לחלקים שטחית לאשר בהיעדר דעה קדומה תיוג משמעותית. הערה: חדירה של הנוגדנים שנבדקו מתוארת בטבלה3.</li>
</ol>6. תא בנחישות עמדה
<ol><li>לכל תפקיד של תמונות סרוקות, לחשב את ערכי המתאם באמצעות מסנן תלת ממדי התמונה14 (איור 5A-5D).</li>
	<li>לקבוע את העמדות של הפסגות של הערך קורלציה (איור 5D).</li>
	<li>לחקור תמונות סביב הפסגות כדי לאתר תאים (איור 5E).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain.">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).</li><li>Defelipe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+classification+and+nomenclature+of+cortical+GABAergic+interneurons.">New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex.">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), aac9462 (2015).</li><li>Sorensen, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+gene+expression+and+target+specificity+demonstrate+excitatory+projection+neuron+diversity.">Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity.</a> Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347, 1138-1142 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+Challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li><li>Horton, J. C., Adams, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cortical+column:+a+structure+without+a+function.">The cortical column: a structure without a function.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).</li><li>Costa, N. M., Martin, K. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whose+cortical+column+would+that+be?.">Whose cortical column would that be?.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 4, (2010).</li><li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex.">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).</li><li>Hioki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+inhibitory+inputs+to+dendritic+and+somatic+compartments+of+parvalbumin-expressing+neocortical+interneuron.">Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron.</a> Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).</li><li>Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+organization+of+a+major+subtype+of+pyramidal+neurons+in+neocortical+layer+V.">Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V.</a> Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).</li><li>Kwan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-dependent+posttranscriptional+regulation+of+NOS1+by+FMRP+in+the+developing+cerebral+cortex.">Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex.</a> Cell. 149 (4), 899-911 (2012).</li><li>Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+system+of+functionally+distinct+cell+types+in+the+neocortex.">Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex.</a> Science. 358 (6363), 610-615 (2017).</li><li>Treweek, J. B., Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+structural+and+functional+features+of+widely+distributed+biological+circuits+with+single+cell+resolution+via+tissue+clearing+and+delivery+vectors.">Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors.</a> Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Principles+in+Tissue+Clearing+and+Staining+Protocols+for+Whole-Body+Cell+Profiling.">Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).</li><li>Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GENSAT+BAC+cre-recombinase+driver+lines+to+study+the+functional+organization+of+cerebral+cortical+and+basal+ganglia+circuits.">GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits.</a> Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Kim, S. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+electrotransport+selectively+enhances+the+transport+of+highly+electromobile+molecules.">Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+scalable+proteomic+imaging+for+high-dimensional+profiling+of+intact+systems.">Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li><li>Ke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+mapping+of+neuronal+circuitry+with+an+index-optimized+clearing+agent.">Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent.</a> Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).</li><li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACT-PRESTO:+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+(3D)+imaging.">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Scientific Reports. 6, 18631 (2016).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes.">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution.">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li><li>Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex,+quantitative+cellular+analysis+in+large+tissue+volumes+with+clearing-enhanced+3D+microscopy+(Ce3D).">Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).</li><li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+(SDS)-based+tissue+clearing+(FASTClear):+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+three-dimensional+visualization+of+human+brain+tissues.">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

הוצגו הליכים כדי לקבל תמונות תלת-ממדיות בקנה מידה גדול של הארגון ייחודיים לסוג התא הסוגים העיקריים התא בשכבה neocortical העכבר, 5. לעומת ההכתמה פרוסה קונבנציונאלי, השיטה זו יותר שימושי לקביעת הארגון תלת מימדי של קליפת. השיטה מאפשרת ייבוא תמונות מ רחבה יותר, האזורים במוח עמוק יותר בהשוואה טיפוסי ...

קליפת בתרבית של מורכב של מספר רב של סוגי תאים, אחד עם דפוסי ביטוי גנים ספציפיים, אלקטרופיזיולוגיות ומאפייני הביוכימי, קשרים סינפטיים, ופונקציות ויוו 1,2 ,3,4,5,6,7. בין אם אלה סוגי תאים מאורגנים מבנים חוזרים ונשנים כבר לא ברור. קורטיקלית, כולל העמודות האוריינות החזותית וחביות המגע, יש לחזור על מבנים, אך הארגון הסלולר שלהם נשאר לא ברור8,9. אלה נמצאים אזורים קורטיקליים מסוימים והם אינם המערכת כולו במוח.
בשכבה neocortical 5, רובם המכריע של נוירונים מסווגים לארבעה סוגים עיקריים. סוג העיקריים של נוירונים סינאפסות, הקרנה מוחי תת הנוירונים, פרויקטים אקסונים אל המטרות subcortical לרבות פונס, חוט השדרה, רקתי עליון ומייצג, לכן, מסלול פלט קורטיקלית הגדולות10. הקרנה קורטיקלית הנוירונים, סוג מרכזי נוסף של הנוירונים סינאפסות, innervate קליפת10. נוירונים מעכבות גם להכיל שני מעמדות עיקריים: תאים parvalbumin-להביע ולבטא סומטוסטטין11.
ניתוחים אחרונים מציינים סוגי תאים ארבע מאורגנות מבנים חוזרים ונשנים12,13,14. הקרנה מוחי תת נוירונים12,13,14 והן נוירונים בקליפת המוח הקרנה14 לארגן סוג התא microcolumns ספציפיים בקוטר של 1-2 תאים. תאים Parvalbumin-להביע ולבטא סומטוסטטין ישר במיוחד microcolumns של נוירונים הקרנה מוחי תת אבל לא עם microcolumns של נוירונים בקליפת המוח הקרנה14. Microcolumns את עצמם מעת לעת יתיישר טופס משושה סריג מערך14 , קיימים אזורים קורטיקליים מרובים כולל אזורים חזותי, המגע, מנוע12,מוח העכבר14 בשפה אזורי המוח האנושי13. נוירונים ב- microcolumn בודדים התערוכה פעילות מסונכרנת ויש תגובות החישה דומה14. מקרים אלה מצביעים על סוגי תאים בשכבה 5 לארגן לתוך מבנה סריג microcolumn המייצג הארגון ברחבי המוח הידוע הראשון של חוזרות מודולים פונקציונליים.
Microcolumns יש רדיוס של 10 מיקרומטר ויש על תקופתיות המרחבי כ-40 מיקרומטר. בנוסף, כיוון microcolumns הוא מקביל שלהם דנדריטים הפסגה, משתנה בהתאם למיקום שלהם ב- קליפת14. לכן, מערכת microcolumn קשה לנתח באמצעות פרוסות קורטיקלית קונבנציונאלי עם עובי טיפוסי של כמה עשרות מיקרומטר. בנוסף, הניתוח של תקופתיות דורשת נתונים תלת-ממדיים של מגוון רחב של אזורים במוח, ולכן אזור ההדמיה טיפוסי של מיקרוסקופיה קונפוקלית או ויוו הדמיה 2-פוטון הוא צר מדי.
לאחרונה פותחו טכניקות כדי לנקות רקמות בעובי15,16. כאן נתאר היישום של שיטות אלה כדי להשיג בקנה מידה גדול, תלת מימדי תמונות הסוגים העיקריים התא בשכבה neocortical העכבר 5 המרכיבים את המערכת microcolumn. הקרנת subcerebral נוירונים מסומנים על-ידי תיוג רטרוגרדית או הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת ב- Crym-egfp העכברים הטרנסגניים12, והקרנה קורטיקלית נוירונים מסומנים על-ידי גם הכוכבים תיוג או על-ידי הביטוי tdTomato ב Tlx3-cre-/Ai9-עכברים-17. תאים Parvalbumin-להביע ולבטא סומטוסטטין מסומנות על ידי אימונוהיסטוכימיה. שיטה (נוגדן בקנה מידה S) AbScale18 משמש הנוגדן מכתים ניסויים, ואילו בשיטה SeeDB (ראה מוחי עמוק)19 משמש לניסויים אחרים. שיטות אלה להתגבר על הקשיים הנ של שיטות הדמיה קונבנציונאלי ולחשוף הארגון הסלולר מדויק של שכבה 514.

<table><tbody><tr><td>Crym-egfp transgenic mice</td><td>MMRRC</td><td>012003-UCD</td><td></td></tr><tr><td>Tlx3-cre transgenic mice</td><td>MMRRC</td><td>36547-UCD</td><td></td></tr><tr><td>ROSA-CAG-flox-tdTomato mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>JAX #7909</td><td></td></tr><tr><td>Silicone rubber sheet</td><td>AS ONE</td><td>6-611-01</td><td>0.5 mm thickness</td></tr><tr><td>Silicone rubber sheet</td><td>AS ONE</td><td>6-611-02</td><td>1.0 mm thickness</td></tr><tr><td>Silicone rubber sheet</td><td>AS ONE</td><td>6-611-05</td><td>3.0 mm thickness</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>Matsunami</td><td>C022241</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>C22841</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>C22843</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>C22842</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>C34778</td><td></td></tr><tr><td>26 G Hamilton syringe</td><td>Hamilton</td><td>701N</td><td></td></tr><tr><td>Injector pump</td><td>KD Scientific</td><td>KDS 310</td><td>Pons injection</td></tr><tr><td>Injector pump</td><td>KD Scientific</td><td>KDS 100</td><td>Superior colliculus injection</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pentobarbital</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td>Somnopentyl</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>AstraZeneca</td><td>Xylocaine injection 1% with epinephrine</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Toyo Associates</td><td>HP-200</td><td></td></tr><tr><td>Avitene microfibrillar hemostat</td><td>Davol Inc</td><td>1010090</td><td></td></tr><tr><td>Alonalfa</td><td>Daiichi-Sankyo</td><td>Alonalpha A</td><td></td></tr><tr><td>Surgical silk</td><td>Ethicon</td><td>K881H</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>UVP</td><td>HB-1000 Hybridizer</td><td></td></tr><tr><td>Glass pipette</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>2-000-075</td><td></td></tr><tr><td>Electrode puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin Liquid, light</td><td>Nacalai tesque</td><td>26132-35</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Otsuka</td><td>1326</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Nacalai tesque</td><td>26126-54</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten needle</td><td>Inter medical</td><td>&amp;Phi;0.1 *L200 mm</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>50 mL plastic tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-thioglycerol</td><td>Nacalai tesque</td><td>33709-62</td><td></td></tr><tr><td>D(-) Fructose</td><td>Nacalai tesque</td><td>16315-55</td><td></td></tr><tr><td>BluTack</td><td>Bostik</td><td>CKBT-450000</td><td></td></tr><tr><td>Two-photon microscope</td><td>Nikon</td><td>A1RMP</td><td></td></tr><tr><td>Water-immersion long working distance objectives</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm</td><td></td></tr><tr><td>Water-immersion long working distance objectives</td><td>Nikon</td><td>CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm</td><td></td></tr><tr><td>Motorized stage</td><td>COMS</td><td>PT100C-50XY</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-492/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Semrock</td><td>FF03-575/25-25</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-629/56</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Chroma</td><td>D605/55m</td><td></td></tr><tr><td>5 mL plastic tube</td><td>AS ONE</td><td>VIO-5B</td><td></td></tr><tr><td>2 mL plastic tube</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Nacalai tesque</td><td>35905-35</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>Glyserol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>191612</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-sorbitol</td><td>Wako</td><td>191-14735</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-&amp;beta;-cyclodextrin</td><td>Tokyo chemical industry</td><td>M1356</td><td></td></tr><tr><td>&amp;gamma;-Cyclodextrin</td><td>Wako</td><td>037-10643</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl-L-hydroxyproline</td><td>Skin Essential Actives</td><td>33996-33-7</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Nacalai tesque</td><td>13445-45</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 (1.1 g/mL)</td><td>Nacalai tesque</td><td>35624-15</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21428</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Water-immersion long working distance objectives</td><td>Olympus</td><td>XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>ABN78</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CTIP2</td><td>Abcam</td><td>ab18465</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Statb2</td><td>Abcam</td><td>ab51502</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAD67</td><td>Millipore</td><td>MAB5406</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GABA</td><td>Sigma</td><td>A2052</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Swant</td><td>235</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Frontier Institute</td><td>PV-Go-Af460</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Sigma</td><td>P3088</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Abcam</td><td>ab11427</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Somatostatin</td><td>Peninsula Laboratories</td><td>T-4103</td><td></td></tr><tr><td>Anti-c-Fos</td><td>CalbioChem</td><td>PC38</td><td></td></tr></tbody></table>

large-scale three-dimensional imaging of cellular organization in the mouse neocortex

קליפת בתרבית של מורכב של סוגים רבים של נוירונים סינאפסות, כל אחד עם מאפייני אלקטרופיזיולוגיות וביוכימי ספציפיים, קשרים סינפטיים, ופונקציות ויוו , אבל שלהם basic אנטומי פונקציונלי הארגון של הסלולר לקנה המידה רשת ממעטים להבין. כאן נתאר שיטת ההדמיה תלת מימדי של נוירונים שכותרתו fluorescently על פני שטחים נרחבים של המוח לחקירה של הארגון סלולרי קורטיקלית. סוגי נוירונים ספציפיים מסומנים על ידי ההזרקה של פלורסנט המשדרים עצביים רטרוגרדית או ביטוי של חלבונים פלורסנט ב העכברים הטרנסגניים. בלוק המוח דגימות, למשל, האונה, המוכנים על קיבעון, עשה שקוף עם רקמת ניקוי שיטות, נתון פלורסנט immunolabeling של סוגי תאים מסוים. אזורים גדולים נסרקים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או שני הפוטונים מצויד גדול לעבוד מרחק מטרות ושלבים ממונע. בשיטה זו ניתן לפתור הארגון תקופתי של המודולים פונקציונליים ייחודיים לסוג microcolumn תא בתוך קליפת העכבר. ההליך יכול להיות שימושי לצורך המחקר של אדריכלות סלולרית תלת מימדי אזורי מוח שונים וברקמות מורכבים אחרים.

אנו תווית נוירונים בקליפת המוח הקרנה באמצעות הביטוי של tdTomato ב Tlx3-creהעכברים הטרנסגניים /Ai9, דמיינו נוירונים הקרנה מוחי תת ידי הזרקת את רכיב המעקב רטרוגרדית CTB488 לתוך פונס. האונה השמאלית של המוח היה נתון לשיטת SeeDB וייסרק באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים מצויד זמן עוב?...

Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex at JoVE.com

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

הדמיה תלת מימדי בקנה מידה גדול של ארגון הסלולר קליפת העכבר

כאן נתאר תהליך ניקוי רקמות, תיוג פלורסנט של הדמיה בקנה מידה גדול של רקמת מוח העכבר המאפשרת, ובכך, ויזואליזציה של הארגון תלת מימדי של סוגי תאים בתוך קליפת.

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

large-scale-three-dimensional-imaging-cellular-organization-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K Views.  RIKEN Brain Science Institute. כאן נתאר תהליך ניקוי רקמות, תיוג פלורסנט של הדמיה בקנה מידה גדול של רקמת מוח העכבר המאפשרת, ובכך, ויזואליזציה של הארגון תלת מימדי של סוגי תאים בתוך קליפת.

Video: Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

הדמיה כרונית של עכבר-Visual Cortex שימוש ההכנה סחוט הגולגולת

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical neurons with two-photon microscopy has provided unique insights into cortical structure, function and plasticity. However, these studies are limited to head fixed animals, greatly reducing the behavioral complexity available for study. In this paper, we describe a procedure for performing chronic fluorescence microscopy with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely behaving mice. We used an integrated miniaturized fluorescence microscope paired with an implanted prism probe to simultaneously visualize and record the calcium dynamics of hundreds of neurons across multiple layers of the somatosensory cortex as the mouse engaged in a novel object exploration task, over several days. This technique can be adapted to other brain regions in different animal species for other behavioral paradigms.

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Here, we present a procedure for performing large-scale Ca2+ imaging with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely moving mice. Hundreds of active cells can be observed simultaneously using a miniature, head-mounted microscope coupled with an implanted prism probe.

רב שכבתיים Ca קליפת המוח<sup&gt; 2+</sup&gt; הדמיה בחופשיות העברת עכברים עם בדיקות פריזמה מיקרוסקופית פלואורסצנטי מיניאטורי

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

Behavior

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Multiphoton מיקרוסקופי של מוח העכבר הותר הבעת YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

בתחום ההדמיה vivo של שכבות קליפתיים עמוק באמצעות Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

Biology

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

מיקרון בקנה מידת רזולוציה אופטית טומוגרפיה של מוח עכבר השלם עם מיקרוסקופית גיליון Confocal אור

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

שינוי של Colliculo-thalamocortical עכבר המוח פרוסה, שילוב הדפסת 3-D של לשכת רכיבים ודימות אופטי רב בקנה מידה

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their activity in vivo in behaving mice. This paper describes a method for the implantation of a chronic cranial window to allow for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice. In combination with genetic strategies and viral injections, it is possible to label specific cells and regions of interest with structural or physiological markers. This protocol demonstrates how to combine viral injections to label neurons in the vicinity of GCaMP6-expressing astrocytes in the cortex for simultaneous imaging of both cells through a cranial window. Multiphoton imaging of the same cells can be performed for days, weeks, or months in awake, behaving animals. This approach provides researchers with a method for viewing cellular dynamics in real time and can be applied to answer a number of questions in neuroscience.

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Presented here is a protocol for the implantation of a chronic cranial window for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice.

השתלת חלון גולגולת להדמיה חוזרת ונשנית In Vivo בעכברים ערים

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

הדמיה וניתוח של כל המוח החד-תאי של מוחות עכברים שלמים של ילודים באמצעות MRI, ניקוי רקמות ומיקרוסקופיה של יריעות אור

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

עכבר מוח יילודים סריקת מיקרו-CT ועיבוד תמונה

Micro-CT Imaging and Morphometric Analysis of Mouse Neonatal Brains

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard method for soft tissues, although its low spatial resolution poses some limits for small animals. Here, we describe a protocol for obtaining high-resolution three-dimensional (3D) information on mouse neonate brains and skulls using micro-computed tomography (micro-CT). The protocol includes those steps needed to dissect the samples, stain and scan the brain, and obtain morphometric measurements of the whole organ and regions of interest (ROIs). Image analysis includes the segmentation of structures and the digitization of point coordinates. In sum, this work shows that the combination of micro-CT and Lugol's solution as a contrast agent is a suitable alternative for imaging the perinatal brains of small animals. This imaging workflow has applications in developmental biology, biomedicine, and other sciences interested in assessing the effect of diverse genetic and environmental factors on brain development.

מחבר זרקור: הדמיה ברזולוציה גבוהה של מוחות יילודים של עכברים – פרוטוקול מיקרו-CT עם חומר הניגוד לפתרון של לוגול

This study describes the steps for obtaining high-resolution images of neonatal mouse brains by combining micro-computed tomography (micro-CT) and a contrast agent in ex vivo samples. We describe basic morphometric analyses to quantify brain size and shape in these images.

הדמיית מיקרו-CT וניתוח מורפומטרי של מוחות יילודים בעכברים

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard ...