ברצוננו להודות ליעקב סוליס לעזרתו בעריכת וידאו. עבודה זו מומנה בחלק פרס NSF קריירת DBI-0953902 לMJ לוין על ידי.

1. זלוף בעלי החיים 5 וסליקת מוח עכבר שלמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל אורכו של ההליך יכול להשתנות בהתאם לאורכו של זמן בשימוש לצעד התייבשות, אבל בסך הכל כל התהליך יכול להתבצע בשני ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל עכברי YFP ולאחר מכן עמוק להרדים עם זריקת intraperitoneal של קטמין / xylazine (100 מ&quot;ג / ק&quot;ג: 10 מ&quot;ג / ק&quot;ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר מטוס כירורגית של הרדמה עמוקה לפני שיעבור לניתוח. בדקו את בעלי החיים כל 5 דקות כדי לראות אם הוא מגיב לבוהן איתן או קמצוץ זנב. אם בעל החיים מגיבים, מינון משלימה (1/3 ממינון המקורי) של קטמין / xylazine נדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהרדים עמוק, לרסן את העכבר על ידי עמידה בכל איבר למיטת ניתוחים באמצעות קלטת מעבדה, כדי שהעכבר הוא במצב שכיבה (recumbancy הגבה), חושף את חזו לניתוח. המיטה כירורגית עשויה בדרך כלל ממתכת או רשת פלסטיק ומניחה אותה בכיור או על גבי שפות חשוקות מחבת כך שהדם ומקבעפסולת יכולה בקלות להיות שנאספה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל, לעשות חתך מתחת לתהליך xyphoid. חותך לאורך הבסיס של כלוב הצלעות באמצעות מספריים ופינצטה ולמשוך בחזרה עור כמו החתך הוא עשה. בשני חתכים לאורך כל הצד של עצם החזה (העכבר דרך הצלעות) כדי ליצור דש של רקמה המתקיים הרחק מבית החזה באמצעות מלקחיים לעזוב את הלב חשוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט 23 גרם לחדר השמאלי של הלב ולעשות חתך קטן בקיר השריר של העלייה הימנית כדי לאפשר לדם לברוח. אנא עיין במאמר יופיטר 2497 לוידאו של הליך זה. 5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר העלייה הימנית היא לחתוך, להתחיל זלוף עם 4 מעלות צלזיוס נאגר מלוח פוספט, PBS, (pH 7.2) עד שדם כבר לא נצפה ניקוז מהעלייה הימנית של הלב (מ 30 - 40 מ&quot;ל בשיעור של כ 5 מ&quot;ל / דקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל הדם התרוקן (נוזל יציאת העלייה הימנית ברור), לעבור למדיום זלוף 4% מצונניםפתרון PFA. תנקב עד שגופו של העכבר הופך ניכר נוקשה וקר למגע (30 כ - 40 מ&quot;ל בשיעור של כ 5 מ&quot;ל / דקה). (מרוכז 16% פתרון PFA מדולל בהתאם להוראות יצרן והוא הוסיף NaOH עד pH 7.2 הוא הגיע. ילבש כפפות וחלוקה מעבדה ולטפל ולערבב כימיקלים בתוך מנדף.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זלוף, הסר את העכבר מהמיטה כירורגית ולהתחיל לערוף הכריתה של המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים ומספריים איריס, להסיר את הגולגולת בסעיפים קטנים המתחילים מהחלק האחורי של הגולגולת ולנוע קדימה. לבצע חתכים קטנים בכל 2-4 מ&quot;מ עם מספריים על פני הגולגולת תוך כדי שימוש במלקחיים בזהירות למשוך את העצם מהמוח בסעיפים קטנים. האם זה עד המשטח העליון של המוח כולו חשוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבלו על המוח מהגולגולת באמצעות 5 מ&quot;מ רחב, מרית שטוחה ומקום לתוך בקבוקון זכוכית. לצלול ב4% PFA עבור 6 שעות ב 4 ° C לקיבעון הודעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הודעהקיבעון, לשטוף את המוח פעמים בטמפרטורת החדר PBS על ידי שפיכת PFA מתוך בקבוקון הזכוכית והחלפתו בערוץ מדע. מערבולת המוח בפתרון PBS לפני נשפך החוצה ולהחליף עם PBS לכביסה שנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את המוח בטמפרטורת חדר על ידי סדרה מדורגת של incubations אתנול (פעם אחת ב 50%, 70%, 95%, ופעמים ב100%) בשעת 2 ​​שעות לדגירה, ואז 12 שעות לדגירת 100% אתנול השנייה, כדי לחלץ את המים מרקמות הקבועות. עבור כל דגירה, לשפוך את הפתרון הקודם אתנול מבקבוקון הזכוכית ולהחליפו בפתרון הבא, עד שהמוח הוא שקוע לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה השנייה באתנול 100%, לשפוך את הפתרון ולהחליף בחלקים שווים אתנול ופתרון הסליקה המכיל בנזיל אלכוהול ונזיל בנזואט (1:2 כרך: יחס נפח). לאחר 2 שעות של דגירה, מזוג פתרון זה ולהחליף בפתרון של 100% בנזיל אלכוהול ונזיל בנזואט (1:2 כרך: יחס נפח). Refraראשי ctive מפתרון הסליקה הוא n = 1.54. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע באב, המוח יהפוך ניכר שקוף, בתוך 4-5 שעות. לקבלת תוצאות הטובות ביותר סליקה, השאר את המוח כדי לנקות במשך 6 ימים בטמפרטורת חדר ואילו מוגן מפני אור בהיר. </li></ol> 2. התקנת מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמוח מנוקה ומוכן להדמיה, להצמיד אותו לתחתית של צלחת פטרי באמצעות cyanoacrylate. אפשר הדבק להתייבש לפני שימשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הייבוש, להטביע את המוח באב ומניח צלחת תחת מיקרוסקופ למטרת הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים במיקרוסקופ multiphoton שמשלב ליזר מאי טאי טיטניום ספיר מתכווננת בין 710 ננומטר ל אורך גל עירור ננומטר 990. גל העירור אנו משתמשים כדי לייצר אותות YFP הוא 886 ננומטר. ליזר הכח משתנה 30-100 mW, תלוי בעומק הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את אות הניאון משתקף באמצעות אובייקטיבי 5X ניקון (NA, 0.5) המאפשרת לגדוליםתחום של נוף הדמיה (2 2 מ&quot;מ x). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן אות הניאון משתקף באמצעות מסנן bandpass 535/50 ולאסוף אותו באמצעות GaAsP PMT (H7422PA-40, Hamamatsu, Bridgewater, ניו ג&#39;רזי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות תהליך באמצעות תוכנת ScanImage 6 ברזולוציה של 2048 x 2048 פיקסלים תוך שימוש בשיעור סריקה של כל השורה 2 ms להפיק רזולוציה גבוהה, תמונות YFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההדמיה יושלם, להסיר את המוח מצלחת פטרי באמצעות מלקחיים ולאחסן באב מוגן מפני אור להדמית עתיד. לקבלת דוגמיות מודבקת, להסיר את הרקמה על ידי הפעלת סכין גילוח בין הדבק וצלחת פטרי בזווית שאינה עולה על 30 מעלות. יש לנו לאחסן דגימות באב לתקופה של עד שנת 1 עם שפל לא נראה לעין. </li></ol> 3. נציג תוצאות את התמונות וסרטוני וידאו המוצגים כאן הנציג להפגין היכולת הגבוהה ברזולוצית multiphoton ההדמיה התאפשרה סליקה אופטית. ההדמיה של מוח כולו מאפשרתלYFP שכותרתו נוירונים בשכבות השונות של קליפת המוח וההיפוקמפוס להיות נראים בבירור עמוק כמו 2 מ&quot;מ מתחת לפני שטח הרקמות. איור 1 מציג תמונת נציג של תצוגת עטרה מקבילה לתכונות אנטומיות של ההיפוקמפוס ב2.92 מ&quot;מ זנב עד 7 גבחת. העומק של הדמיה במדגם היה 1.94 מ&quot;מ. החלק מהבדל זה נובע מהסרה של מוח הקטן בסוף הזנב של המוח ואת היתרה הייתה בשל הצטמקות מתהליך ההתייבשות. תמונה אחרת מתוך הערימה מראה עצב פירמידליים השכבה V / שישי של הניאוקורטקס לבטא 2 מ&quot;מ YFP מתחת לפני שטח הרקמה (איור 2). כל התמונות נרכשו באמצעות אובייקטיבי וגדלת 5X ניקון נעשה שימוש בתכונת הזום הדיגיטלית לרכישת תמונה בתוכנת ScanImage. על ידי התקרבות על הניאוקורטקס, אקסונים הבודדים וגופי תא של הנוירונים פירמידליים נוירון בשכבת V של הניאוקורטקס ברוריםly להבחין עד 1.02 מ&quot;מ מתחת לפני שטח הרקמה (איור 3). שימוש במחסנית התמונה מהאיור 3, שיקום 3D של אזור נוירון נעשה באמצעות תוכנת ImageJ 8 (איור 4). יכולת הרזולוציה הגבוהה של MPM גם מאפשרת לנו להציג את התמונות של כל הנוירונים, בודדים. כאן אנו מציגים שחזור של נוירון פירמידלי שכבת V של הניאוקורטקס שבתהליכים דנדריטיים בודדים הם נראים בבירור (איור 5). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig1.jpg" /> איור 1 תמונת נציגת מחסנית תמונה 1.2 מ&quot;מ (0.8-2 מ&quot;מ מתחת לפני שטח הרקמה). של מוח עכבר כולו מראה הניאוקורטקס ואת השכבות השונות של ההיפוקמפוס. תכונות של ההיפוקמפוס גלויות 1.1 מ&quot;מ מתחת לפני שטח הרקמה וסומנו בתווית באמצעות המעקבing קוד:. DG = gyrus המשוננת, GrDG = שכבה פרטנית של DG, Lmol = lacunosum moleculare שכבה, מול = שכבה המולקולרית DG, או שכבת מכשירי אוריין =, PoDG = polymorph שכבת DG, PY = שכבת התא פירמידלי, רד = שכבת radiatum 7 תמונה היא 1.8 x 1.8 מ&quot;מ בגודל, בר קנה מידה = 200 מיקרומטר. הסוף המקורי של המוח הוצמד לצלחת פטרי עם סוף הזנב כלפי מעלה לכיוון המטרה. זה הקל הדמיה במטוס העטרה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig2.jpg" /> איור 2 מסגרת נציג ממחסנית תמונת המ&quot;מ 1.2 (0.8-2 מ&quot;מ מתחת לפני שטח הרקמה). של מוח עכבר כל הדגשת הניאוקורטקס. תאים ותהליכים המבטאים את פירמידת YFP בשכבת V / שישית של קליפת המוח הם 2 מ&quot;מ גלוי מתחת לפני שטח הרקמות. התואר של תיוג הוא בקנה אחד עם דיווחים קודמים של התיוג הדליל בניאוקורטקס. 9 הבלעה (מימין) מוגדלים מב<html> אזור oxed על שמאל. תמונה היא 1.8 מ&quot;מ x 1.8 בגודל, סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר (50 מיקרומטר הבלעה). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig3.jpg" /> איור 3. מסגרת נציג נלקחה 774 מיקרומטר מתחת לפני שטח הרקמה ממחסנית התמונה של נוירונים פירמידליים V שכבה ב הניאוקורטקס של המוח. סטאק הולך בין 700 מיקרומטר ל1020 מיקרומטר מתחת לפני שטח הרקמות. זום דיגיטלי 8X היה משמש ללכידת פרטים כגון תהליכים עדינים. תמונה היא 225 225 מיקרומטר x בגודל, סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig4.jpg" /> איור 4. תמונה מייצגת של 3D שיקום (225 x 225 x 320 מיקרומטר) של ערימת התמונה באיור 3. תמונה היא 225 225 מיקרומטר x בגודל, סרגל קנה מידה = 28 מיקרומטר. s &quot;&gt; <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig5.jpg" /> איור 5. תמונה משוחזרת ברזולוציה הגבוהה של נוירון פירמידלי שכבת V של הניאוקורטקס באמצעות זום ​​דיגיטלי 10X. Neuron מודד 485 מיקרומטר באורך, סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. שדה הראיה לכל אריח תמונה הוא 180 x 180 מיקרומטר מיקרומטר. כל אריח הוא בעומק שונה (z ברמה). הדנדריטים apical קליפת המוח לא, באופן כללי, המפורש YFP כמו גם את הסומא. יש גם באותו שדה הראייה, כפי שמוצג כאן, הכח הונמך כדי למזער את הרוויה של סומה, זה הופך את תהליך דימר המראה העדין. הדגש שלנו כאן היה על הוכיח תחום של נוף ולא פרטים קטנים. כדי לחשוף את הפרטים מעודנים יותר, להשתמש זום דיגיטלי, יתמקד באזור ללא סומה, ולהגביר את כוח הליזר.

<ol>
	<li>Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+microscopy+of+cleared+mouse+organs.">Multiphoton microscopy of cleared mouse organs.</a> J. Biomed. Opt. 15, 036017 (2010).</li><li>Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+fluorescence,+second+harmonic+generation,+and+fluorescence+lifetime+imaging+of+whole+cleared+mouse+organs.">Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging of whole cleared mouse organs.</a> J. Biomed. Opt. 16, 106009 (2011).</li><li>Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+insect+and+mammalian+embryo+imaging+with+confocal+microscopy:+Morphology+and+apoptosis.">Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: Morphology and apoptosis.</a> Cytometry. A69, 1143-1152 (2006).</li><li>Sakhalkar, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+in+bulk+tissue+specimens+using+optical+emission+tomography:+Fluorescence+preservation+during+optical+clearing.">Functional imaging in bulk tissue specimens using optical emission tomography: Fluorescence preservation during optical clearing.</a> Phys. Med. Biol. 52, 2035-2054 (2007).</li><li>Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-mouse+Neuroanatomical+Magnetic+Resonance+Imaging.">Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging.</a> J. Vis. Exp. (48), e2497 (2011).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed. Eng. Online. 2, (2003).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).</li><li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP.">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Hama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neuro. 14, 1481-1488 (2011).</li></ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי הטיפוח של אוניברסיטת ייל המוסדית בעלי החיים ושימוש בועדה.

אמנם צבעים אורגניים תקניים תואמים למגוון רחב של ממסים אורגניים, ולכן לא מהווים אתגר מיוחד לניקוי פרוטוקולים, חלבוני ניאון הם בדרך כלל פחות סובלניים לשינויים בממס. 4 המטרה של העבודה הנוכחית היה להתגבר על מגבלה רצינית של פרוטוקולים קודמים אופטיים סליקה שבו קרינה...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> נאגר מלוח פוספט </td><td> סיגמה אולדריץ, Inc </td><td> D8537 </td><td> 500 מ&quot;ל, pH 7.2 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td> 15710 </td><td> 10 x 10 מ&quot;ל, 16% paraformaldehyde </td></tr><tr><td> אתיל אלכוהול </td><td> אמריקאי Bioanalytical </td><td> AB00515-00500 </td><td> 500 מ&quot;ל, 200 הוכחה </td></tr><tr><td> אתיל אלכוהול </td><td> Pharmco מוצרים, Inc </td><td> 111000190 </td><td> גל 1., 190 הוכחה </td></tr><tr><td> בנזיל אלכוהול </td><td> סיגמה אולדריץ, Inc </td><td> 402834 </td><td> 500 מ&quot;ל, 99 +% </td></tr><tr><td> בנזיל בנזואט </td><td> סיגמה אולדריץ, Inc </td><td> B6630-IL </td><td> 500 מ&quot;ל, ≥ 99% </td></tr><tr><td> 5X/0.5 אובייקטיבי NA </td><td> ניקון </td><td> קמח תכנית AZ 5X </td><td> 15 WD </td></tr></tbody></table>

multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing yfp

מיקרוסקופיה multiphoton של הדור הפנימי פלואורסצנטי וההרמוניה השני (SHG) של איברי עכבר שלמים מתאפשרת על ידי ניקוי האיברים אופטיים לפני ההדמיה. 1,2 עם זאת, עבור איברים המכילים חלבוני ניאון כגון GFP וYFP, פרוטוקולי סליקה אופטיות המשתמשים במתנול התייבשות וברורה שימוש באלכוהול בנזיל: נזיל בנזואט (באב) ואילו לא מוגן מאור 3 לא לשמר את אות הניאון. הפרוטוקול המובא כאן הוא דרך חדשה שבה לבצע סליקה אופטית איבר שלמה במוח עכבר תוך שמירה על אות הקרינה של YFP מתבטאת בתאי עצב. שינוי פרוטוקול סליקה האופטי כזה שהאיבר הוא התייבשות באמצעות סדרה מדורגת אתנול כבר נמצא כדי להפחית את הניזק לחלבוני ניאון ולשמר את אות הניאון להדמית multiphoton. 4 שימוש בשיטה אופטימלית של סליקה אופטית עם התייבשות אתנול מבוסס ו סליקה על ידי אבבעוד מוגן מפני אור, אנחנו מראים תמונות multiphoton רזולוציה גבוהה של חלבון ביטוי ניאון צהוב (YFP) בתאי העצב של מוח יותר מ 2 מ&quot;מ עכבר מתחת לפני שטח הרקמות.

Watch this Scientific Journal Video about Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP at JoVE.com

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

מיקרוסקופיה multiphoton של איברים שלמים עכבר ניתן על ידי ניקוי האיברים אופטיים לפני ההדמיה, אך לא כל הפרוטוקולים לשמר את אות הניאון של חלבוני ניאון. באמצעות שיטה אופטית סליקה עם התייבשות אתנול מבוסס ואלכוהול בנזיל: סליקה בנזואט נזיל, אנחנו מראים תמונות multiphoton ברזולוציה גבוהה של כל המוח של עכבר מביע YFP.

Multiphoton מיקרוסקופי של מוח העכבר הותר הבעת YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

multiphoton-microscopy-of-cleared-mouse-brain-expressing-yfp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K Views.  Yale University. מיקרוסקופיה multiphoton של איברים שלמים עכבר ניתן על ידי ניקוי האיברים אופטיים לפני ההדמיה, אך לא כל הפרוטוקולים לשמר את אות הניאון של חלבוני ניאון. באמצעות שיטה אופטית סליקה עם התייבשות אתנול מבוסס ואלכוהול בנזיל: סליקה בנזואט נזיל, אנחנו מראים תמונות multiphoton ברזולוצ...

Video: Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

הכנת רקמות מוח עכבר מיקרוסקופית Immunoelectron

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

מיקרוסקופית Intravital של microcirculation המוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי סגור

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in which the enhanced version of the green fluorescent protein (EGFP) is exclusively expressed in all neurons of the developing central and peripheral nervous system1, allowing the possibility to both film the innervation of the forelimb and to manipulate this process with pharmacological and genetic techniques2. The most critical parameter in the successful cultivation of such slice cultures is the method by which the slices are prepared. After extensive testing of a variety of methods, we have found that a vibratome is the best possible device to slice the embryos such that they routinely result in a culture that demonstrates viability over a period of several days, and most importantly, develops in an age-specific manner. For mid-gestation embryos, this includes the normal outgrowth of spinal nerves from the spinal cord and the dorsal root ganglia to their targets in the periphery and the proper determination of skeletal and muscle tissue. 
In this work, we present a method for processing whole embryos of embryonic day (E) E10 to E12 into 300 - 400 micrometer slices for cultivation in a standard tissue culture incubator, which can be studied for up to two days after slice preparation. Critical for the success of this approach is the use of a vibratome to slice each agarose-embedded embryo. This is followed by the cultivation of the slices upon Millicell culture membrane inserts placed upon a small volume of medium, resulting in an interface culture technique. One litter with an average of 7 embryos routinely produces at least 14 slices (2-3 slices of the forelimb region per embryo), which varies slightly due to the age of the embryos as well as to the thickness of the slices. About 80% of the cultured slices show nerve outgrowth, which can be measured througout the culturing period2. Representative results using the tauGFP mouse line are demonstrated.

We present a method to prepare organotypic slices of mid-gestation mouse embryos for the cultivation and time-lapse imaging of peripheral nerve outgrowth.

פורסים תרבות Organotypic של ה-GFP-לבטא עוברי עכברים עבור הדמיה בזמן אמת תולדה של עצבים היקפיים

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

אלומת יונים ממוקדת כרסום מיקרוסקופיית אלקטרונים של רקמת המוח

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

בידוד LacZ-להביע תאים פנימית עכבר רקמות האוזן באמצעות זרימת cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

מיקרון בקנה מידת רזולוציה אופטית טומוגרפיה של מוח עכבר השלם עם מיקרוסקופית גיליון Confocal אור

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

מערכת חוש הריח כמודל לחקר דפוסי axonal צמיחה ומורפולוגיה<em&gt; In vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

טיהור של כלי מוח עכבר

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...