Name: acellular and cellular lung model to study tumor metastasis
Uploaded: 2018-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis at JoVE.com

מין עמ' קים קיבלה מענק תמיכה השני ג'ון וו קירקלין מחקר המלגה, האגודה האמריקאית החזי ניתוח, גראהם מחקר קרן, יוסטון המתודיסטית המומחיות רופא קבוצת גרנט, ואת מיכאל מ פרס מחקר של חרוט ה ג'ואן. אנו מודים Saikin אן על שפת עריכה של כתב היד.

הפרוטוקולים עבור ניסויים בבעלי חיים היו אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש במכון מחקר המתודיסטי ביוסטון, מתבצעת על פי כל תקנות, חוקים ישימים, קווים מנחים ומדיניות.
1. עכברוש ריאות קציר
<ol><li>עזים ומתנגד חולדה ספראג-Dawley 4 כדי 6-בת הזכר על ידי זריקה (IP) בקרום הבטן של קטאמין (100 מ ג/ק ג), חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/ק"ג) בהאגף שלו. להבטיח הרדמה על-ידי בדיקה היעדרות של התנועה כאשר הבוהן הינד האיבר הוא צבט עם מלקחיים.</li>
	<li>לאחר 10 דקות, מגלח את החזה והבטן, לנגב את העור עם מקלון chlorhexidine.</li>
	<li>מסירים את העור על ידי כשהרמתי אותו עם מלקחיים ועל ידי אם זה באזמל חד פעמיות. לאחר פתיחת בחלל בית-החזה על ידי אם עם האזמל, לבצע ניקור הדו-צדדיים על ידי חיתוך בצד הקדמי של כלוב הצלעות בצד השמאל וצד ימין של הסרעפת עם מספריים. הערה: זה ניתוח ההישרדות.</li>
	<li>. חכו הצלעות, להזריק 2 מ של הפארין (1,000 יחידות/mL) לתוך החדר הימני של הלב הפועם באמצעות מחט 27 גרם. הערה: פעולה זו תמנע כל היווצרות של קרישי דם בריאה.</li>
	<li>לחלוטין להסיר את כלוב הצלעות עם מספריים ובאותו מקום מחט 18 גרם של החדר השמאלי אוורור, עד הדם יוצא. לאחר מכן, להזריק 15 מ"ל תמיסת heparinized באגירה פוספט (יחידות/מ"ל; heparinized PBS) לתוך החדר הימני באמצעות מחט 25 גרם.</li>
	<li>לחתוך את נחות והסופריור הווריד הנבוב, שני ורידים גדולים מצד ימין של הלב, ו ריקון הריאות עם אוטם 10 נוספים ל- PBS heparinized בתוך החדר הימני באמצעות מחט 27 גרם. הערה: הכלילי התחתון הוא מדמיין תחת התחתון של הלב ככלי קיבול גדול מלא דם אדום. באופן דומה, הווריד הנבוב העליון הוא מדמיין בחלק העליון של הלב ככלי קיבול גדול.</li>
	<li>לחתוך את קנה הנשימה בבסיס של בלוטת התריס. הסר בזהירות את העורקים ברמה של וריד hemiazygos, סניפים של אבי העורקים בשער הניצחון.</li>
	<li>. תוציא החוצה מהבניין לב-ריאה בחלל בית-החזה ואת שאר הגוף עכברוש</li>
	<li>לבצע ventriculotomy על ידי חיתוך חצי ימינה ושמאלה החדרים ולמקם בהזמנה אישית שמולאו מראש 18 גרם מפלדת המחט בצינורית דרך החדר הימני לתוך עורק הריאה הראשי (PA).</li>
	<li>לאבטח את הצינורית עם עניבה משי 2-0, בזהירות לחשוף את החדר הימני אטריום.</li>
	<li>מקום המחיצה סכינים סטריליים הנשי של החדר השמאלי ואבטח אותו עם עניבה משי 2-0.</li>
	<li>ריקון בלוק לב-ריאה עם 20 mL heparinized PBS דרך הצינורית הרשות הפלסטינית ולמקם אותו בצינור 50 מ ל תרבות המדיה או heparinized PBS הכוללת. הערה: עבור מודל הסלולר, עבור לשלב 3.1 כדי להגדיר את ביוריאקטור. עבור מודל acellular, המשך לשלב 2.1 עבור decellularization.</li>
</ol>2. ריאות Decellularization
<ol><li>
הכנה של היחידה decellularization
	<ol>
<li>להכין את כל decellularization קאמרית/בקבוק על ידי פירסינג שני חורים הפקק של סכינים סטריליים הנשי החורים (איור 1A ו 1B). לאבטח אותו עם טבעת ניילון שחורה בצד השני. באופן דומה, לקדוח חור אחד פקק בקבוק נוסף של הקובץ המצורף קבע תוך ורידי (איור 1C). הערה: איור 1A ו- 1B הם באותו פקקי בקבוקים משני צדדים שונים. איור 1C הוא כובע שונים עם חור אחד כאמור לעיל בשלב 2.1.1.</li>
		<li>לצרף צינור 0.5 אינץ (ב עורק הריאה או הרשות הסיום) וצינורות 6 אינץ (איור 1J) סכינים סטריליים נקבה מן בתוך פקקי בקבוקים (איור 1A ו 1B) ולצרף מנעול סכינים סטריליים זכר בקצוות. הגדר את המנעול עם בקבוק 500 מ"ל הקאמרית/הבקבוק decellularization.</li>
		<li>חבר קצה אחד של שני צינורות רגל 2 (אשר מחוברים עם מנעול סכינים סטריליים זכר) או בסוף הצינור משאבה (איור 1 H), אשר מוצמד לראש המשאבה (איור 1E ו 1F) על-ידי מחסנית (איור 1 ג'י) עם סכינים סטריליים נקבה מנעול (איור 1I).</li>
		<li>לחבר את הקצוות האחרים של רגל 2 הצינורות (מתוך שלב 2.1.3) כל ראש נעל זכוכית הנשי על המכסה קאמרית/בקבוק decellularization (איור 1 L).</li>
		<li>הגדר 250 מ ל heparinized PBS בקבוק (עם 200 מ של PBS) על-ידי תליית בקבוק הפוך על דוכן עם תום הפרוקסימלית של ערכה תוך ורידי (איור 1D) יש להוסיף את הפקק, ואת הקצה הדיסטלי החלפת הצינור רגל 2 מחובר decellularization c הפרובינציאלי האמבר/הבקבוק בקצה הרשות הפלסטינית (איור 1B). להתחבר הצינורית הזאת במרחק של הבקבוק להשליך. הערה: הבקבוקים שוכנים בינות קרטון, כפי שמוצג באיור 1 K. הצינורות תוך ורידי לצאת הבקבוקים תלוי לוותר ריאגנטים ב לגרדום ריאות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תהליך decellularization ריאות
	<ol>
<li>להפעיל את PBS heparinized, בלחץ זלוף הפיזיולוגיות של 30 מ מ כספית (איור 1 K) עד זורם בחופשיות בבקבוק decellularization הקאמרית/וצרף, ואז, הרחוב לב-ריאה עד הסוף הרשות הפלסטינית דרך הצינורית הרשות הפלסטינית.</li>
		<li>תמשיך לרוץ המשאבה ללא הרף, כך כל פתרון/מאגר עודף שבתוך decellularization הקאמרית/הבקבוק מקבל שנמחקו.</li>
		<li>הפעל את PBS heparinized דרך הרשות למשך 15 דקות, בלחץ זלוף של 30 מ מ כספית בשביל הכביסה הראשונית (איור 1 K).</li>
		<li>החלף את הבקבוק PBS heparinized 0.1% dodecyl סולפט נתרן (מרחביות) במים יונים, perfuse הריאה עבור 2 h עבור decellularization.</li>
		<li>לאחר decellularization, perfuse יונים בלוק מים דרך לגרדום ריאות למשך 15 דקות.</li>
		<li>לאחר מכן, perfuse דטרגנט ללא יונית 1% במים יונים למשך 10 דקות.</li>
		<li>החלף הקאמרית/הבקבוק decellularization 500 מ ל- PBS בלוק בתוספת x 1 אנטיביוטיקה (פניצילין-סטרפטומיצין שהוא גוסס), שמירה על הריאה תלויה ללא פגע עם הפקק שבתוך הבקבוק.</li>
		<li>למחוק את ורידי להגדיר, שמכניסים את נקז רגל 2 מחובר המיכל ביטול חזרה עד לסוף עורק הריאה תא decellularization, ולהפעיל את המשאבה ב 6 מ ל/דקה (L איור 1).</li>
		<li>Perfuse הריאות בשביל 72 h ולשמור על שינוי טוב, מגניב עם אנטיביוטיקה כל 12 שעות. הערה: הריאה acellular מוכן לשימוש מיידי. ניתן לאחסן ב-80 הלעפה תרוטרפמט עד שהוא נדרש. אם כתמים ורודים או קרישי דם, ניתן לאבחן בבירור בתוך האונות ריאות, למחוק את הריאה. זה אפשרי לבחון באופן אקראי עבור ה-DNA או histopathology. Acellular ריאה מלאה לא יציג יהיה שטף התאים ואת 99.9% של ה-DNA. הערה: בעת עבודה עם מודל הסלולר ריאות, לדלג על decellularization. הריאה שנקטפו (שלב 1) ניתן להגדיר ישירות באת ביוריאקטור.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ביוריאקטור הקמה
<ol><li>להכין את הבקבוק ביוריאקטור את הפריטים הדרושים עבור הסידור.<ol>
<li>קודחים חורים שלוש אחת פקק בקבוק 500 מ"ל במרחק שווה ולתקן סכינים סטריליים הנשי בשלושת החורים, באמצעות טבעות ניילון שחור (איור 2A ו- 2B). הערה: שני חורים, המנעול סכינים סטריליים מסתיים הפנים בחוץ, כאשר קצה אחד פונה בתוך הבקבוק.</li>
		<li>לחתוך 6 משאבת צינור, 2 בצינור, 6 ב שפופרת, צינור 1.5 מטרים, צינור רגל 2 ו צינור oxygenator 10 רגל לכל ביוריאקטור.</li>
		<li>חתך של מחט נירוסטה 18 גרם ו, שוב, לחבר את הקצוות עם אבובים מסתיימים עבור בצינורית והכו אותי.</li>
		<li>לעטוף את הצינור oxygenator, עם סכינים סטריליים מחברים נעל בקצוות, על ברז חשמלי מחוט באמצעות קלטות autoclave (איור 2C).</li>
		<li>אוטוקלב הנ פריטים ולשמור אותם ב- UV אור למשך 10 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הרכבתי את המשאבה בתוך החממה תרבות תא רגיל (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) עם מרווח נאות בין המגשים להתאמה בקלות בקבוק 500 מ"ל.</li>
	<li>תרסיס אתנול 70% על הדיו משאבת וחבר את צינור משאבת טלפוניה נעל זכוכית נקבה בשני הקצוות המשאבה.</li>
	<li>להגדיר את oxygenator העוטפת רשת התיל ברז חשמלי בתוך החממה התרבות התא על-ידי חיבור קצה אחד (זרימה החוצה) של oxygenator צינור המשאבה ואת הקצה השני עם הצינור 1.5 מטרים ב ביוריאקטור.</li>
	<li>להגדיר את הבקבוק ביוריאקטור ב אבטחה ארון עם תנאים אספטי.<ol>
<li>לצרף של צימוד 3-way (צהוב) בראש של אחד Luers הנשי כדי לשלוט בזרימה דרך הרשות הפלסטינית.</li>
		<li>להתחבר עם צימוד בכיוון אחד (כחול) עוד המחיצה נעל נשית סכינים סטריליים תא זריעה דרך קנה הנשימה (2F איור).</li>
		<li>לחבר 2 באבובים מבחוץ (לבן) ו-6 באבובים בתוך הבקבוק לזרום התקשורת החוצה. מתאים מנעול סכינים סטריליים זכר לרכבת התחתית רגל 2 וצרף סגנון לוג סכינים סטריליים הנשי טי לספק נגישות כדי להוסיף או להסיר כל דבר.</li>
		<li>לצרף אחד הפתחים של המחבר-כיוונית (נקבה סכינים סטריליים לוג סגנון טי) של צימוד בכיוון אחד.</li>
		<li>לצרף רגל 2 צינורות מנעול סכינים סטריליים זכר, מנעול סכינים סטריליים הנשי.</li>
		<li>להוסיף 200 מ של RPMI1640 עם 10% FBS ו 1% אנטיביוטיקה תא תרבות בינוני (משתנה לפי דרישה תא) ולהעביר את ביוריאקטור החממה. לחבר את הצינור oxygenator שני הקצוות פתוחים (צימוד בכיוון אחד, מחבר טי) כדי להפוך אותו מגיב ביולוגי לולאה סגורה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מראש להפעיל את המשאבה ב 6 מ ל/דקה בתוך החממה התרבות תאים עם תא תרבות המדיה כדי למלא את oxygenator ואת צינורות, כך אין בועות אוויר קיימים הצנרת.</li>
	<li>ברגע הצינורות מלאים עם המדיה, לסגור את צימוד ולהסיר את הבקבוק ביוריאקטור מן החממה על ידי ניתוק של oxygenators משני קצוות הבקבוק ביוריאקטור.</li>
	<li>לשים את הבקבוק ביוריאקטור הקבינט אבטחה, עוברים תרבות המדיה באמצעות צימוד, לצרף צימוד דרך מחבר ה-סכינים סטריליים זכר את הצינורית הרשות הפלסטינית של לגרדום ריאות (acellular או סלולרי). הערה: הנה זה ניתן להשתמש המודל acellular (בעקבות תהליך decellularization) או בלוק שנקטפו זה עתה לב-ריאה (קרי, המודל הסלולר, כפי שהוא שומר על תאי עכבר מקורית).</li>
	<li>עוברים תרבות המדיה באמצעות צימוד בכיוון אחד כדי להסיר את כל האוויר וקושרים את הצינורית והכו אותי על חוט משי לקנה הנשימה.</li>
	<li>הקפד להימנע כל פיתול של הרשות הפלסטינית ושל קנה הנשימה. קרוב הפקק ביוריאקטור עם הריאות לגרדום בפנים, שוב, גילוח ורחיצה כירורגית להעביר את ביוריאקטור החממה ולהתחיל את המשאבה במהירות 6 מ לדקה.</li>
	<li>הפעל מדיה תרבות למשך 10-15 דקות לוודא כל האונות לקבל בניפוח הריאה נראה במצב טוב (איור 2G).</li>
</ol>4. מודל גרורות, זריעה תא
הערה: להמשיך תא זריעה במודל ריאות הנ למחקר בצמיחה הגידול העיקרי. לשנות לגרדום ריאות (acellular או סלולרי) כדלקמן עבור דגם גרורתי.
<ol><li>להוציא את ביוריאקטור עם לגרדום ריאות מן החממה ותשחיל אבטחה הקבינט.</li>
	<li>להשתמש מזרק נעל זכוכית לעבור 5 מ של תרבות התקשורת דרך קנה הנשימה לפתוח את הפקק ביוריאקטור עם התליה לגרדום ריאות (2F איור).</li>
	<li>בשלב זה, אדם נוסף נדרש כדי לסייע ב השינוי של הריאה למודל גרורתי.</li>
	<li>קבל משי 2-0 ומוכן להשתמש מלקחיים זוויתי כדי לגרום למעבר דרך קנה הנשימה בנקודת נגע הסתעפות.</li>
	<li>לקשור את קנה הנשימה הולך הריאה הימנית בנקודה נגע הסתעפות וסמנו את הזרימה החופשית של מדיה דרך קנה הנשימה לריאה שמאלית על-ידי העברת תרבות המדיה. הערה: פעם אחת קנה הנשימה קשורה בנקודת נגע הסתעפות, תאים נזרע דרך קנה הנשימה באופן אוטומטי יופנו זרע אל האונות שמאל. זה יכול להיבדק לפני זריעה התאים על ידי התקשורת תרבות לדחוף דרך קנה הנשימה. במודל גרורתי, התקשורת יזיז האונות שמאל בלבד, אשר לנפח ולא את האונות נכון10.</li>
	<li>הגדר מזרק נעל זכוכית 20 מ"ל על גבי הצינורית והכו אותי ולהוסיף בקרת האוויר תאים של סרטן הריאה (A549, H1299) ב- 50 מ של מדיה תרבות שלמה RPMI1640 (2F איור).</li>
	<li>לבצע את התא זריעת ב אבטחה ארון. להוסיף 15 מ"ל של תאים במזרק ולתת לו לעבור אונות הריאה על ידי הכבידה. להוסיף את שאר התאים לפני כל בועות האוויר לעבור דרך.</li>
	<li>Acellular ריאות זריעה, לאסוף את המדיה perfused מטפטף בתוך הבקבוק ביוריאקטור, נותן להם לעבור דרך קנה הנשימה שוב 3 x. הערה: המדיה perfused יש לפעמים התאים הסרטניים נזרע. לכן, עבור יעיל זריעה, להחזיר התקשורת שוב קנה הנשימה דרך המזרק.</li>
	<li>ברגע נזרע, להסיר את המזרק, לחכות 15 דקות, להוסיף מדיה טריים, ומחזירים את ביוריאקטור בחזרה אינקובטור. הסר כל בועות האוויר הצנרת.</li>
	<li>. הפעל את המשאבה כדי perfuse התקשורת ב 6 מ ל/דקה</li>
</ol>

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Statistics,+2017.">Cancer Statistics, 2017.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li><li>Torre, L. A., Siegel, R. L., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Cancer+Statistics.">Lung Cancer Statistics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 893, 1-19 (2016).</li><li>Lallo, A., Schenk, M. W., Frese, K. K., Blackhall, F., Dive, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+and+CDX+models+as+a+tool+for+preclinical+drug+development.">Circulating tumor cells and CDX models as a tool for preclinical drug development.</a> Translational Lung Cancer Research. 6 (4), 397-408 (2017).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).</li><li>Bissell, M. J., Hines, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+don't+we+get+more+cancer?+A+proposed+role+of+the+microenvironment+in+restraining+cancer+progression.">Why don't we get more cancer? A proposed role of the microenvironment in restraining cancer progression.</a> Nature Medicine. 17 (3), 320-329 (2011).</li><li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics.">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).</li><li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lung+cancer+cells+grown+in+an+ex+vivo+3D+lung+model+produce+matrix+metalloproteinases+not+produced+in+2D+culture.">Human lung cancer cells grown in an ex vivo 3D lung model produce matrix metalloproteinases not produced in 2D culture.</a> PloS One. 7 (9), e45308 (2012).</li><li>Vishnoi, M., Mishra, D. K., Thrall, M. J., Kurie, J. M., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+from+a+4-dimensional+lung+cancer+model+are+resistant+to+cisplatin.">Circulating tumor cells from a 4-dimensional lung cancer model are resistant to cisplatin.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (3), 1056-1063 (2014).</li><li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profile+of+A549+cells+from+tissue+of+4D+model+predicts+poor+prognosis+in+lung+cancer+patients.">Gene expression profile of A549 cells from tissue of 4D model predicts poor prognosis in lung cancer patients.</a> International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. , (2013).</li><li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+four-dimensional+lung+cancer+model+mimics+metastasis.">Ex vivo four-dimensional lung cancer model mimics metastasis.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 99 (4), 1149-1156 (2015).</li><li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lung+cancer+cells+grown+on+acellular+rat+lung+matrix+create+perfusable+tumor+nodules.">Human lung cancer cells grown on acellular rat lung matrix create perfusable tumor nodules.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 93 (4), 1075-1081 (2012).</li><li>Pence, K. A., Mishra, D. K., Thrall, M., Dave, B., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+cells+form+primary+tumors+on+ex+vivo+four-dimensional+lung+model.">Breast cancer cells form primary tumors on ex vivo four-dimensional lung model.</a> Journal of Surgical Research. 210, 181-187 (2017).</li><li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Lung+Fibroblasts+Inhibit+Non-Small+Cell+Lung+Cancer+Metastasis+in+Ex+Vivo+4D+Model.">Human Lung Fibroblasts Inhibit Non-Small Cell Lung Cancer Metastasis in Ex Vivo 4D Model.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 100 (4), 1167-1174 (2015).</li><li>Mishra, D. K., Miller, R. A., Pence, K. A., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+cell+and+non+small+cell+lung+cancer+form+metastasis+on+cellular+4D+lung+model.">Small cell and non small cell lung cancer form metastasis on cellular 4D lung model.</a> BMC Cancer. 18 (1), 441 (2018).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

הריאה 4-D שמחוץ מספקת הזדמנות ללמוד הגידול ו גרורות ב תרגיל מעבדה. מטריצה ריאות מקורית היא מערכת מורכבת מספק תמיכה הרקמות ומתחזק אינטראקציות תא-תא, התא-מטריקס אינטראקציות, התמיינות, בארגון רקמות. הוא מספק הזדמנות להוסיף רכיבים microenvironment הגידול ללמוד והשפעותיהם על הגידול ואת האינטראקצי...

גרורות סרטן הוא האשם מאחורי רוב מקרי מוות מסרטן, מהווה את האתגר האולטימטיבי במאמץ להילחם בסרטן. המטרה הכוללת של שיטה זו הוא לעצב עבור תרבות ארבע-ממדי התא (4-D) אשר יש מימד של זרימה, בנוסף צמיחת תאים (תלת-ממדי) תלת ממדי פרוטוקול. הוא מייצג ברורים משלושת השלבים של תהליך גרורות [קרי, הגידול העיקרי, מחזורי תאים סרטניים (CTCs), נגעים גרורתי].
בשלושת העשורים האחרונים, מדענים ברחבי העולם הניב של שפע ללא תחרות של מידע כדי להבין את המנגנונים את התקדמות גרורתי, סוגי סרטן שונים, זה שיפור הסיכוי התרופה או ההישרדות ללא התקדמות המחלה. ניהול קליני של כמה סוגי סרטן, כגון סרטן השד, שיפור משמעותי1; עם זאת, כמה סוגי סרטן, כגון סרטן ריאות, עדיין יש עניים הישרדות2. מודלים בעלי חיים במבחנה , ויוו סייעו ביצירת תובנות חדשות שהתקנתי לחזק את התפתחות המחלה. בשנים האחרונות, תא xenografts נגזר קו (CDX), החולה, נגזר xenografts (PDX) היה עניין נוסף כפי הם משמרים הרלוונטיים תכונות רבות של הגידול העיקרי אנושי3, כגון צמיחה קינטיקה, תכונות היסטולוגית, התנהגותית מאפיינים, ואת התגובה לטיפול. עם זאת, כל דגם יש מגבלות משלו כדי להבין את המנגנון של מערך CTC, גרורות אל איבר מרוחק4,5,6.
לאחרונה, פיתחנו מודל סרטן ריאות 4-D ex-vivo על ידי ניצול הרעיון של איברים מניפולציות, תרבית תאים מבוססת זלוף. היא מחקה את הצמיחה סרטן ריאות האנושית על ידי יצירת גושים סרטניים perfusable לגדול לאורך זמן עם בני אדם דומים מופרש סרטן ייצור חלבון7. הוא מייצג את החתימה ביטוי גנים מנבאת המסכן ההישרדות בחולים עם סרטן, גם מראה תגובה טיפולית באמצעות רגרסיה הגידול על ציספלטין בטיפול8,9. דגם לונג השתנה עוד יותר כך הוא יכול לדמות נגעים גרורתי. CTCs להתפתח להערכת הגידול העיקרי, intravasate, בורחת אל תוך הריאה contralateral כדי ליצור נגעים גרורתי10. ג'ין ביטוי מחקרים מראים פרופיל ביטוי מובהק של הגידול העיקרי, את CTCs, נגעים גרורתי, קולטנים upregulation את קבוצת המשנה של גנים הדרושים עבור פנוטיפ10. תהליך גרורתי זה מתרחש בשל נוכחותם של תנאים וחיסונים אצל חולים עם סרטן. היתרון של מודל זה הוא הנוכחות של מטריצה טבעי ואדריכלות, זלוף של חומרים מזינים שמוביל היווצרות גושים סרטניים. בנוסף, הוא גם מספק הזדמנות לחקור את ההשפעות של מרכיבים שונים של גידול microenvironment או סמים על הגידול התקדמות לאורך זמן. מודל זה יכול לשמש כדי לגדל מגוון של תאים סרטניים (סרטן ריאות, סרטן השד, סרקומה וכו) תרגיל מעבדה.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dowley rat</td><td>Harlan</td><td>206M</td><td>Male</td></tr><tr><td>Chlorhexidine swab</td><td>Prevantics, NY, USA</td><td>NDC 10819-1080-1</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA</td><td>NDC 25021-400-10</td><td></td></tr><tr><td>18-gauge needle</td><td>McMaster Carr, USA</td><td>75165A249</td><td></td></tr><tr><td>2-0 silk tie</td><td>Ethicon, San Angelo, TX, USA</td><td>A305H</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pump</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07554-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pump head</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07519-05</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pump cartridge</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07519-70</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>14171211</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex Pump tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>06598-16</td><td></td></tr><tr><td>Female luer lock connectors</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-34</td><td>75165A249</td></tr><tr><td>Male luer lock connectors</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45513-04</td><td></td></tr><tr><td>black nylon ring</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-45509-04</td><td></td></tr><tr><td>Intravenous set</td><td>CareFusion</td><td>41134E</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Silicone oxygenator</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>ABW00011</td><td>Saint-GoBain-</td></tr><tr><td>Wire mesh</td><td>1164610105</td><td>Lowes</td><td>New York Wire</td></tr><tr><td>Female luer Lug Style TEE</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-56</td><td></td></tr><tr><td>Male luer integral lock ring to 200series Barb</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45518-08</td><td></td></tr><tr><td>Female luer thread style coupler</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-22</td><td></td></tr><tr><td>Clave connector</td><td>ICU Medical</td><td>11956</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Flo &amp;trade;4-way Stopcock w/swivel male luer lock</td><td>smith Medical</td><td>MX9341L</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex Pump tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>06598-13</td><td>for cannula</td></tr></tbody></table>

acellular and cellular lung model to study tumor metastasis

קשה לבודד תאים סרטניים בנקודות שונות של התקדמות הגידול. יצרנו שמחוץ ריאות מודל שיכול להציג את האינטראקציה של תאים סרטניים עם מטריצה טבעי וזרימת מתמיד של חומרים מזינים, כמו גם מודל זה מציג את האינטראקציה של תאים סרטניים עם רכיבים סלולרית רגילה מטריצה טבעי. המודל ריאות acellular ex-vivo נוצר על ידי בידוד בלוק לב-ריאה עכברוש והסרה של כל התאים באמצעות תהליך decellularization. הסמפונות העיקריים ממש קשורה מחוץ, תאים סרטניים מוצבים קנה הנשימה על ידי מזרק. התאים להזיז ואכלוס הריאה השמאלית. הריאה ממוקם אז מגיב ביולוגי שבו עורק הריאה מקבל זרם מתמיד של מדיה במעגל סגור. הגידול גדל על הריאה השמאלית הוא הגידול העיקרי. התאים הגידול מבודדים בתקשורת במחזור יאומנו. תאים סרטניים, תאי גידול בריאה הימנית נגעים גרורתי. דגם לונג הסלולר שמחוץ נוצר על-ידי דילוג על התהליך decellularization. כל דגם ניתן לענות על שאלות מחקריות שונות.

הריאה שנקטפו עכברוש שומר על שלמות להערכת ו alveoli11 (איור 3A ו- 3B). על decellularization, רכיבי מטריצה חוץ-תאית הריאות acellular, כגון, fibronectin, האלסטין והקולגן, נשמרים11 (3C דמות תלת-ממד, 3E, 3F). Decellulariza...

Watch this Scientific Journal Video about Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis at JoVE.com

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

דגם לונג acellular וסלולריות ללמוד גרורות הגידול

כאן, אנו מציגים עבור ex-vivo ריאות סרטן מודל מחקה את השלבים של התקדמות הגידול ומסייעת לבודד גידול ראשוני, פרוטוקול מחזורי תאים סרטניים נגעים גרורתי.

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

acellular-and-cellular-lung-model-to-study-tumor-metastasis

Research

JoVE Journal

Cancer Research

7.5K Views.  Houston Methodist Hospital Research Institute. כאן, אנו מציגים עבור ex-vivo ריאות סרטן מודל מחקה את השלבים של התקדמות הגידול ומסייעת לבודד גידול ראשוני, פרוטוקול מחזורי תאים סרטניים נגעים גרורתי.

Video: Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we demonstrate a simple assay to evaluate tumor cell extravasation or micrometastasis. In this assay, tumor cells were injected through the tail vein, and after a short period, the lungs were dissected and digested to count the accumulated labeled tumor cells. This assay skips the initial step of primary tumor invasion into the blood vessel and facilitates the study of events in the distant organ where tumor metastasis occurs. The number of cells injected into the blood vessel can be optimized to observe a limited number of metastases. It has been reported that stromal cells in the distant organ contribute to metastasis. Thus, this assay could be a useful tool to explore potential therapeutic drugs or devices for prevention of tumor metastasis.

This manuscript describes a method to quantify tumor cell accumulation in the lungs in an animal model of tumor metastasis.

ריאות הגידול תא גיוס Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. However, little is known about the heterogeneity of liver metastases, and animal models capable of evaluating the development of individual metastatic colonies are needed. Here, we present an advanced model of hepatic metastases that provides the ability to quantitatively visualize the development of individual tumor clones in the liver and estimate their growth kinetics and colonization efficiency. We generated a panel of monoclonal derivatives of HCT116 human colorectal cancer cells stably labeled with luciferase and tdTomato and possessing different growth properties. With a splenic injection followed by a splenectomy, the majority of these clones are able to generate hepatic metastases, but with different frequencies of colonization and varying growth rates. Using the In Vivo&#160;Imaging System (IVIS), it is possible to visualize and quantify metastasis development with in vivo luminescent and ex vivo fluorescent imaging. In addition, Diffuse Luminescent Imaging Tomography (DLIT) provides a 3D distribution of liver metastases in vivo. Ex vivo fluorescent imaging of harvested livers provides quantitative measurements of individual hepatic metastatic colonies, allowing for the evaluation of the frequency of liver colonization and the growth kinetics of metastases. Since the model is similar to clinically observed liver metastases, it can serve as a modality for detecting genes associated with liver metastasis and for testing potential ablative or adjuvant treatments for liver metastatic disease.

The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.

מתקדם במודל חיה של גרורה גסה בכבד: טכניקות הדמיה ונכסים של משובטים גרורתי

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

גרורה ניסויית חיסוני CTL המאמצת העברת דגם עכבר

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Immunology and Infection

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung colonization in osteosarcoma (OS) by fluorescence microscopy. This article provides a detailed description of the protocol, and discusses examples of obtaining image data on metastatic growth using widefield or confocal fluorescence microscopy platforms. The flexibility of the PuMA model permits researchers to study not only the growth of OS cells in the lung microenvironment, but also to assess the effects of anti-metastatic therapeutics over time. Confocal microscopy allows for unprecedented, high-resolution imaging of OS cell interactions with the lung parenchyma. Moreover, when the PuMA model is combined with fluorescent dyes or fluorescent protein genetic reporters, researchers can study the lung microenvironment, cellular and subcellular structures, gene function, and promoter activity in metastatic OS cells. The PuMA model provides a new tool for osteosarcoma researchers to discover new metastasis biology and assess the activity of novel anti-metastatic, targeted therapies.

The goal of this article is to provide a detailed description of the protocol for the pulmonary metastasis assay (PuMA). This model permits researchers to study metastatic osteosarcoma (OS) cell growth in lung tissue using a widefield fluorescence or confocal laser-scanning microscope.

שיקולים מעשיים בלימוד כיבוש ריאות גרורתי אוסטאוסרקומה באמצעות וזמינותו גרורות בריאות

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by CTCs critically contributes to early lung metastatic processes, has been vigorously investigated. As such, animal models are the only approach that captures the full systemic process of metastasis. Given that problems occur in previous experimental designs for examining the contributions of CTCs to blood vessel extravasation, we established an in vivo lung colonization assay in which a long-term-fluorescence cell-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), was used to label suspended tumor cells and lung perfusion was performed to clear non-specifically trapped CTCs prior to lung removal, confocal imaging, and quantification. Polymeric fibronectin (polyFN) assembled on CTC surfaces has been found to mediate lung colonization in the final establishment of metastatic tumor tissues. Here, to specifically test the requirement of polyFN assembly on CTCs for lung colonization and extravasation, we performed short term lung colonization assays in which suspended Lewis lung carcinoma cells (LLCs) stably expressing FN-shRNA (shFN) or scramble-shRNA (shScr) and pre-labeled with 20 &#956;M of CFSE were intravenously inoculated into C57BL/6 mice. We successfully demonstrated that the abilities of shFN LLC cells to colonize the mouse lungs were significantly diminished in comparison to shScr LLC cells. Therefore, this short-term methodology may be widely applied to specifically demonstrate the ability of CTCs within the circulation to colonize the lungs.

An animal model is needed to decipher the role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting lung colonization during cancer metastasis. Here, we established and successfully performed an in vivo assay to specifically test the requirement of polymeric fibronectin (polyFN) assembly on CTCs for lung colonization.

הקמת Assay קולוניזציה הריאה עבור מחזור הגידול ויזואליזציה תאים ברקמות הריאה

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

ניתוח פתולוגי של גרורות ריאות בעקבות הזרקת וריד זנב לרוחב של תאים סרטניים

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as the bone, brain, and lung. Although extensively studied, the mechanistic details of this process remain poorly understood. While common imaging modalities, including computed tomography (CT), positron emission tomography (PET), and magnetic resonance imaging (MRI), offer varying degrees of gross visualization, each lacks the temporal and spatial resolution necessary to detect the dynamics of individual tumor cells. To address this, numerous techniques have been described for intravital imaging of common metastatic sites. Of these sites, the lung has proven especially challenging to access for intravital imaging owing to its delicacy and critical role in sustaining life. Although several approaches have previously been described for single-cell intravital imaging of the intact lung, all involve highly invasive and terminal procedures, limiting the maximum possible imaging duration to 6-12 h. Described here is an improved technique for the permanent implantation of a minimally invasive thoracic optical Window for High-Resolution Imaging of the Lung (WHRIL). Combined with an adapted approach to microcartography, the innovative optical window facilitates serial intravital imaging of the intact lung at single-cell resolution across multiple imaging sessions and spanning multiple weeks. Given the unprecedented duration of time over which imaging data can be gathered, the WHRIL can facilitate the accelerated discovery of the dynamic mechanisms underlying metastatic progression and numerous additional biologic processes within the lung.

Here, we present a protocol for the surgical implantation of a permanently indwelling optical window for the murine thorax, which enables high-resolution, intravital imaging of the lung. The permanence of the window makes it well-suited to the study of dynamic cellular processes in the lung, especially those that are slowly evolving, such as metastatic progression of disseminated tumor cells.

חלון קבוע לחקירת גרורות סרטן לריאה

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as ...

בדיקת הפצת תאי גידול מגרורות ריאה

Tracking Tumor Cell Dissemination from Lung Metastases Using Photoconversion

Metastasis - the systemic spread of cancer - is the leading cause of cancer-related deaths. Although metastasis is commonly thought of as a unidirectional process wherein cells from the primary tumor disseminate and seed metastases, tumor cells in existing metastases can also redisseminate and give rise to new lesions in tertiary sites in a process known as &#34;metastasis-from-metastases&#34; or &#34;metastasis-to-metastasis seeding.&#34; Metastasis-to-metastasis seeding may increase the metastatic burden and decrease the patient&#39;s quality of life and survival. Therefore, understanding the processes behind this phenomenon is crucial to refining treatment strategies for patients with metastatic cancer.
Little is known about metastasis-to-metastasis seeding, due in part to logistical and technological limitations. Studies on metastasis-to-metastasis seeding rely primarily on sequencing methods, which may not be practical for researchers studying the exact timing of metastasis-to-metastasis seeding events or what promotes or prevents them. This highlights the lack of methodologies that facilitate the study of metastasis-to-metastasis seeding. To address this, we have developed - and describe herein - a murine surgical protocol for the selective photoconversion of lung metastases, allowing specific marking and fate tracking of tumor cells redisseminating from the lung to tertiary sites. To our knowledge, this is the only method for studying tumor cell redissemination and metastasis-to-metastasis seeding from the lungs that does not require genomic analysis.

מחבר זרקור: פענוח זריעת גרורות לגרורות באמצעות טכניקת In Vivo חדשה למעקב אחר התפשטות סרטן השד 

We present a method for studying tumor cell redissemination from lung metastases involving a surgical protocol for the selective photoconversion of lung metastases, followed by the identification of redisseminated tumor cells in tertiary organs.

מעקב אחר הפצת תאי גידול מגרורות ריאה באמצעות פוטו-המרה

Metastasis - the systemic spread of cancer - is the leading cause of cancer-related deaths. Although metastasis is commonly thought of as a unidirectional ...

דגם לונג acellular וסלולריות ללמוד גרורות הגידול

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ריאות הגידול תא גיוס Assay

מתקדם במודל חיה של גרורה גסה בכבד: טכניקות הדמיה ונכסים של משובטים גרורתי

גרורה ניסויית חיסוני CTL המאמצת העברת דגם עכבר

שיקולים מעשיים בלימוד כיבוש ריאות גרורתי אוסטאוסרקומה באמצעות וזמינותו גרורות בריאות

הקמת Assay קולוניזציה הריאה עבור מחזור הגידול ויזואליזציה תאים ברקמות הריאה

ניתוח פתולוגי של גרורות ריאות בעקבות הזרקת וריד זנב לרוחב של תאים סרטניים

חלון קבוע לחקירת גרורות סרטן לריאה

מעקב אחר הפצת תאי גידול מגרורות ריאה באמצעות פוטו-המרה

מעקב אחר הפצת תאי גידול מגרורות ריאה באמצעות פוטו-המרה

מעקב אחר הפצת תאי גידול מגרורות ריאה באמצעות פוטו-המרה