Name: acellular and cellular lung model to study tumor metastasis
Uploaded: 2018-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis at JoVE.com

Min P. Kim recibió el apoyo de la beca de la segunda John W. Johnson investigación beca Asociación Americana torácica cirugía, Graham Foundation, Houston Metodista especialidad médico grupo de investigación de Grant, Michael M. y Joann H. cono Premio a la investigación. Agradecemos a Ann Saikin para el idioma de edición del manuscrito.

Los protocolos para los experimentos en animales fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso en el Instituto Metodista de Houston y llevado a cabo con arreglo a las normas, leyes, directrices y políticas.
1. rata pulmón cosecha
<ol><li>Anestesiar una rata Sprague-Dawley macho de 4 a 6 semanas de edad por una inyección intraperitoneal (IP) de ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) en su flanco. Asegúrese de que la anestesia comprobando la ausencia de movimiento cuando el dedo de extremidades que se pellizque con el fórceps.</li>
	<li>Después de 10 min, afeitarse el pecho y el abdomen y limpie la piel con una esponja de clorhexidina.</li>
	<li>Retirar la piel por cogerlo con pinzas y por incisión con un bisturí desechable. Después de abrir la cavidad torácica mediante la incisión con bisturí, realizar una toracotomía bilateral mediante la reducción de la parte anterior de las costillas de la izquierda y la derecha de la membrana con tijeras. Nota: Esta es una cirugía no supervivencia.</li>
	<li>Sostener la caja torácica e inyecte 2 mL de heparina (1000 unidades/mL) en el ventrículo derecho del corazón mediante una aguja de 27 G. Nota: Esto evitará que cualquier formación de coágulos de sangre en el pulmón.</li>
	<li>Completamente quitar la caja torácica con las tijeras y colocar una aguja de 18 G en el ventrículo izquierdo como una abertura, hasta que salga la sangre. Luego, inyecta 15 mL de solución de tampón fosfato salino heparinizado (12,5 unidades/mL; PBS heparinizada) en el ventrículo derecho con una aguja de 25 G.</li>
	<li>Cortar el inferior y superior de la vena cava, dos venas grandes en el lado derecho del corazón y vacíe los pulmones con un adicional 10 mL de PBS heparinizada en el ventrículo derecho con una aguja de 27 G. Nota: La vena cava inferior se visualiza bajo el fondo del corazón como un gran recipiente lleno de rojos de la sangre. Del mismo modo, la vena cava superior se visualiza en la parte superior del corazón como un vaso grande.</li>
	<li>Cortar la tráquea en la base de la tiroides. Retire con cuidado la aorta descendente a nivel de la vena de los hemiazygos y ramas de la aorta en el arco.</li>
	<li>Sacar el bloque de corazón y pulmón de la cavidad torácica y el resto del cuerpo de la rata.</li>
	<li>Realizar ventriculotomy cortando la mitad de los ventrículos derecho e izquierdos y coloque una cánula de acero inoxidable aguja 18 G precargada por encargo a través del ventrículo derecho la arteria pulmonar principal (PA).</li>
	<li>Fijar la cánula con una corbata de seda de 2-0 y exponer cuidadosamente el ventrículo derecho y aurícula.</li>
	<li>Coloque un cierre Luer hembra en el ventrículo izquierdo y fijarlo con una corbata de seda de 2-0.</li>
	<li>Limpie el bloque de corazón y pulmón con 20 mL de PBS heparinizada a través de la cánula de PA y colocar en un tubo de 50 mL que contienen medios de cultivo o PBS heparinizada. Nota: Para un modelo de celular, vaya al paso 3.1 configurar el biorreactor. Modelo acelular, proceda al paso 2.1 para la descelularización.</li>
</ol>2. pulmón descelularización
<ol><li>
Preparación de la unidad de descelularización
	<ol>
<li>Preparar cada cámara/botella de descelularización perforar dos agujeros en la tapa de la botella y ajustar un Luer hembra en los orificios (figura 1A y 1B). Asegúrelo con un anillo de nylon negro en el otro lado. Del mismo modo, perfore un orificio único en otra tapa de la botella para el accesorio set intravenoso (figura 1). Nota: Figura 1A y 1B son de los mismo tapones de botellas de dos lados diferentes. Figura 1 es de un diverso casquillo con un agujero como se indicó anteriormente en el paso 2.1.1.</li>
		<li>Fije tubos de 6 pulgadas (Figura 1J) y un tubo de 0,5 pulgadas (en la arteria pulmonar o al final de PA) a un Luer hembra del interior de los tapones de botellas (figura 1A y 1B) y un conector Luer lock macho en los extremos. Ajuste el cerrojo con una botella de 500 mL la descelularización cámara/botella.</li>
		<li>Conecte un extremo de dos tubos de 2 pies (que están conectados con un conector Luer lock macho) en ambos extremos del tubo de la bomba (figura 1 H), que se une a la cabeza de la bomba (Figura 1E y 1F) por un cartucho (figura 1) con un Luer hembra cerradura (figura 1I).</li>
		<li>Conecte los otros extremos de los 2 pies tubos (en el paso 2.1.3) cada uno hacia una hembra Luer lock en la descelularización cámara/cápsula (figura 1 L).</li>
		<li>Configurar un 250 mL heparinizada botella de PBS (con 200 mL de PBS) colgando de una botella invertida sobre un soporte con el extremo proximal de un sistema intravenoso (figura 1) insertado en la tapa y el extremo distal reemplazando los 2 pies de tubo conectado a la descelularización c cámara/de la botella en el extremo de la PA (figura 1B). Conecte este 2 pies de tubo a la botella de descarte. Nota: Las botellas se establecen en la cartulina, como se muestra en la figura 1 K. Los tubos intravenosos salen las botellas colgantes para dispensar los reactivos en el andamio de pulmón.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Proceso de la descelularización de pulmón
	<ol>
<li>Ejecutar el PBS heparinizado a una presión de perfusión fisiológica de 30 mm Hg (figura 1 K) hasta que fluye libremente en la cámara/botella de descelularización y, a continuación, conecte el bloque de corazón y pulmón al PA a través de la cánula de PA.</li>
		<li>Mantener funcionando la bomba continuamente, para que cualquier exceso tampón dentro de la cámara/botella de descelularización obtiene descarta.</li>
		<li>Ejecute el PBS heparinizado a través del PA durante 15 min a una presión de perfusión de 30 mm Hg para el lavado inicial (figura 1 K).</li>
		<li>Sustituir la botella de PBS heparinizada con 0.1% sodio dodecil sulfato (SDS) en agua desionizada y perfusión del pulmón por 2 h para la descelularización.</li>
		<li>Después de la descelularización, perfusión agua desionizada esterilizado por el andamio del pulmón durante 15 minutos.</li>
		<li>A continuación, perfusión 1% detergente no-iónico en agua desionizada durante 10 minutos.</li>
		<li>Reemplace la descelularización cámara/botella con 500 mL de autoclave PBS suplementado con antibióticos x 1 (penicilina-estreptomicina anfotericina), manteniendo el pulmón colgante intacto con la tapa dentro de la botella.</li>
		<li>Deseche la intravenosa establece, poner los 2 pies de tubo adjunto al recipiente hacia el final de la arteria pulmonar de la cámara de descelularización y haga funcionar la bomba a 6 mL/min (figura 1 L).</li>
		<li>Perfusión de los pulmones durante 72 h y seguir cambiando el PBS con antibióticos cada 12 h. Nota: El pulmón acelular está listo para su uso inmediato. Pueden ser almacenado a-80 ° c hasta que se necesite. Si manchas rosas o coágulos de sangre pueden visualizarse claramente en los lóbulos del pulmón, deseche el pulmón. Es posible probar al azar de ADN o histopatología. Un pulmón completo acelular no mostrará células y 99.9% del ADN serán lavado. Nota: Cuando se trabaja con un modelo de pulmón celular, omitir la descelularización. El pulmón cosechado (paso 1) puede ajustarse directamente en el biorreactor.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. biorreactor configuración
<ol><li>Preparar la botella de biorreactor y los elementos necesarios para la puesta a punto.<ol>
<li>Perfore tres agujeros en una tapa de botella de 500 mL a la misma distancia y fijar un Luer hembra en los tres orificios, con anillos de nylon negro (figura 2A y 2B). Nota: En dos orificios, el luer-lock termina cara al exterior, mientras que el interior de la botella se enfrenta a uno de los extremos.</li>
		<li>Corte 6 en tubo de la bomba, un 2 en el tubo, un 6 en tubo, un tubo de 1,5 pies, un tubo de 2 pies y un tubo oxigenador de 10 pies por biorreactor.</li>
		<li>Corte una aguja de acero inoxidable de 18 G y, otra vez, conectar los extremos con tubería biocompatible para una cánula traqueal.</li>
		<li>Envuelva el tubo del oxigenador, con conectores de tipo Luer lock en los extremos, en una malla de alambre del solenoide con cintas de autoclave (figura 2).</li>
		<li>Autoclave de los mencionados artículos y mantener en UV luz durante 10 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configurar la bomba dentro de la incubadora de la cultura de la célula normal (37 ° C, 5% CO2) con espacio adecuado entre las bandejas para adaptarse fácilmente a una botella de 500 mL.</li>
	<li>Rociar etanol al 70% en el cartucho de la bomba y conectar el tubo de bomba con conectores de bloqueo Luer hembra en ambos extremos a la bomba.</li>
	<li>Configurar el oxigenador envuelto alrededor de la malla de alambre del solenoide dentro de la incubadora de cultivo celular conectando un extremo (la salida) del oxigenador para el tubo de la bomba y el otro extremo con el 1,5 pies de tubo en el biorreactor.</li>
	<li>Configurar la botella de biorreactor en una bioseguridad con condiciones asépticas.<ol>
<li>Coloque una llave de 3 vías (amarillo) a la cabeza de uno de la luer hembra para controlar el flujo a través de el PA</li>
		<li>Conecte una llave de paso unidireccional (azul) a otra hembra Luer lock tabique hermético para siembra a través de la tráquea (figura 2F) de la célula.</li>
		<li>Conectar 2 tubos en el exterior (blanco) y 6 en tubo en el interior de la botella para hacer circular los medios de comunicación hacia fuera. Coloque un conector Luer lock macho a un tubo de 2 pies y fije un estilo de terminal Luer hembra Tee para proporcionar accesibilidad para añadir o quitar nada.</li>
		<li>Coloque una llave de paso unidireccional a uno de los orificios del conector de tres vías (hembra Luer estirón estilo Tee).</li>
		<li>Conecte un conector Luer lock macho y un conector Luer lock hembra para tubos de 2 pies.</li>
		<li>Añadir 200 mL de RPMI1640 con 10% FBS y 1% antibióticos medio de cultivo celular (varía según el requisito de la célula) y transferir el biorreactor a la incubadora. Conecte el tubo del oxigenador a los dos extremos abiertos (llave de paso unidireccional y Tee conector) para convertirlo en un biorreactor de bucle cerrado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Funcionamiento previo la bomba en 6 mL/min dentro de la incubadora de cultivo celular con medios de cultivo celular para llenar el oxigenador y tubos, para que no existan burbujas de aire en la tubería.</li>
	<li>Una vez que los tubos se llenan con los medios de comunicación, cerrar la llave de paso y sacar la botella del biorreactor de la incubadora desconectando los oxigenadores de ambos extremos de la botella del biorreactor.</li>
	<li>Poner la botella de biorreactor en la bioseguridad gabinete pasar medios de cultivo a través de la llave de paso y sujetar la cánula del PA del andamio del pulmón (acelular o celular) a la llave de paso a través del conector Luer macho. Nota: Aquí es posible utilizar el modelo acelular (siguiendo el proceso de descelularización) o un bloque de corazón y pulmón recién cosechados (es decir, el modelo de celular, ya que retiene las células de rata nativa).</li>
	<li>Pasar los medios de cultivo a través de una llave de paso unidireccional para quitar cualquier aire y atar la cánula traqueal por un hilo de seda a la tráquea.</li>
	<li>Asegúrese de evitar cualquier torsión de la PA y la tráquea. Cerca la tapa del biorreactor con el pulmón del andamio dentro de y, otra vez, asépticamente transferir el biorreactor a la incubadora y poner en marcha la bomba a una velocidad de 6 mL/min.</li>
	<li>Funcionamiento de medios de cultivo para 10-15 minutos para asegurarse de que conseguirá inflados todos los lóbulos y el pulmón se ve en buena forma (figura 2).</li>
</ol>4. metástasis modelo y siembra de células
Nota: Proceder a la siembra con el anterior modelo de pulmón para un estudio de crecimiento del tumor primario de la célula. Modificar el andamio del pulmón (acelular o celular) como sigue para el modelo metastásico.
<ol><li>Saque el biorreactor con el andamio de pulmón de la incubadora y ponerlo en la seguridad de la biotecnología gabinete.</li>
	<li>Utilizar una jeringa con cierre Luer para pasar 5 mL de medio de cultivo a través de la tráquea y abrir la tapa del biorreactor con el colgante andamio de pulmón (figura 2F).</li>
	<li>En este paso, una persona más es necesaria para ayudar en la modificación del pulmón a un modelo de metástasis.</li>
	<li>Obtener seda 2-0 punto y utilizar pinzas angulares para hacer un paso a través de la tráquea en el punto de bifurcación.</li>
	<li>Atar la tráquea va al pulmón derecho en el punto de bifurcación y controlar la libre circulación de los medios de comunicación a través de la tráquea al pulmón izquierdo pasando los medios de cultivo. Nota: Una vez que la tráquea se ata en el punto de bifurcación, las células sembradas a través de la tráquea serán automáticamente dirigidas a las semillas a los lóbulos izquierdos. Puede probarse antes de sembrar las células por el empuje de los medios de cultivo a través de la tráquea. En el modelo metastásico, los medios de comunicación se mueven a los lóbulos izquierdos solamente, que se inflan, y no a los lóbulos derecho10.</li>
	<li>Establecer una jeringa de 20 mL Luer lock encima de la cánula traqueal y células de cáncer de pulmón ATCC (A549, H1299) en 50 mL RPMI1640 completado de medios de cultivo (figura 2F).</li>
	<li>Llevar a cabo la célula siembra en el gabinete de seguridad de la biotecnología. Añadir 15 mL de células en la jeringa y deje pasar a través de los lóbulos del pulmón por gravedad. Agregar el resto de las células antes de pasan burbujas de aire.</li>
	<li>En el sembrador de pulmón acelular, recoger los medios perfundidos goteo hacia abajo en la botella del biorreactor y dejarlo pasar a través de la tráquea otra vez 3 x. Nota: Los medios de comunicación inundado a veces tienen las células de cáncer sembradas. Por lo tanto, para la siembra eficiente, devolver los medios de comunicación otra vez en la tráquea a través de la jeringa.</li>
	<li>Una vez sembradas, retire la jeringa, espere 15 min, añadir medio fresco y regresar el biorreactor a una incubadora. Eliminar las posibles burbujas de aire en la tubería.</li>
	<li>Arrancar la bomba para inundar los medios de comunicación en 6 mL/min.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Statistics,+2017.">Cancer Statistics, 2017.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li><li>Torre, L. A., Siegel, R. L., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Cancer+Statistics.">Lung Cancer Statistics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 893, 1-19 (2016).</li><li>Lallo, A., Schenk, M. W., Frese, K. 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Los autores no tienen nada que revelar.

El pulmón ex vivo 4-D proporciona una oportunidad para estudiar el crecimiento del tumor y la metástasis en un montaje de laboratorio. Una matriz de pulmón nativo es un sistema complejo que provee soporte al tejido normal y mantiene interacciones célula-célula, las interacciones célula-matriz, diferenciación celular y la organización de tejido. Proporciona una oportunidad para añadir cualquier componentes del microambiente del tumor para estudiar sus efectos sobre el crecimiento tumoral y la interacció...

Metástasis del cáncer es el culpable detrás de la mayoría de las muertes relacionadas con el cáncer y representa el mayor desafío en los esfuerzos para combatir el cáncer. El objetivo general de este método es diseñar un protocolo para una cultura de cuatro dimensiones (4D) celular que tiene una dimensión de flujo, además del crecimiento de la célula (3D) tridimensional. Representa las tres fases distintas del proceso de metástasis [es decir, el tumor primario, circulación de las células tumorales (CTC) y lesiones metastásicas].
En las últimas tres décadas, los científicos alrededor del mundo rindieron una riqueza sin precedentes de información para entender los mecanismos subyacentes a la progresión metastásica en diferentes tipos de cáncer que mejoró la perspectiva de un cura o una supervivencia libre de progresión. El manejo clínico de algunos tipos de cáncer, como cáncer de mama, mejorado significativamente1; sin embargo, algunos cánceres, como cáncer de pulmón, aún tienen una supervivencia pobre2. Modelos animales in vitro e in vivo han sido fundamentales en la generación de nuevos conocimientos sobre los mecanismos que sustentan el desarrollo de la enfermedad. En los últimos años, derivado de línea xenoinjertos (CDX) de la célula y xenoinjertos derivados del paciente (PDX) han sido de mayor interés como conservan muchas características relevantes del tumor humano primario3, como la cinética de crecimiento, características histológicas, comportamiento características y la respuesta al tratamiento. Sin embargo, cada modelo tiene sus limitaciones para entender el mecanismo de formación de CTC y metástasis en un órgano distante4,5,6.
Recientemente, hemos desarrollado un modelo 4-D ex vivo lung Cáncer utilizando el concepto de reingeniería de órgano y de cultivo celular basada en perfusión. Imita el crecimiento de cáncer de pulmón humano mediante la formación de nódulos de tumor perfusable que crecen en el tiempo con un parecido humano secretada cáncer proteína producción7. Representa la firma de expresión de gen que predice supervivencia pobre en pacientes con cáncer y también muestra una respuesta terapéutica por regresión del tumor al cisplatino tratamiento8,9. El modelo de pulmón más fue modificado para que pueda formar las lesiones metastáticas. El CTC se convierten de un tumor primario y intravasate en la vasculatura y extravasate en el pulmón contralateral para formar lesiones metastáticas10. Estudios de expresión génica sugieren un perfil de expresión distinta del tumor primario, la CTC y las lesiones metastáticas y la regulación al alza del subconjunto de genes para el fenotipo10. Este proceso metastásico se produce debido a la presencia de condiciones biológicas en pacientes con cáncer. La ventaja de este modelo es la presencia de una matriz natural y arquitectura y una perfusión de nutrientes que conduce a la formación de nódulos del tumor. Además, también proporciona una oportunidad para estudiar los efectos de diversos componentes del microambiente tumoral o medicamentos en la progresión del tumor con el tiempo. Este modelo puede utilizarse para cultivar una variedad de células de cáncer (cáncer de pulmón, cáncer de mama, sarcoma, etc.) en un montaje de laboratorio.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dowley rat</td><td>Harlan</td><td>206M</td><td>Male</td></tr><tr><td>Chlorhexidine swab</td><td>Prevantics, NY, USA</td><td>NDC 10819-1080-1</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA</td><td>NDC 25021-400-10</td><td></td></tr><tr><td>18-gauge needle</td><td>McMaster Carr, USA</td><td>75165A249</td><td></td></tr><tr><td>2-0 silk tie</td><td>Ethicon, San Angelo, TX, USA</td><td>A305H</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pump</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07554-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pump head</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07519-05</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pump cartridge</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07519-70</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>14171211</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex Pump tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>06598-16</td><td></td></tr><tr><td>Female luer lock connectors</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-34</td><td>75165A249</td></tr><tr><td>Male luer lock connectors</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45513-04</td><td></td></tr><tr><td>black nylon ring</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-45509-04</td><td></td></tr><tr><td>Intravenous set</td><td>CareFusion</td><td>41134E</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Silicone oxygenator</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>ABW00011</td><td>Saint-GoBain-</td></tr><tr><td>Wire mesh</td><td>1164610105</td><td>Lowes</td><td>New York Wire</td></tr><tr><td>Female luer Lug Style TEE</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-56</td><td></td></tr><tr><td>Male luer integral lock ring to 200series Barb</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45518-08</td><td></td></tr><tr><td>Female luer thread style coupler</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-22</td><td></td></tr><tr><td>Clave connector</td><td>ICU Medical</td><td>11956</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Flo &amp;trade;4-way Stopcock w/swivel male luer lock</td><td>smith Medical</td><td>MX9341L</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex Pump tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>06598-13</td><td>for cannula</td></tr></tbody></table>

acellular and cellular lung model to study tumor metastasis

Es difícil aislar las células tumorales en diferentes puntos de progresión del tumor. Hemos creado un modelo ex vivo lung que puede mostrar la interacción de las células tumorales con la matriz natural y flujo continuo de nutrientes, así como un modelo que muestra la interacción de las células del tumor con componentes celulares normales y una matriz natural. El modelo de pulmón acelular ex vivo es creado por un bloque de corazón y pulmón de la rata de aislar y eliminar todas las células mediante el proceso de descelularización. El bronquio principal derecho se ligan y se colocan las células del tumor en la tráquea por una jeringa. Las células de moverán y llenar el pulmón izquierdo. El pulmón se coloca en un biorreactor donde la arteria pulmonar recibe un flujo continuo de medios de comunicación en circuito cerrado. El tumor en el pulmón izquierdo es el tumor primario. Las células del tumor que se aíslan en los medios de circulación circulan las células tumorales y las células del tumor en el pulmón derecho son lesiones metastásicas. El modelo de pulmón celular ex vivo es creado por saltarse el proceso de descelularización. Cada modelo puede utilizarse para responder a preguntas de investigación.

El pulmón de rata mantiene el intacto vasculatura y alvéolos11 (Figura 3A y 3B). A descelularización, los componentes de la matriz extracelular de un pulmón acelular, como colágeno, fibronectina y elastina, se conservan11 (figura 3, 3D, 3Ey 3F). La descelularización conduce a un retiro completo de las células...

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Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Modelo de pulmón acelular y celular para el estudio de metástasis de Tumor

Aquí, presentamos un protocolo para un ex vivo lung cáncer modelo que imita los pasos de progresión del tumor y ayuda a aislar un tumor primario, circulación de las células tumorales y las lesiones metastáticas.

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

7.5K vistas.  Houston Methodist Hospital Research Institute. Aquí, presentamos un protocolo para un ex vivo lung cáncer modelo que imita los pasos de progresión del tumor y ayuda a aislar un tumor primario, circulación de las células tumorales y las lesiones metastáticas.

Video: Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we demonstrate a simple assay to evaluate tumor cell extravasation or micrometastasis. In this assay, tumor cells were injected through the tail vein, and after a short period, the lungs were dissected and digested to count the accumulated labeled tumor cells. This assay skips the initial step of primary tumor invasion into the blood vessel and facilitates the study of events in the distant organ where tumor metastasis occurs. The number of cells injected into the blood vessel can be optimized to observe a limited number of metastases. It has been reported that stromal cells in the distant organ contribute to metastasis. Thus, this assay could be a useful tool to explore potential therapeutic drugs or devices for prevention of tumor metastasis.

This manuscript describes a method to quantify tumor cell accumulation in the lungs in an animal model of tumor metastasis.

Ensayo de reclutamiento de células de pulmón Tumor

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. However, little is known about the heterogeneity of liver metastases, and animal models capable of evaluating the development of individual metastatic colonies are needed. Here, we present an advanced model of hepatic metastases that provides the ability to quantitatively visualize the development of individual tumor clones in the liver and estimate their growth kinetics and colonization efficiency. We generated a panel of monoclonal derivatives of HCT116 human colorectal cancer cells stably labeled with luciferase and tdTomato and possessing different growth properties. With a splenic injection followed by a splenectomy, the majority of these clones are able to generate hepatic metastases, but with different frequencies of colonization and varying growth rates. Using the In Vivo&#160;Imaging System (IVIS), it is possible to visualize and quantify metastasis development with in vivo luminescent and ex vivo fluorescent imaging. In addition, Diffuse Luminescent Imaging Tomography (DLIT) provides a 3D distribution of liver metastases in vivo. Ex vivo fluorescent imaging of harvested livers provides quantitative measurements of individual hepatic metastatic colonies, allowing for the evaluation of the frequency of liver colonization and the growth kinetics of metastases. Since the model is similar to clinically observed liver metastases, it can serve as a modality for detecting genes associated with liver metastasis and for testing potential ablative or adjuvant treatments for liver metastatic disease.

The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.

Avanzada modelo animal de colorrectal metástasis en hígado: Técnicas de imagen y propiedades metastásicas de los clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

La metástasis experimentales y CTL Modelo inmunoterapia adoptiva de transferencia de ratón

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Inmunología e Infección

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung colonization in osteosarcoma (OS) by fluorescence microscopy. This article provides a detailed description of the protocol, and discusses examples of obtaining image data on metastatic growth using widefield or confocal fluorescence microscopy platforms. The flexibility of the PuMA model permits researchers to study not only the growth of OS cells in the lung microenvironment, but also to assess the effects of anti-metastatic therapeutics over time. Confocal microscopy allows for unprecedented, high-resolution imaging of OS cell interactions with the lung parenchyma. Moreover, when the PuMA model is combined with fluorescent dyes or fluorescent protein genetic reporters, researchers can study the lung microenvironment, cellular and subcellular structures, gene function, and promoter activity in metastatic OS cells. The PuMA model provides a new tool for osteosarcoma researchers to discover new metastasis biology and assess the activity of novel anti-metastatic, targeted therapies.

The goal of this article is to provide a detailed description of the protocol for the pulmonary metastasis assay (PuMA). This model permits researchers to study metastatic osteosarcoma (OS) cell growth in lung tissue using a widefield fluorescence or confocal laser-scanning microscope.

Consideraciones prácticas en el estudio de colonización pulmonar metastásico en Osteosarcoma usando el ensayo de metástasis pulmonar

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by CTCs critically contributes to early lung metastatic processes, has been vigorously investigated. As such, animal models are the only approach that captures the full systemic process of metastasis. Given that problems occur in previous experimental designs for examining the contributions of CTCs to blood vessel extravasation, we established an in vivo lung colonization assay in which a long-term-fluorescence cell-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), was used to label suspended tumor cells and lung perfusion was performed to clear non-specifically trapped CTCs prior to lung removal, confocal imaging, and quantification. Polymeric fibronectin (polyFN) assembled on CTC surfaces has been found to mediate lung colonization in the final establishment of metastatic tumor tissues. Here, to specifically test the requirement of polyFN assembly on CTCs for lung colonization and extravasation, we performed short term lung colonization assays in which suspended Lewis lung carcinoma cells (LLCs) stably expressing FN-shRNA (shFN) or scramble-shRNA (shScr) and pre-labeled with 20 &#956;M of CFSE were intravenously inoculated into C57BL/6 mice. We successfully demonstrated that the abilities of shFN LLC cells to colonize the mouse lungs were significantly diminished in comparison to shScr LLC cells. Therefore, this short-term methodology may be widely applied to specifically demonstrate the ability of CTCs within the circulation to colonize the lungs.

An animal model is needed to decipher the role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting lung colonization during cancer metastasis. Here, we established and successfully performed an in vivo assay to specifically test the requirement of polymeric fibronectin (polyFN) assembly on CTCs for lung colonization.

El establecimiento de un ensayo de colonización pulmonar para la visualización de células tumorales en tejidos pulmonares de la circulación

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

Análisis patológico de metástasis pulmonares después de la inyección lateral de células tumorales en la vena de la cola

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as the bone, brain, and lung. Although extensively studied, the mechanistic details of this process remain poorly understood. While common imaging modalities, including computed tomography (CT), positron emission tomography (PET), and magnetic resonance imaging (MRI), offer varying degrees of gross visualization, each lacks the temporal and spatial resolution necessary to detect the dynamics of individual tumor cells. To address this, numerous techniques have been described for intravital imaging of common metastatic sites. Of these sites, the lung has proven especially challenging to access for intravital imaging owing to its delicacy and critical role in sustaining life. Although several approaches have previously been described for single-cell intravital imaging of the intact lung, all involve highly invasive and terminal procedures, limiting the maximum possible imaging duration to 6-12 h. Described here is an improved technique for the permanent implantation of a minimally invasive thoracic optical Window for High-Resolution Imaging of the Lung (WHRIL). Combined with an adapted approach to microcartography, the innovative optical window facilitates serial intravital imaging of the intact lung at single-cell resolution across multiple imaging sessions and spanning multiple weeks. Given the unprecedented duration of time over which imaging data can be gathered, the WHRIL can facilitate the accelerated discovery of the dynamic mechanisms underlying metastatic progression and numerous additional biologic processes within the lung.

Here, we present a protocol for the surgical implantation of a permanently indwelling optical window for the murine thorax, which enables high-resolution, intravital imaging of the lung. The permanence of the window makes it well-suited to the study of dynamic cellular processes in the lung, especially those that are slowly evolving, such as metastatic progression of disseminated tumor cells.

Una ventana permanente para investigar la metástasis del cáncer en el pulmón

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as ...

Examen de la diseminación de células tumorales a partir de metástasis pulmonares

Tracking Tumor Cell Dissemination from Lung Metastases Using Photoconversion

Metastasis - the systemic spread of cancer - is the leading cause of cancer-related deaths. Although metastasis is commonly thought of as a unidirectional process wherein cells from the primary tumor disseminate and seed metastases, tumor cells in existing metastases can also redisseminate and give rise to new lesions in tertiary sites in a process known as &#34;metastasis-from-metastases&#34; or &#34;metastasis-to-metastasis seeding.&#34; Metastasis-to-metastasis seeding may increase the metastatic burden and decrease the patient&#39;s quality of life and survival. Therefore, understanding the processes behind this phenomenon is crucial to refining treatment strategies for patients with metastatic cancer.
Little is known about metastasis-to-metastasis seeding, due in part to logistical and technological limitations. Studies on metastasis-to-metastasis seeding rely primarily on sequencing methods, which may not be practical for researchers studying the exact timing of metastasis-to-metastasis seeding events or what promotes or prevents them. This highlights the lack of methodologies that facilitate the study of metastasis-to-metastasis seeding. To address this, we have developed - and describe herein - a murine surgical protocol for the selective photoconversion of lung metastases, allowing specific marking and fate tracking of tumor cells redisseminating from the lung to tertiary sites. To our knowledge, this is the only method for studying tumor cell redissemination and metastasis-to-metastasis seeding from the lungs that does not require genomic analysis.

Autor destacado: Decodificación de la siembra de metástasis a metástasis utilizando una nueva técnica in vivo para rastrear la propagación del cáncer de mama 

We present a method for studying tumor cell redissemination from lung metastases involving a surgical protocol for the selective photoconversion of lung metastases, followed by the identification of redisseminated tumor cells in tertiary organs.

Seguimiento de la diseminación de células tumorales a partir de metástasis pulmonares mediante fotoconversión

Metastasis - the systemic spread of cancer - is the leading cause of cancer-related deaths. Although metastasis is commonly thought of as a unidirectional ...

Modelo de pulmón acelular y celular para el estudio de metástasis de Tumor

Resumen

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Ensayo de reclutamiento de células de pulmón Tumor

Avanzada modelo animal de colorrectal metástasis en hígado: Técnicas de imagen y propiedades metastásicas de los clones

La metástasis experimentales y CTL Modelo inmunoterapia adoptiva de transferencia de ratón

Consideraciones prácticas en el estudio de colonización pulmonar metastásico en Osteosarcoma usando el ensayo de metástasis pulmonar

El establecimiento de un ensayo de colonización pulmonar para la visualización de células tumorales en tejidos pulmonares de la circulación

Análisis patológico de metástasis pulmonares después de la inyección lateral de células tumorales en la vena de la cola

Una ventana permanente para investigar la metástasis del cáncer en el pulmón

Seguimiento de la diseminación de células tumorales a partir de metástasis pulmonares mediante fotoconversión

Seguimiento de la diseminación de células tumorales a partir de metástasis pulmonares mediante fotoconversión

Seguimiento de la diseminación de células tumorales a partir de metástasis pulmonares mediante fotoconversión