עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (מענק מס 31400936, 31460260), את מדעי הטבע קרן של ג'יאנגשי פרובינציה של סין (20171BAB215020). אנו מודים גם את תוכנית משותפת בין אוניברסיטת נאנצ'אנג המלכה מרי אוניברסיטת לונדון לתמיכה עבודה זו.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה של אוניברסיטת נאנצ'אנג.
1. להרכיב את הציוד ולחבר את האזמל הקטן
<ol><li>עיצוב הפרמטר לפי הדרישות (Supplementary איור 1).</li>
	<li>להגיש את הפרמטר במפעל מקומי לייצור לוחות אקריליק.</li>
	<li>להרכיב את כל החלקים ברצף: שימוש בכלורופורם לשילוב 7 לוחות אקריליק מסחריים לתוך טנק עם סעיף ערוץ ומים אמבטיה (איור 1). התראה: כלורופורם מייצר חומרים רעילים כאשר היא עונה אור וחמצן. להרכיב את המנגנון בשכונה fume.</li>
	<li>התקנת הרכיב חשמליים דרך החור בלוח אקריליק #1 (איור 2 א, ראש חץ).</li>
	<li>כדי להתקין את בקר טמפרטורה, ליצור חור קטן על הלוח אקריליק #2 באמצעות מקדחה חשמלית, ולהתקין גלאי טמפרטורה (איור 2 א, חץ). להתקין תרמוסטט דיגיטלית על הטנק (איור 2 א). הערה: גלאי טמפרטורה צריך להיות בתוך 1 ס מ מתחת לפני המים.</li>
	<li>כדי לספק גישה כוח, להתאים את המתח מתחת 24 V לפני הפעלת הציוד.</li>
	<li>הסר את המגש פסולת סעיף האזמל הקטן.</li>
	<li>קישור התעלה מקטעים עם בעל להב מיקרוטום עם איטום סיליקון ניטראלי (איור 2B). הערה: לא ימרחו כלשהו איטום סיליקון ניטראלי מעל החלק העליון של הלהב כך הלהב הישן מוחלף בקלות.</li>
	<li>יבש לילה כדי לאפשר את הכלורופורם ואת הזמן איטום סיליקון ניטראלי לגבש.</li>
	<li>התקן את הלהב בעל להב. יוצקים מים לאמבט המים (איור 2C). פני המים צריך רק לגעת העליון של הלהב (ראש חץבאיור 2D, ).</li>
</ol>2. פרפין חלוקתה
הערה: פסולת לצבור לעיתים קרובות על הקצה העליון או התחתון של הרחוב שעווה, פני המים. יש לנקות את הלכלוך הזה באופן קבוע.
<ol><li>
לבצע הפרפין קונבנציונליים חלוקתה10.
	<ol>
<li>תהדק את הדגימה פרפין-מוטבע על מיקרוטום סיבוביים ולמקם את הלהב בעל להב.</li>
		<li>להפוך את handwheel, סעיף הדגימה.</li>
		<li>העברת הכלים פרפין למחלקה לאמבט מים חמים 38.5 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>לאסוף שהסעיפים אל המיקרוסקופ שקופית של פני המים לאחר התגלגלות.</li>
		<li>יבש את השקופיות בתנור ב 42 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
פרפין משופרת חלוקתה (איור 3)
	<ol>
<li>הפעל את הציוד.</li>
		<li>לפתוח את התנור עם מתג זיהוי טמפרטורה ולהגדיר את הטמפרטורה יישוב בין C º 38.0 40.0 מעלות לשעה מראש לחמם את המים.</li>
		<li>לשנות לבלוק פראפין שרכשה פרפין להטביע; אז במקום לבלוק פראפין על המלחציים קלטת של מיקרוטום ונעל אותה. הערה: גבולות לכוחו של הרחוב פרפין צריך להיות שונה בצורה אופקית כדי למנוע רצועת סעיף מ ויוצרים קשת ולהיות מסוגלים לזרום דרך ערוץ קטעים צרים.</li>
		<li>במהירות הגישה המדגם על ידי חיתוך להקשיה.</li>
		<li>התאם בעובי סעיף מתאים (10 מיקרומטר מוח העכבר למבוגרים, למבוגרים העכבר הכליות של העובר מוח העכבר, 4 מיקרומטר לעיניים דג זברה). להפוך את handwheel ואת הסעיפים יזין באופן אוטומטי את המקטעים ערוץ ואמבט.</li>
		<li>בסעיף הדגימה במשיחה חיתוך איטית ואחידה (איור 3 א). הערה: Thethickness של המקטע הראשון תשונה לאחר handwheel הופסק למשך מספר דקות. יש להחליף את הלהבים חד פעמי כאשר הסעיפים יש שריטות רצופים.</li>
		<li>מדריך הסעיפים לחדר אמבטיה לצוף בקו (איור 3B, ג 3). הערה: אם שבאזור head לאנאפוליס הקיר קאמרית, השתמש מדריך מברשת לשמור אותו צף.</li>
		<li>דבקים סעיפים על גבי שקופיות מיקרוסקופ. לאחר הסעיפים לחלוטין נפרשים באמבט מים, מספר מקטעים נפרדים עם פינצטה. אז להרים מהאמבטיה מים על גבי שקופיות מיקרוסקופ (דמות תלת-ממד). הערה: סעיפים יש לאסוף מן הצד האחורי של האמבט במים, כמו אלה בערוץ חלקים, החלק הפנימי. של האמבטיה מים לא עדיין יהיה מלא פרש.</li>
		<li>יבש את השקופיות על-ידי הצבתם בתנור 42 º C למשך הלילה. השקופיות ואז ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר ללא הגבלת זמן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>השתמש Hematoxylin-אאוזין (HE) צביעת לצורך הערכה של שיטה משופרת8.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li><li>Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+neuron+differentiation+in+the+central+nervous+system+by+tritiated+thymidine+autoradiography.">Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography.</a> Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).</li><li>Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+Computer-aided+jet-based+3D+tissue+engineering.">Organ printing: Computer-aided jet-based 3D tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 21 (4), 157-161 (2003).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosectioning+tissues.">Cryosectioning tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 3 (8), (2008).</li><li>Viebahn, C., Luttenberg, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+anti-roll+plate+as+a+remedy+for+the+ill-effects+of+electrical+charge+during+cryosectioning.">A modified anti-roll plate as a remedy for the ill-effects of electrical charge during cryosectioning.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 37 (7), 1157-1160 (1989).</li><li>Onozato, M. L., Hammond, S., Merren, M., Yagi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+completely+automated+tissue-sectioning+machine+for+paraffin+blocks.">Evaluation of a completely automated tissue-sectioning machine for paraffin blocks.</a> Journal of Clinical Pathology. 66 (2), 151-154 (2013).</li><li>Sabaliauskas, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+zebrafish+histology.">High-throughput zebrafish histology.</a> Methods. 39 (3), 246-254 (2006).</li><li>Chen, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid-Cut:+An+Improved+Sectioning+Method+for+Recalcitrant+Plant+Tissue+Samples.">Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54754 (2016).</li><li>Kucherenko, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin-Embedded+and+Frozen+Sections+of+Drosophila+Adult+Muscles.">Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2438 (2010).</li><li>Cornell, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+Embedding+and+Thin+Sectioning+of+Microbial+Colony+Biofilms+for+Microscopic+Analysis.">Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).</li><li>Whiteland, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+detection+of+T-cell+subsets+and+other+leukocytes+in+paraffin-embedded+rat+and+mouse+tissues+with+monoclonal+antibodies.">Immunohistochemical detection of T-cell subsets and other leukocytes in paraffin-embedded rat and mouse tissues with monoclonal antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 313-320 (1995).</li><li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sectioning+Mammary+Gland+Whole+Mounts+for+Lesion+Identification.">Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).</li><li>Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+and+Characterization+of+Atherosclerotic+Lesions+in+the+Murine+Aortic+Sinus.">Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50933 (2013).</li><li>Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD163:+A+specific+marker+of+macrophages+in+paraffin-embedded+tissue+samples.">CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples.</a> American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).</li><li>Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+Protocols+for+Human+Pancreatic+Islets.">Staining Protocols for Human Pancreatic Islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e4068 (2012).</li></ol>

המחברים יש פטנט על התקן זה והצהר אין אינטרסים מתחרים.

כדי לשפר מורפולוגיה סעיף פרפין לפתור את הבעיה של זמן מבוזבז במהלך הפרפין קונבנציונליים חלוקתה, יצרנו של פרפין משופרת חלוקתה שיטה המשלבת חיתוך התגלגלות. שיטה משופרת זו מסתמכת על ציוד פשוטה שכוללת ערוץ סעיף, אמבט מים, תנור עם מתג זיהוי טמפרטורה. הכלים סעיף נכנס לאמבט מים דרך ערוץ סעיף, מתגלה ...

מחקר מורפולוגי חשוב במחקר הביולוגי. למרות הטכנולוגיה החדשה אפשרה לחוקרים לבחון את המטרות שלהם ישירות מן כל רקמות או אורגניזמים1,2,3, חיתוך הדגימה למקטעים דק, ואחריו מכתים, נשאר הראשית מורפולוגיה של רקמות היחיד של שיטה ולא לקחת כסף אבל גם חלבון מיקוד ישירות בתוך הרקמה. מיקרוסקופ אור עושה שימוש בשלושה סוגי המקטעים: פרפין, מוקפאים, ולא semithin. למרות cryosectioning נפוץ להגנה על רקמות antigenicity, הכנת הדגימה היא פשוטה, המורפולוגיה רקמות יתרת הוא עני, מצוייה דק אופטים4,5. פרפין חלוקתה היא השיטה השכיחה בתערוכה מורפולוגיה השתמרה היטב. דגימות הן מיובשת לגמרי, המוטבעות שעווה, ניתן לאחסן את אבני פרפין ללא הגבלת זמן. בנוסף, פרפין חלוקתה מייצרת חלקים דקים לשפר את הגישה בדיקה ביולוגית בניסויים נוספים ולהפחית תא כיסוי שכבת בכיוון Z.
עם זאת, חלוקתה הפרפין קונבנציונליים הוא מייגע, דורש מיומנות מפעיל. פרפין מקטעים לעבור קיבוע התייבשות, הטבעה, חותכים, צף. חשוב, העברת סרטים סעיף מהמחזיק סכין לאמבט מים הוא הכרחי, אבל קשה עבור מפעילי ג'וניור. בעיקר אוויר יבש, הסרטים סעיף חשל עקב חשמל סטטי ולכן קשה נפרשים על פני מים חמים. כדי לשפר את סעיף איכות, הרטבה השטח חשוף רקמות בין מיקרוטום להב מעברים, קירור הבלוקים השעווה הטבעית אותם במי קרח, או העלאת הלחות עם מכשיר לחות ליד האזמל הקטן מומלץ6,7 . שיטות חדשות לשיפור פרפין חלוקתה כוללים היברידית הטבעה פרפין, cryosectioning8ו מחלקה מסחרית העברת מערכת סיוע9. למרות השיטות לשפר באופן חלקי פרפין חלוקתה מהירות ואיכות, הם גורמים חלוקתה הרבה יותר מסורבלת, מערכות העברת מקטע מסחריים יקרים.
ב פרוטוקול זה, נדגים כיצד ליצור פשוט, זול וגמיש ציוד צעד אחר צעד, אשר ניתן לחבר בעל להב מיקרוטום רוטרי. ציוד זה כולל ערוץ סעיף באמבט מים, תנור עם מתג זיהוי טמפרטורה. לאחר חיתוך, עשרות סעיפים לזרום לתוך הערוץ מדור והזן את המים הרותחים ישירות, ובכך התגלגלות באופן אוטומטי. זה משפר את היעילות של פרפין חלוקתה, הופך את הטכנולוגיה הזו נוחה יותר. שימוש זו שיטה, הבוגרים יותר בעכבר מקטעים בהיפוקמפוס, העכבר למבוגרים כליות מקטעים, עובריים 15.5 מיושן (E15.5) העכבר המוח, ומקטעים עין דג זברה בוגרת מקטעים היו קוצרים בפחות זמן, נשארה יותר מורפולוגית. שיטה זו יכולה לשמש גם עבור דגימות רקמה אחרים הדורשים פרפין מואצת חלוקתה תוך הימנעות איבוד ההבחנה סעיף.

<table><tbody><tr><td>Incubator</td><td>Boekel Scientific</td><td>133000-2</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Xylene&amp;nbsp;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>Heated Paraffin Embedding Module</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Commercial acrylic board</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trichloromethane</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>Tubular electric heating element(12 V 200 W)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperature controller(12 V 120 W)</td><td>Mingsuo</td><td>XH-W3002</td><td></td></tr><tr><td>Rotary microtome&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutral silicone sealant</td><td></td><td></td><td>Link the water channel with the microtome knife holder</td></tr><tr><td>Voltage transformer</td><td>Dearll</td><td>S-250-12</td><td></td></tr><tr><td>Disposable blade</td><td>Accu-Edge</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Baso Diagnostics Inc.</td><td>BA-4025</td><td></td></tr><tr><td>Eosin&amp;nbsp;</td><td>Baso Diagnostics Inc.</td><td>BA-4025</td><td></td></tr><tr><td>Microslide</td><td>Sail Brand</td><td>7105</td><td></td></tr><tr><td>Neutral balsam</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid</td><td>10004160</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip&amp;nbsp;</td><td>Citoglas</td><td>10212424C</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Xilong Chemical</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Water bath for paraffin sections</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HistoCore Arcadia C&amp;nbsp;- Cold Plate</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>paraffin repellent spray&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990420</td><td></td></tr></tbody></table>

the cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning

חלוקתה של הרקמה פרפין-מוטבע הוא בשימוש נרחב כיום מגוון של פתולוגיה. עם זאת, מייגע. כדי לשפר את שיטה זו, מספר חברות מסחריות פיתחו מערכות העברת מקטע מורכבים באמצעות מים נוזלים. כדי לפשט את הטכנולוגיה הזאת, יצרנו שיטה פשוטה באמצעות ציוד ביתי המשלב הביתור ועל צף בתוך תא תרמוסטטי פשוטה; לכן, הסעיפים להזין באופן אוטומטי את המים הרותחים על פני המים. ההיפוקמפוס מוח העכבר למבוגרים, העכבר למבוגרים כליות, מוח העכבר מתחלקים, עיניים למבוגרים דג זברה נחתכו באמצעות חלוקתה הפרפין קונבנציונליים והן בשיטת הציג להשוואה. ניתוח סטטיסטי מראה שיפור השיטה שלנו הזמן שנחסך המיוצר חלקים באיכות גבוהה יותר. בנוסף, פרפין חלוקתה של הדגימה כל תוך זמן קצר קל עבור מפעילי ג'וניור.

השיטה משופרת גדל מספר קטעים שלמים פרפין. בדקנו שיטה חדשה על רקמות בהיפוקמפוס העכבר למבוגרים, העכבר למבוגרים כליות, מוח העכבר מתחלקים עיני דג זברה. מים נוסף למיכל, טמפרטורת המים נשמר בין 38.0 ° C עד 40.0 מעלות צלזיוס. לאחר באופן סדרתי הכנת את דגימות הרקמות, היו למחלקה, בהשוואה חל...

Watch this Scientific Journal Video about The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning at JoVE.com

The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning

חיתוך ושיטת צף בשביל לרקמות פרפין-מוטבע על חלוקתה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לשפר את חלוקתה פרפין. שיטה זו משלבת חיתוך צף באמצעות תא תרמוסטטי פשוטות כדי למנוע את תהליך ההעברה הנדרש על-ידי השיטה המקובלת. כתוצאה מכך, את היעילות ואת מספר קטעים שלמים פרפין היו השתפרה מאוד.

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial ...

the-cutting-floating-method-for-paraffin-embedded-tissue-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.2K Views.  Nanchang University. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לשפר את חלוקתה פרפין. שיטה זו משלבת חיתוך צף באמצעות תא תרמוסטטי פשוטות כדי למנוע את תהליך ההעברה הנדרש על-ידי השיטה המקובלת. כתוצאה מכך, את היעילות ואת מספר קטעים שלמים פרפין היו השתפרה מאוד.

Video: The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

חתך דק של ההכנות פורסים עבור אימונוהיסטוכימיה

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Biology

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and genetic alterations. Mammary gland whole mounts are an inexpensive method to capture the progression of morphological changes that may arise after exposure. However, in later life, when abnormalities are more prone to develop, sole reliance on this one method may not always provide enough information to make a proper diagnosis of the abnormality. Historically, in chemical test guideline studies, a single mammary gland is removed at necropsy and prepared as a hematoxylin and eosin (H&#38;E)-stained section. The incorporation of contralateral mammary whole-mount collection and analysis decreases the likelihood of a false-negative assessment. Evaluation of the whole mount is limited by the presence of one or two entire mammary glands on a slide, and in some cases, the abnormalities observed in the whole mount are not uniformly represented in the H&#38;E section.&#160; The goal of this study was to develop a protocol for converting coverslipped mammary whole mounts to H&#38;E-stained sections so that lesions that would otherwise have been missed or that are difficult to diagnose can be identified. Here, we detail a method to produce a high-quality, paraffin-embedded H&#38;E section from a mammary gland that was initially prepared as a whole mount. In comparison to a tissue that was intentionally prepared for H&#38;E sectioning, the whole mount requires additional preparation for tissue removal and processing. However, this method is considered inexpensive, as it requires common lab reagents and little additional time. As a result, this method can provide invaluable information on how chemical and environmental exposures alter normal mammary development, as well as display changes that occur because of genetic modifications.

We developed a method to successfully remove, process, section, and stain, for histopathological evaluation, mammary tissue that had originally been fixed on slides as whole mounts. This method may promote the collection and evaluation of mammary gland whole mounts in reproductive and developmental test guideline studies.

חתך בלוטות החלב שלמות מלא עבור זיהוי הנגע

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Cancer Research

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and sectioning of intact microbial colony biofilms using perfused paraffin wax. To adapt this method for use on colony biofilms, we developed techniques for maintaining each sample on its growth substrate and laminating it with an agar overlayer, and added lysine to the fixative solution. These optimizations improve sample retention and preservation of micromorphological features. Samples prepared in this manner are amenable to thin sectioning and imaging by light, fluorescence, and transmission electron microscopy. We have applied this technique to colony biofilms of Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, and Vibrio cholerae. The high level of detail visible in samples generated by this method, combined with reporter strain engineering or the use of specific dyes, can provide exciting insights into the physiology and development of microbial communities.

We describe fixation, paraffin embedding, and thin sectioning techniques for microbial colony biofilms. In prepared samples, biofilm substructure and reporter expression patterns can be visualized by microscopy.

פרפין הטבעה ואת חלוקתה דק של מושבת חיידקים Biofilms לבדיקה מיקרוסקופית

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

Immunology and Infection

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

הכנה של רקמת מוח הפרימאטים לא-אנושית עבור טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה ו מיקרוסקופי אלקטרונים

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the multicellular interactions of native tissue. Tissue&#160;slices immediately cut from freshly resected tumors preserve spatial aspects of intratumor heterogeneity (ITH), thus making them useful surrogates of in vivo biology. Careful optimization of tissue slice preparation and cultivation conditions is fundamental for the predictive diagnostic potential of tumor slice explants. In this regard, murine models are valuable, as these provide a consistent flow of tumor material to perform replicate and reproducible experiments. This protocol describes the culturing of murine lung tumor-derived tissue slices using a rotating incubation unit, a system that enables intermittent exposure of tissues to oxygen and nutrients. Our previous work showed that the use of rotating incubation units improves the viability of tissue compared to other culture methods, particularly floating slices and stagnant filter supports. Here, we further show that slice thickness influences the viability of cultured slices, suggesting that optimization of slice thickness should be done for different tissue types. Pronounced ITH in relevant oncogenic functions, such as signaling activities, stromal cell infiltration or expression of differentiation markers, necessitates evaluation of adjacent tissue slices for the expression of markers altered by drug treatment or cultivation itself. In summary, this protocol describes the generation of murine lung tumor slices and their culture on a rotating incubation unit and demonstrates how slices should be systematically analyzed for the expression of heterogeneous tissue markers, as a prerequisite prior to drug response studies.

We provide a method for the generation, cultivation and systematic analysis of organotypic slices derived from murine lung tumors. We also describe how to optimize for slice thickness, and how to select drug concentrations to treat tumor slices.

הקמת וניתוח של הגידול פרוסה Explants כתנאי בדיקות אבחון

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

-Cut ההיברידי: שיטת חתך משופרת עבור דוגמאות רקמות צמח סרבן

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a mixed cell population in a structured architecture that impacts function, and human islets are widely variable in cell type composition. Current frequently used methods to study cultured islets include molecular studies performed on whole islets, lumping disparate islet cell types together, or microscopy or molecular studies on dispersed islet cells, disrupting islet architecture. For in vivo islet studies, paraffin-embedded pancreas sectioning is a powerful technique to assess cell-specific outcomes in the native pancreatic environment. Studying post-culture islets by paraffin sectioning would offer several advantages: detection of multiple outcomes on the same islets (potentially even the exact-same islets, using serial sections), cell-type-specific measurements, and maintaining native islet cell-cell and cell-substratum interactions both during experimental exposure and for analysis. However, existing techniques for embedding isolated islets post-culture are inefficient, time consuming, prone to loss of material, and generally produce sections with inadequate islet numbers to be useful for quantifying outcomes. Clinical pathology laboratory cell block preparation facilities are inaccessible and impractical for basic research laboratories. We have developed an improved, simplified bench-top method that generates sections with robust yield and distribution of islets. Fixed islets are resuspended in warm histological agarose gel and pipetted into a flat disc on a standard glass slide, such that the islets are distributed in a plane. After standard dehydration and embedding, multiple (10+) 4 - 5 &#181;m sections can be cut from the same islet block. Using this method, histological&#160;and immunofluorescent analyses can be performed on mouse, rat, and human islets. This is an effective, inexpensive, time-saving approach to assess cell-type-specific, intact-architecture outcomes from cultured islets.

Ex vivo pancreatic islet studies are important for diabetes research. Existing techniques to study cultured islets in their native 3-dimensional architecture are time consuming, inefficient, and infrequently used. This work describes a new, simple, and efficient method for generating high-quality paraffin sections of whole cultured islets.

הלבלב איון הטבעה למקטעי פרפין

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching mycoheterotrophic plants (i.e., plants that obtain carbon from fungi), remarkable aspects of their structural adaptations, the patterns of tissue colonization by fungi, and the morphoanatomy of subterranean organs can enlighten their developmental strategies and their relationships with hyphae, the source of nutrients. Another important role of symbiotic fungi is related to the germination of orchid seeds; all Orchidaceae species are mycoheterotrophic during germination and seedling stage (initial mycoheterotrophy), even the ones that photosynthesize in adult stages. Due to the lack of nutritional reserves in orchid seeds, fungal symbionts are essential to provide substrates and enable germination. Analyzing germination stages by structural perspectives can also answer important questions regarding the fungi interaction with the seeds. Different imaging techniques can be applied to unveil fungi endophytes in plant tissues, as are proposed in this article. Freehand and thin sections of plant organs can be stained and then observed using light microscopy. A fluorochrome conjugated to wheat germ agglutinin can be applied to the fungi and co-incubated with Calcofluor White to highlight plant cell walls in confocal microscopy. In addition, the methodologies of scanning and transmission electron microscopy are detailed for mycoheterotrophic orchids, and the possibilities of applying such protocols in related plants is explored. Symbiotic germination of orchid seeds (i.e., in the presence of mycorrhizal fungi) is described in the protocol in detail, along with possibilities of preparing the structures obtained from different stages of germination for analyses with light, confocal, and electron microscopy.

This protocol aims to provide detailed procedures for collecting, fixing, and maintaining mycoheterotrophic plant samples, applying different microscopy techniques such as scanning and transmission electron microscopy, light, confocal, and fluorescence microscopy to study fungal colonization in plants tissues and seeds germinated with mycorrhizal fungi.

טכניקות מיקרוסקופיה לפענוח התיישבות פטרייתית ברקמות צמחים מיקוהטרוטרופיים ונביטה סימביוטית של זרעים

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

Optimized Thin Endometrium Mouse Model with Low Mortality and Minimal Adhesions

Establishing a Mouse Model of Thin Endometrium

Thin endometrium (TE) has been widely recognized as a critical cause of infertility. However, the pathogenesis of TE remains unclear, and satisfactory treatment options are still urgently needed. Several animal models of TE have been developed, but the mouse model involving abdominal surgery and injection of 95% ethanol presents a formidable challenge due to the high mortality rate and risk of intrauterine adhesions if not performed correctly. Here, we describe a detailed protocol that produces reliable and reproducible TE with a very low mortality rate and minimal intrauterine adhesions by injecting 95% ethanol into the mouse uterus with varying infusion times. The results showed that all of the mice successfully developed TE with infusion times ranging from 1-3 min, characterized by a typical reduction in endometrial thickness and the number of glands, as well as excessive endometrial fibrosis. These findings suggest that this mouse model is suitable for studying thin endometrium and can serve as a platform for developing future TE treatments.

This article describes a detailed protocol for producing a reliable and reproducible thin endometrium with a very low mortality rate and minimal intrauterine adhesions by injecting 95% ethanol into the mouse uterus within 1-3 min.

Thin endometrium (TE) has been widely recognized as a critical cause of infertility. However, the pathogenesis of TE remains unclear, and satisfactory ...

Formalin-Fixed Paraffin Embedded (FFPE) Tissue Preservation: A Method for Studying Tissue Morphology

Source: Nagaraj A.S., et al., <a href="https://www.jove.com/v/58569/establishment-analysis-tumor-slice-explants-as-prerequisite-for">Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The following video describes how to preserve morphology of a tissue with formalin fixation and paraffin embedding.