דור של תרבויות רקמות אמבריולוגיה תלת-ממד (3D-LTCs) עבור מידול המחלה

שיטה זו מאפשרת חקירה של רקמה אנושית חיה במבנה ובהרכב תלת-מימדי טבעי לתרגום ממצאי מעבדה מרכזיים לטיפולים פוטנציאליים. טכניקה זו מאפשרת במיוחד את הדור של תרבות רקמות רקמה רקמת ריאה אנושית נותק בניתוח או explanted עבור הדמיה של דגימות רקמת ריאה החולה שנפטר בודדים. רקמת ריאה ללא מחלות יכולה לשמש תרבות רקמת 3D כדי מודל מחלות ריאתי ex vivo המאפשר ניתוח של פתומכניזם מוקדם ברזולוציה מרחבית גבוהה.

התחל על ידי הצבת דגימת ריאות חתוך לתוך 15 מיליליטר של מדיום טיפוח בצלחת תרבות סטרילית 15 ס"מ ומגש מתכת סטרילי מכוסה נייר טישו, ולמלא מזרק 30 מיליליטר עם 42 מעלות צלזיוס נמוך נקודת התכה התעוררה. מוציאים את האובטור מקטטר ורידי היקפי ומצמידים את הקטטר למזרק 30 מיליליטר. לזהות ברונכיוס בקוטר 0.5 עד 3 מילימטר ברקמת האוורור בחלק שלם של הרקמה, ולהכניס בעדינות את הצינורית לברונצ'וס ככל האפשר.

השתמש מלקחיים כדי לדחוס את הקיר bronchiole סביב canula, באופן אידיאלי מהדק כל עורק ריאתי סמוך באותו זמן, כדי לאטום את הסימפונות סביב canula ולהשתמש מלחציים כירורגיים כדי למנוע כל דרכי הנשימה הנוספים, כדי למנוע דליפה התעוררה. לאחר מכן, השתמש בממטרים כדי להרים את רקמת הריאה מצלחת התרבות, ולהשתמש במזרק כדי לספק באופן ידני את agarose דרך canula, לא מהר יותר מ 0.3 מיליליטר לשנייה. כאשר רקמת הריאה מתמלאת לחלוטין מבלי לנפח יתר על המידה את הרקמה, מיד להסיר את canula ומהדק את הסמפונוס.

להטביע את הרקמה במדיום תרבות בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי להקל על התגבשות אגרוז, ולחזור על הליך מילוי אגרוז עבור כל פתחי סימפונות נוספים. לאחר מכן, לאחסן את חלקי רקמת הריאה מלא אגוארוס בארבע מעלות צלזיוס בינוני עד חיתוך. עבור חיתוך ריאות מדויק לחתוך, לזהות את האזורים מלאים אגרוז מוצק בתוך רקמת הריאה, כי לא לקרוס כאשר לחוץ בעדינות עם פינצטה על החלק התחתון של צלחת תרבות התא.

בלו בלוק 1 עד 1.5 סנטימטר מעוקב של אזור מלא מוצק עם צד אחד עדיין מכוסה pleura, ולהשתמש בדבק cyanoacrylate לחבר את הצד הרבים של כל בלוק רקמה למחזיק רטט. פורסים את כל הדרך דרך בלוק הרקמה הארוך, עד שרק שניים עד שלושה מילומטרים של רקמה נשארים ללא הרקמה. שימוש במטסים להעברת כל קטע 500 מיקרומטר לתוך באר אחת של צלחת 12 באר המכילה מדיום טיפוח, כפי שהם מתקבלים.

כאשר כל הרקמה כבר חתוכה, להעביר את הדגימות מכל באר לתוך מנות תרבות בודדות עשרה סנטימטרים ולמקם אגרוף ביופסיה ארבעה מילימטר orthogonally על פני השטח העליונים של פרוסת ריאות לחתוך דיוק. לאחר מכן, הזזת האגרוף בסיבובים בכיוון השעון ונגד כיוון השעון, להשיג אגרופים רקמה של דגימת הריאות. הצבת כל אגרוף במדיום תרבות תא טרי בארות בודדות של צלחת 96 היטב כפי שהם מתקבלים.

כאשר כל אגרופי הרקמה הושגו, מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התא עד חמישה ימים. Immunolabeling של פיברונקין בגרעיני התא באמצעות Immunofluorescence בתרבות רקמת ריאה 3-D אנושי מאפשר הדמיה של מבנה מכתשי השתמר ex vivo. הטיפול בפרוסת הריאות האנושית חתוכה בקוקטייל ציטוקיני פרופיברוטי למשך 48 שעות וכתוצאה מכך שינויים דמויי פיברוזיס בתרבות הרקמה תלת-מימדית בריאה האנושית, כולל אינדוקציה משמעותית של רכיבי מטריצה חוץ-תאית רלוונטיים לפיברוזיס, קולגן מסוג אחד וגנים פיברונאקטינים.

בנוסף, רמות החלבון של סמן mesenchymal vimentin הם מוסדר בשלושה מתוך ארבעה חולים לאחר טיפול של 3-D רקמת הריאה ניקובים. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו ניתוח RNA על ידי PCR כמותי בזמן אמת, או ניתוח חלבון על ידי סופג מערבי, ניתן לבצע כדי להעריך ביטוי גנים וחלבון בהתאמה בתוך הרקמה. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך למחקרים בתחום הפולמונולוגיה הניסיונית, להבלטת ביולוגיית הריאות וכן לביצוע מחקרים טוקסיקולוגיים ופרמקולוגיים בדגימות רקמה אנושיות.

זכור כי רקמה אנושית חיה היא עלולה להיות מדביקה, כי אמצעי זהירות כגון שימוש בציוד מגן אישי ואחסון רקמות תקין, הובלה וטיפול בפסולת, תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליך זה