Этот метод позволяет исследование живой человеческой ткани в его естественной 3D структуры и состава для перевода ключевых лабораторных выводов в потенциальных методов лечения. Этот метод специально позволяет поколению культур тканей из хирургически пересекретой или эксплантированной ткани легких человека для визуализации отдельных умерших образцов легочной ткани пациента. Безболезненные ткани легких могут быть использованы в качестве культуры 3D тканей для моделирования легочных заболеваний ex vivo, позволяющих анализ ранних патомеханизмов в высоком спатиотемпоральной резолюции.
Начните с размещения ресектированного образца легких в 15 миллилитров среды выращивания в стерильной 15-сантиметровой культуре блюдо и стерильный металлический лоток, покрытый салфеткой, и заполнить 30 миллилитров шприц с 42 градусов по Цельсию низкой плавильной точки агарозы. Снимите обтуратор с периферического венозного катетера и прикрепите катетер к 30 миллилитровому шприцу. Определите бронх диаметром от 0,5 до 3 миллиметров в вентиляциольной ткани в нетронутой части ткани и аккуратно вставьте канулу в бронхус, насколько это возможно.
Используйте щипцы для сжатия стенки бронхиола вокруг канулы, в идеале зажимая любые прилегающие легочной артерии в то же время, чтобы запечатать бронх вокруг канулы и использовать хирургический зажим, чтобы закрыть любые другие дополнительные дыхательные пути, чтобы предотвратить утечку агарозы. Далее, используйте типсы, чтобы поднять легочную ткань из культуры блюдо, и использовать шприц вручную доставить агарозу через канулу, не быстрее, чем 0,3 миллилитров в секунду. Когда легочная ткань заполнена полностью без чрезмерного надувания ткани, немедленно удалить канулу и зажим бронхов.
Погрузите ткань в культурную среду при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут, чтобы облегчить затвердевание агарозы, и повторите процедуру заполнения агарозы для любых дополнительных отверстий бронхиола. Затем храните заполненные агарозой участки легочной ткани в четырех градусах по Цельсию до нарезки. Для точного разрезания легких нарезки, определить прочно агарозы заполненные регионы в легочной ткани, которые не разрушаются при мягком нажатии пинцетом против нижней части клетки культуры блюдо.
Акциз от 1 до 1,5 кубических сантиметров блок прочно заполненной области с одной стороны по-прежнему покрыты плеврой, и использовать цианоакрилат клей, чтобы прикрепить множественной стороне каждого блока ткани вибромы держатель. Нарежьте весь путь через длинный блок ткани, пока только два-три милометра ткани остаются нелицеприятными. Использование типсов для передачи каждого 500-метрового сечения в один колодец двенадцати-хорошо пластины, содержащей культивирование среды, как они получены.
Когда все ткани были секционированы, передать образцы из каждого хорошо в отдельных десяти сантиметров культуры блюда и положение четыре миллиметра биопсии перфоратор ортогонально на верхнюю поверхность точного разреза легких ломтик. Затем, перемещая перфоратор по часовой стрелке и против часовой стрелки вращения, получить ткани ударов легких образца. Размещение каждого удара в свежей среде культуры клеток в отдельных колодцах 96-хорошо пластины, как они получены.
Когда все ткани удары были получены, поместите пластину в инкубатор культуры клеток на срок до пяти дней. Иммунолабелирование фибронектина в ядрах клеток с использованием иммунофторесценции в культурах 3-D легочной ткани человека позволяет получить изображение сохранившейся альвеолярной структуры ex vivo. Лечение человеческой точности сократить легких ломтик ударов с профибротической цитокинов коктейль в течение 48 часов приводит к фиброз-как изменения в человеческих легких 3-D культур ткани, в том числе значительное индукции фиброза соответствующих внеклеточных компонентов матрицы, коллагена типа один, и фибронектин генов.
Кроме того, уровни белка мезенхимального маркера виментина регулируются в трех из четырех пациентов после лечения 3-D легочной ткани культуры ударов. После этой процедуры, другие методы, такие как анализ РНК количественных ПЦР в режиме реального времени, или анализ белка западными blotting, могут быть выполнены для оценки экспрессии генов и белка соответственно в ткани. После его развития, этот метод проложил путь для исследований в области экспериментальной пульмонологии, для эксплантологии легких, а также для выполнения токсикологических и фармакологических исследований в образцах тканей человека.
Помните, что живые человеческие ткани потенциально инфекционные и что меры предосторожности, такие как использование личного защитного оборудования и надлежащего хранения тканей, транспортировки и обработки отходов, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры
