هذه الطريقة تسمح التحقيق في الأنسجة البشرية الحية في هيكل 3D الطبيعية وتكوين لترجمة النتائج المختبرية الرئيسية في العلاجات المحتملة. هذه التقنية تمكن على وجه التحديد جيل الثقافات الأنسجة من استئصالها جراحيا أو explanted أنسجة الرئة البشرية لتصور عينات الفردية المريض أنسجة الرئة المتوفى. يمكن استخدام أنسجة الرئة الخالية من الأمراض كثقافات أنسجة ثلاثية الأبعاد للأمراض الرئوية السابقة مما يتيح تحليل الميكانيكا الباثومية المبكرة في دقة اصمانية عالية.
تبدأ من خلال وضع عينة الرئة ا لم اقطت في 15 ملليلتر من المتوسطة زراعة في طبق ثقافة معقمة 15 سنتيمترا وعلبة معدنية معقمة مغطاة في ورقة الأنسجة، وملء حقنة 30 ملليلتر مع 42 درجة مئوية منخفضة ذوبان نقطة agarose. إزالة المُنْزع من القسطرة الوريدية الطرفية وإرفاق القسطرة بحقنة 30 ملليلتر. تحديد 0.5 إلى 3 ملليمتر القطر قصبة في أنسجة التهوية في قسم سليم من الأنسجة، وأدخل بلطف الكانولا في قصبات بقدر الإمكان.
استخدام ملقط لضغط جدار القصبات حول المظلة، وقط مثالي أي الشريان الرئوي المجاورة في نفس الوقت، لختم القصبات حول المظلة واستخدام المشبك الجراحي لocclude أي خطوط الهواء الإضافية الأخرى، لمنع تسرب agarose. بعد ذلك ، استخدم الملباب لرفع أنسجة الرئة من طبق الثقافة ، واستخدام الحقنة لتسليم الأذروز يدويًا من خلال الـ canula ، لا يزيد عن 0.3 ملليلتر في الثانية. عندما يتم تعبئة أنسجة الرئة تماما دون الإفراط في تضخيم الأنسجة، على الفور إزالة المظلة ومشابك القصبات.
غمر الأنسجة في الثقافة المتوسطة في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة لتسهيل صلابة agarose، وتكرار إجراء ملء agarose لأي فتحات إضافية bronchiole. ثم، قم بتخزين أقسام أنسجة الرئة المليئة بأكاروز في أربع درجات مئوية متوسطة حتى التقطيع. لدقة قطع تشريح الرئة، وتحديد المناطق المملوءة بقوة agarose داخل أنسجة الرئة، التي لا تنهار عندما ضغطت بلطف مع ملاقط ضد الجزء السفلي من طبق ثقافة الخلية.
مكوس كتلة 1 إلى 1.5 سنتيمتر مكعب من المنطقة المليء بقوة مع جانب واحد لا تزال مغطاة بالجنب، واستخدام الغراء سيانوكريلات لإرفاق الجانب الجمع من كل كتلة الأنسجة إلى حامل هزاز. شريحة الطريق كله من خلال كتلة الأنسجة الطويلة، حتى يتم ترك فقط اثنين إلى ثلاثة milometers من الأنسجة unsliced. باستخدام ملقط لنقل كل قسم 500 ميكرومتر في بئر واحد من اثني عشر بئرا لوحة تحتوي على زراعة المتوسطة، كما يتم الحصول عليها.
عندما تم تقسيم جميع الأنسجة، نقل العينات من كل بئر إلى أطباق ثقافة عشرة سنتيمترات الفردية ووضع خزعة أربعة ملليمتر اللكم متعمّد إلى السطح العلوي من شريحة الرئة قطع الدقة. ثم، تحريك اللكم في اتجاه عقارب الساعة وتناوب عكس عقارب الساعة، والحصول على اللكمات الأنسجة من عينة الرئة. وضع كل لكمة في ثقافة الخلية الطازجة المتوسطة في الآبار الفردية من لوحة 96-جيدا كما يتم الحصول عليها.
عندما تم الحصول على جميع اللكمات الأنسجة، ووضع لوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة تصل إلى خمسة أيام. يسمح علم المناعة في الخلايا الليفية في نواة الخلية باستخدام الفلورس المناعي في ثقافات أنسجة الرئة ثلاثية الأبعاد البشرية بتصوير الهيكل السنخي المحفوظ السابق. علاج الدقة البشرية قطع اللكمات شريحة الرئة مع كوكتيل السيتوكين profibrotic لمدة 48 ساعة النتائج في التغيرات الشبيهة بالتليف في الثقافات البشرية 3-D أنسجة الرئة, بما في ذلك التعريفي كبيرة من المكونات المصفوفة خارج الخلية ذات الصلة, الكولاجين نوع واحد, وجينات فيبرومينكتين.
بالإضافة إلى ذلك, مستويات البروتين من vimentin علامة mesenchymal يتم تنظيمها في ثلاثة من أصل أربعة مرضى بعد علاج اللكمات 3-D أنسجة الرئة. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تحليل الحمض النووي الريبي عن طريق PCR في الوقت الحقيقي الكمي، أو تحليل البروتين عن طريق النشاف الغربي، لتقييم التعبير الجيني والبروتيني على التوالي داخل الأنسجة. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للأبحاث في مجال علم الرئة التجريبي ، لـ explant lung biology وكذلك لإجراء دراسات سمية وأدائية في عينات الأنسجة البشرية.
تذكر أن الأنسجة البشرية الحية يحتمل أن تكون معائية وأن التدابير الوقائية مثل استخدام معدات الحماية الشخصية وتخزين الأنسجة المناسبة والنقل والمناولة النفايات، ينبغي اتخاذها دائما أثناء تنفيذ هذا الإجراء
