שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חילוף החומרים כגון, כיצד פעילות מטבולית משתנה במהלך תהליך ההזדקנות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא השימוש בקטע גוף שלם אשר יש נתונים הדומים מאוד למצב הטבעי והפיזיולוגי בהשוואה לבידוד המיטוכונדריאלי הקלאסי. להדגים את ההליך יהיו אנורופ ואניקה, סטודנטית לתואר שני במעבדה שלי.
כדי להתחיל את הפרוטוקול, הפעל את המכונה שעה אחת לפני תחילת הניסוי, כך שיש מספיק זמן להגיע לטמפרטורה הרצויה ולהישאר יציב. לאחר מכן, בהגדרת התוכנה, תחת מצב ניהול, בחר את אורך כיול המחסנית ואת הטמפרטורה הרצויה. לאחר מכן, הזן את הפרוטוקול הבא:בהתאם לעיצוב הניסיוני, הוסף שלבי הזרקה מיציאות A עד D לאחר שלב מדידה שנבחר.
כדי לבדוק את האיכות ואת קביעת OCR הבסיסי, להתאים את הפרוטוקול לפחות שלושה מחזורי מדידה לפני הגדרת הזרקת התרופה הראשונה באמצעות יציאה A.Pre-לכייל את המחסנית יום אחד, או לפחות ארבע שעות לפני הבדיקה, על ידי הוספת 1.0 מיליליטר של כיול לכל באר, והצב את מחסנית החיישן על גבי הצלחת. לכסות את המחסנית עם Parafilm אם הוא מתוכנן לחות במשך יותר מ 24 שעות כדי למנוע אידוי. אחסן את המחסנית ב 37 מעלות צלזיוס ללא CO2, לילה.
לאחר מכן, ודאו שהתרופות הניסיוניות מומסות ביסודיות במדיום טרי, בתוספת 2.5% גלוקוז. למדוד ולהתאים את ה- pH של פתרון התרופה ל- pH של הרכב בטמפרטורה הרצויה. פיפטה פתרון התרופה לתוך יציאת ההזרקה שהוקצתה לו.
לאחר מכן טען את המחסנית למכונה והתחל בכיול. התאימו מדיה טרייה בתוספת 2.5% גלוקוז ל-pH הרצוי בעזרת HCl רגיל אחד. לאחר מכן, להכין קופסת קרח ולה מניחים צלחת מתכת על הקרח.
פתח את חבילת טסיות העין. לטבול את הרשתות במדיה על ידי צלחת פטרי 16 מילימטר. לאסוף רשת אחת עם המוסיף ויש לי המוסיף לעמוד ליד המיקרוסקופ.
הוסף ירידה קטנה של מדיה לרשת המצורפת לתוספת. לאחר מכן, הרדמה את הזבובים על ידי הנחתם על צלחת מתכת קרה כקרח. באמצעות מדפים, לתפוס את הבטן של זבוב לטבול אותו בתקשורת בצלחת פטרי מתחת למיקרוסקופ.
באמצעות זוג מדפים שני, להסיר בעדינות את ראש הזבוב. מקם את הראש באמצע הרשת המחוברת לתוספת וודא שהראש שקוע במדיה. הסר נוזל מיותר לפני מרכך את הראשים, כדי למנוע לאבד את הראשים תוך הצבת אותם היטב.
כשיש 16 ראשים ברשת, מרכז אותם. באמצעות המוסיף, מקם את הרשת באר. ודאו שהראשים לכודים מתחת לרשת והוסיפו באיטיות 700 מיקרוליטרים של מדיה ועוד 2.5%.
ודא כי בארות ריקות, אשר משמשים רקע, מכילים גם רשת עם 700 microliters של המאגר בתוספת 2.5% גלוקוז. בדוק את בארות עבור בועות אוויר מתחת לרשתות דרך המיקרוסקופ. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה באמצעות פיפטה מילימטר אחד כדי להסיר את כל הבועות.
שמור את הראשים מרוכזים לקריאת זיהוי תווים אופטי (OCR) אמינה. לאחר מכן הוסיפו את הלוחית למכונה והתחלו את המדידה. בסוף הפרוטוקול, הסר את המחסנית.
ודא באופן חזותי שאין שאריות גלויות במילויי היציאות. לאחר מכן, להשליך את המחסנית ואת הצלחת אם הראשים לא ישמשו להפקת חלבון. זכור להסתכל על רמות החמצן וה- pH, על מנת לזהות בארות חריגות לפני הניתוח.
יתר על כן, חשוב לבחור את חישוב קצב צריכת החמצן המתאים, בהתבסס על רמות החמצן. בעת ביצוע הפרוטוקול, נצפתה כי רמות החמצן של ראשי אמצע החיים ירדו מהר יותר מראשי זבובים צעירים. כאשר טווח רמות החמצן דומה בין התנאים, עדיף להשתמש באלגוריתם AKOS כדי ליצור באופן אוטומטי את קצב צריכת החמצן, או OCR, אשר משקף באופן אמין את השינויים ברמת החמצן במהלך מדידה בין ראשי צעירים לעומת אמצע החיים.
התוספת של נתרן butyrate, או SB, מעכב KDAC, חולף משנה את הדינמיקה של רמות החמצן. בעוד פקדי הרכב מציגים רמות קבועות של חמצן במהלך הקרציות הראשונות והאחרונה, תוספת SB גורמת לירידה ניכרת וחולף של רמות החמצן בקרציות אלה. מכיוון שחישוב AKOS מתייחס לכל הקרציות ומתעלם ממדינה אנוקסית, הוא יוצר זיהוי תווים אופטי (OCR) מטעה, כפי שנצפה ברמות זיהוי תווים אופטי (OCR) הלא מנורמלות המבוססות על AKOS, אשר מראות שינוי מועט עם הזרקת היציאה A.The האלגוריתם הקבוע, אשר מודלים קרובים יותר ומזכיר את OCR ושינויים ברמת החמצן, מגלה OCR מוגברת על טיפול SB.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לעבוד עם שני אנשים יחד על מנת להבטיח כמות קצרה יחסית של זמן להכין צלחת אחת. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות ביוכימיות אחרות, כגון כתם מערבי וספקטרומטריית מסה כדי לענות על שאלות הקשורות למנגנונים מולקולריים, למשל, אלה המתונים שינויים מטבוליים.
