שיטה זו נועדה לענות על שאלות מפתח בתחום הביוכימיה האנורגנית, על איך לשמור על פעילות אנזימים בחלבונים המכילים מתכות רגישות לחמצן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה עוזר לך לדמיין דרכים שבהן אתה יכול לשמור על המתכת של חלבון במצב מופחת שלה. בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יתקשו כי קשה לשמור על חומרים בריאגנטים להיות אנאירובי לחלוטין.
24 שעות לאחר גרימת ביטוי חלבון, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, ו resuspend גלולת התא החיידקי ב 20 מיליליטר של מאגר עמודת amylose לכל 1.5 ליטר של צמיחה. מוסיפים מיליגרם אחד של lysozyme להשעיית התא, ומערבבים את התאים במשך 20 דקות על קרח. בסוף הדגירה, lyse פתרון התא resuspended באמצעות הומוגניזציה בלחץ גבוה עם שלושה עד חמישה עובר בערך 15, 000 psi, ולהעביר את החלבון לצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר.
לשטוף את מרחב הראש עם חנקן במשך דקה אחת, צנטריפוגה התא ליסאט כדי להסיר את הפסולת מסיסים. מעבירים את העל-טבעי לצינור אחד של 50 מיליליטר לפחות, ומכסים את ה"ליזאט" במ מחיצת גומי. באמצעות מחט 20-מד, לאט בועה גז חנקן דרך הפתרון במשך שתי דקות כדי לעקור את החמצן.
לאחר מכן, לעטוף את מחיצה עם סרט פרפין, לאבטח את Parafilm עם חוט נחושת, ולמקם את supernatant לתוך תא הכפפות עם חומרי העמוד. כאשר הממס נמצא ממש מעל מיטת הרף, בעמוד אמילוס שהוכן בעבר, לטעון 50 מיליליטר של חלבון על גבי העמוד, איסוף זרימה דרך שברים חמישה מיליליטר תחת חנקן בלחץ בינוני בערך חמישה מיליליטר לדקה. כאשר כל הזרימה-דרך כבר eluted, לשטוף את העמודה עם עוד שלושה כרכים עמודות של מאגר עמודה amylose.
הוסף חמישה קורות חיים של מאגר אלוטיון, ולאחר מכן לאסוף באופן ידני שברים שלושה מיליליטר במבחנות זכוכית תחת חנקן בלחץ בינוני. בדוק את הפתרונות לנוכחות חמצן עם אמוניום גופרתי ברזלי ודיתיותריתול. הפתרון יהפוך לכחול כהה או שחור אם קיים חמצן, כמו הצינור מימין.
נוכחות של חמצן תגרום חלבון מטוהר עם פעילות קטליטית נמוכה. פתרונות עם כמות חמצן מינימלית יהיו צבע שקוף לבנדר או כחול בהיר, כמו הצינור בצד שמאל. לאחר מכן, השתמש בקו חנקן חיצוני כדי ללחוץ על תא התאים המעורר, ולרכז את החלבון ל-50 מיליליטר במהירות ערבוב מתונה פעמיים.
לאחר מכן, לרכז את החלבון ל 10 מיליליטר, ולסנן את החלבון מרוכז באמצעות מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר-נקבובית. Aliquot 150 microliters של חלבון לתוך צינורות תגובת שרשרת פולימראז 200 מיקרוליטר בודדים. לאחר מכן, להסיר את aliquots כתרים מתיבת הכפפות להקפאת הבזק מיידית בחנקן נוזלי ואחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס.
להתפלת DesB, הוסיפו תחילה שלושה מיליליטר של ג'ל התפלה גס Sephadex G-25 לעמוד בורוזיליקט של תשעה מיליליטר, ושטפו את העמודה בשני כרכים של מאגר התפלה מנוכה. כאשר DesB יש להפשיר, לטעון את החלבון המטוהר על העמוד באמצעות תהליך מבוקר כבידה, ולהשליך את הזרימה דרך לפני eluting שלוש טיפות חלבון לתוך כל אחד 12 בקבוקונים, עם כחמישה מיליליטר של חיץ התפלה. כדי להכין את אלקטרודות החמצן, השתמש במספריים כדי לחתוך אחד בערך 1.5 אינץ 'ריבוע של נייר רווח, לחתוך משולשים קטנים על כל פנים של הריבוע, עם חריצים בפינות כדי לסייע בעטיפה של האלקטרודה.
הוסף חמש טיפות של תספורת כלוריד אשלגן 50% על חריץ אנודה כסף של האלקטרודה, ולחבר את הטיפות כך שהם יוצרים טבעת רציפה של פתרון. מוסיפים שתי טיפות של תספורת האשלגן כלורי לחלק העליון של אלקטרודה פלטינה, בזהירות למקם את נייר החלל על גבי אלקטרודה פלטינה, מחליק את נייר החלל כך שאין בועות אוויר. חותכים חתיכה באורך של כ-2 אינץ' של קרום S4 30m PTFE, וממקמים אותו על גבי נייר החלל, מסירים את קצות הממברנה כך שהם מיושרים עם הטבעת החיצונית של האלקטרודה.
באמצעות מוליך O-ring, לדחוף O-טבעת קטנה מעל האלקטרודה כדי לאבטח את נייר החלל ואת הממברנה על האלקטרודה, ולהציב O-ring גדול יותר על החריץ המעגלי של האלקטרודה, דואג כי אין קרום מתחת. החלק את התא העליון של האלקטרודה אל הבסיס, ולבורג את שני החלקים יחד. מניחים את האלקטרודה שהורכבה על בסיסה, ולחבר את האלקטרודה למערכת הניטור.
כדי לקבוע את קצב התגובה האנזימטית, השתמש באלקטרודה מסוג קלארק הרגישה לחמצן, עם אינטגרציה ממוחשבת כדי למדוד את צריכת החמצן באמצעות יחידת בקרת האלקטרודה. מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ טריס בנפח המתאים של המצע לתא האלקטרודה, ומערבבים את הפתרון במשך 10 שניות. לאחר 10 שניות, לאט לאט לאט לאט את התא עם הבוכנה, ולבורג את החלק העליון למטה.
השתמשו ברקמה נקייה כדי לספוג את הנוזל העודף שנעקרו מהתא, ולאפשר לאלקטרודה לצייד היכן שהיא יכולה לייצר מדידה יציבה של ריכוז החמצן בתסרון למשך דקה אחת לפחות. לאחר מכן, השתמש במזרק 10 מיקרוליטר הדוק לגז כדי להוסיף כמיקרוליטר אחד של אנזים לתא האלקטרודה דרך הבוכנה, ולאסוף את נתוני הקצב. כאשר נאסף כל הקצב לריכוז מצע נתון, השתמש בצינור פלסטיק המחובר לבקבוק ואקום זרוע צדדית כדי לרוקן את תא האלקטרודה, ושטף שוב ושוב את התא במשך ארבעה עד שישה מחזורים במים.
לאחר מכן, להגדיר את הפתרון באלקטרודה כפי שהוכח רק, באמצעות ריכוז מצע חדש. ניתוח ג'ל SDS-PAGE של שברים בודדים וטיהור מבנה חלבון מחייב DesB-maltose חושף את הבידוד של מוצר חלבון טהור, מלבד נוכחותם של מוצרי דומיין חלבון מחייב DesB ומלטוז שנבלבו זה מזה. לאחר כל המדידות הקינטיות נלקחו, הפעילות של DesB עם gallate, למשל, ניתן להשיג על ידי מדידת קצב צריכת החמצן בריכוזי גאלט משתנים.
לעומת זאת, שיעור העיכוב של DesB עם ארבעה nitrocatechol ניתן לקבוע על ידי התבוננות בירידה בקצב צריכת החמצן של DesB עם gallate מילימולר אחד בנוכחות ריכוזים משתנים של ארבעה nitrocatechol, המציין, למשל, כי ארבעה nitrocatechol מעכב את צריכת החמצן ובכך את תגובת DesB. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לחקר אנזימי dioxygenase תלוי ברזל, זה יכול להיות מיושם על מערכות אחרות, כגון metalloenzymes אחרים. אל תשכח כי עבודה בתוך תא כפפות יכול להיות מאתגר, אז לדאוג לא למהר בעת ביצוע טכניקה זו.
