הבידודים של אוכלוסיות אמיתיות של תאים היפוך apoptotic כבר בעיה בעבר, אשר מגביל מאוד את ההבנה שלנו על ההשלכות של היפוך אפופטוזיס. פרוטוקול זה מאפשר לנו ליצור אוכלוסיות טהורות יותר של תאים היפוך אפטוטי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי החומרים והציוד בשימוש זמינים נרחב במוסדות שונים.
טכניקה זו ישימה בקלות עבור בידוד אוכלוסיות טהורות יותר של תאים שעברו היפוך של אפופטוזיס. כפי שדווח בעבר, תאים נורמליים יכולים גם לעבור היפוך אפופטוזיס, כי מלבד תאים סרטניים בשד, תאי כימותרפיה שונים, כמו גם תאים נורמליים, ניתן להתחיל ואת הגירויים apoptotic שונים ניתן להשתמש. מכיוון תא היפוך עברו אפופטוזיס ומיון מהיר, שיעור ההחלמה הוא בדרך כלל נמוך.
מספר תא התחלתי גדול יותר הוא רקומביננטי כדי להגדיל את התשואה הסופית. בתור התחלה, תרבות MCF-7, MDA-MB-231, התחלה, תרבות MCF-7, MDA-MB-231, ותאי T47D, על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, לשטוף את התאים עם PBS פעמיים, ולאחר מכן להוסיף שני מיליליטר של 0.05 אחוז טריפסין-EDTA של 0.05 אחוז trypsin-EDTA ל MCF-7, ותאי מד"א-MB-231, לתאי MCF-7 ו-MDA-MB-231, ושני מיליליטר של 0.25 אחוז טריפסין-EDTA ושני מיליליטר של 0.25 אחוז טריפסין-EDTA לתאי T47D.
לתאי T47D. תרבו את התאים במשך חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס, באינקובטור של חמישה אחוזים של תאים דו-חמצניים. בעוד התאים דגירה, לבדוק את הניתוק של התאים עם מיקרוסקופ כדי למנוע עיכול יתר על ידי טריפסין-EDTA.
כאשר יותר מ-90 אחוז מהתאים מתנתקה, מוסיפים חמישה מיליליטר של מדיום RPMI שהושלם לצלחת, ומציפים אותו על פני שכבת התא מספר פעמים. לאחר מכן, להעביר את התאים ל 15 צינורות חרוט מיליליטר, וצנטריפוגה. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את כדורי עם חיץ FACS בצינורות מיקרו-צנטריפוגה 1.5 מיליליטר.
לאחר מכן, לחלק את התאים למספר צינורות. צנטריפוגה הצינורות שוב, ולהשליך את העל טבעי. לאחר מכן, הוסף בלוק Fc מדולל לדגימות.
הדגירה את הדגימות על קרח בחושך במשך 20 דקות, לפני צנטריפוגה הדגימות שוב. לאחר מכן, השלך את העל-טבעי. לאחר מכן, הוסיפו נוגדנים חד שבטיים חרפת פלואורוכרום נגד CD44 אנושי, ו-CD24, נגד CD44 אנושי ו-CD24, באחד עד 40, ואחד עד עשרה דילולים, בהתאמה, לקבוצות הכתמים הכפולים.
לפקדים החיוביים, הוסיפו נוגדני CD44 לפקדים החיוביים, הוסיפו נוגדני CD44 לתאי MDA-MB-231, לתאי MDA-MB-231 ונוגדני CD24 לתאי MCF-7 ונוגדני CD24 לתאי MCF-7 באחד עד 40, ואחד עד 10 דילולים, בהתאמה. הוסף PerCP-Cy5.5 עכבר IgG2b קאפה, הוסף PerCP-Cy5.5 עכבר IgG2b קאפה, מדולל ביחס של 1 עד 40 לתאים כבקרת איזוטופ עבור נוגדני CD44. לאחר מכן, להוסיף PE עכבר IgG2a קאפה, ולאחר מכן, להוסיף PE עכבר IgG2a קאפה, מדולל ביחס של 1 עד 10 לתאים כמו בקרת איזוטופ עבור נוגדנים CD24.
דגירה הדגימות בארבע מעלות צלזיוס בחושך במשך 30 דקות. ואז, צנטריפוגה הדגימות ב300 גרם אז, צנטריפוגה הדגימות ב300 G של וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי, ושטפו את גלולת הכדור פעמיים ב-500 מיקרו ליטרים של PBS.
לאחר מכן, חזור על הצנטריפוגה כפי שתואר קודם לכן. להשעות מחדש את גלולה על 0.5 מיליליטר של PBS, ולסנן את ההשעיה דרך רשת ניילון 40 מיקרומטר. לאחר מכן, הפעל את ההשעיה דרך סדרן תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות.
אסוף את התאים עם CD44 שלילי, וסמנים חיוביים CD24 בצינורות עגולים למטה המכילים מיליליטר אחד של מדיום אוסף. לאחר מכן, צנטריפוגה הצינורות, ולהשליך את supernatant. לאחר מכן, צלחת תאים סרטניים השד ממוין שאינו גזע בצלחת תרבות המכילה מדיום איסוף טרי לתרבות נוספת.
ראשית, השתמש staurosporine מילימולר אחד ב DMSO, כדי להכין 2.5 מיקרו-טוחנות staurosporine במדיום, על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הסר את מדיום התרבות מהתאים. לשטוף את התאים עם שני מיליליטר של PBS פעם אחת, לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של מדיום staurosporine לתאי MSF-7 במשך שש שעות, כדי לגרום אפופטוזיס, כאשר התאים הם 70 אחוז confluent.
לאחר מכן, להכין paclitaxel מילימולר אחד ב- DMSO. לאחר מכן, להוסיף 12.5 מיקרו ליטר לאחר מכן, להוסיף 12.5 מיקרו ליטר של paclitaxel 1 מילימול למדיום השלים של תאי T47D כדי לפצות על נפח סופי של 10 מיליליטר בצינור חרוט 15 מיליליטר. הסר את מדיום התרבות מהתאים, ולשטוף את התאים עם 2 מיליליטר של PBS.
לאחר מכן, מוסיפים את מדיום paclitaxel לתאים במשך 10 שעות כדי לגרום אפופטוזיס במשך 10 שעות כדי לגרום אפופטוזיס כאשר התאים מגיעים 70 אחוז confluency. לאחר מכן, להסיר את המדיום מהקבוצה MCF-7 שטופלו בממס, ולשטוף אותם עם שני מיליליטר של PBS. לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של 0.25 אחוז DMSO בינוני לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של 0.25 אחוז DMSO בינוני במשך שש שעות כמו בקרת ממס עבור staurosporine.
הסר את מדיום התרבות מהקבוצה T47D שטופלו בממס, ולשטוף את התאים עם שני מיליליטר של PBS. לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של 0.05 אחוז DMSO בינוני לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של 0.05 אחוז DMSO בינוני במשך 10 שעות כמו בקרת ממס עבור paclitaxel. לאחר מכן, להכתים את התא ולהטמיא אותם במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5 אחוז פחמן דו חמצני.
השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקל 60 פעמים כדי לבחון את השינויים המורפולוגיים של התאים המטופלים. הכתם הן את תאי MCF-7 ו- T47D שטופלו בממס והן את תאי MCF-7 ו- T47D שטופלו בממס בחושך במשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5 אחוז פחמן דו חמצני. באמצעות סדרן התאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות, לאסוף את התאים החיוביים מן הקבוצות שטופלו inducer בצינורות תחתונים עגולים המכילים מיליליטר אחד של מדיום האוסף.
לאחר מכן, צנטריפוגה הצינורות כפי שתואר קודם לכן, ולהשליך את העל-טבעי. לאסוף את התאים השליליים מן הקבוצות הממסים שטופלו צינורות עגולים עם מיליליטר אחד של מדיום אוסף. צנטריפוגה הצינורות, ולהשליך את העל-טבעי.
לאחר מכן, השהה מחדש את התאים ממוינים במדיום איסוף טרי. זרע את התאים צלחות תרבת רקמות 12 היטב, ולתרבת אותם במשך שבעה ימים עבור היפוך אפופטוזיס. לקצור MCF-7 הפוך הן בקבוצות inducer והן ממיסים מטופלים עם 0.05 אחוז טריפסין-EDTA.
עם 0.05 אחוז טריפסין-EDTA. לאחר מכן, לקצור את תאי T47D בשני inducer אז, לקצור את התאים T47D הן תמריץ וקבוצות שטופלו בממס עם 0.25 אחוז טריפסין-EDTA. הכתם את התאים בנוגדנים חד שבטיים נדנים פלואורוכרום נגד CD44 ו-CD24 אנושיים.
בעוד התאים מכתימים, הכן את פקדי האימוטיפ כפי שהודגם בעבר. לבסוף, הפעל את התאים על ציטומטר זרימה וזהה את אחוז התאים עם CD44 חיובי, וסמנים שליליים CD24. בפרוטוקול זה, המעבר מתאים סרטניים השד שאינו גזע לתאים דמויי CSC השד נצפתה.
בידוד של תאים סרטניים שאינם גזע נעשה לראשונה בתאי MCF-7. שינויים מורפולוגיים אופייניים נצפו לאחר הוספת מעוררי אפופטוטיקה, והתאים התאוששו אפופטוזיס עם מורפולוגיה דומה לאחר גמילה מסמים. התאים המופעלים על-ידי caspace תויגו וימוינו בהתבסס על עוצמת הפלואורסצנט הגבוהה יותר שלהם מאשר תאים ללא הפעלת caspace.
במהלך תהליך אינדוקציה apoptotic, הממס שימש כדי לשלול את האפשרות כי הליך העובדות, או הממס עצמו, היה הגורם למעבר. תאים המופעלים על-ידי Caspace בקבוצות הטיפול באפטומטי-inducer נמצאו כ-nexin 5 חיובי ו-PI שלילי, מה שמרמז על כך שהם היו תאים אפופטיים. התאים apoptotic נאספו ותרבית להתאוששות, בהשוואה לקבוצות הממסים שטופלו, ניתוח ציטומטרי זרימה הראה כי היו תאים המופיעים CD44 חיובי CD24 רבע שלילי באוכלוסיית התאים ההפוכים סרטן השד במקור.
איסור פרסום חשוב בניתוח זרימה ומיון תאים, שיש להכין שליטה מספקת במעבדות. מאז זה הליך היפוך אפופטוזיס במבחנה מבודד תאים סרטניים אפופטוטיים טהורים, ניסויים כגון נכסי vivo tumorigenesis יכול להתבצע כדי להבין את ההשלכות של היפוך אמיתי של התאים. טכניקה זו שופכת אור על הגורם להתדרדרות סרטן, ולכן, זה יכול להיחקר כדי למנוע את המופע מחדש של חולי סרטן.
אנא זכרו להגן על עצמכם כראוי בעת ביצוע ניסויים בתרבות התאים בהתאם לתקנות ה-biosafe-tier במוסד שלכם.
