אנו מודים לחברי המעבדה שלנו על הדיונים המועילים והתמיכה שלהם. המחקר שלנו על תאי גזע של סרטן השד ומיקרו-סביבה של הגידול ממומן על ידי מענקים ממכון המחקר של האגודה הקנדית לחקר הסרטן ומתוכנית סרטן השד של משרד ההגנה האמריקאי (מענק # BC160912). V.B. נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט מערבית (אוניברסיטת ווסטרן), וגם A.L.A. וגם V.B. נתמכים על ידי האגודה לסרטן השד של קנדה. C.L. נתמכת על ידי מלגת בוגר ונייר קנדה מממשלת קנדה.

למחברים אין מה לחשוף.

גרורות בסרטן השד ועמידות לטיפול הפכו לגורם מרכזי לתמותה בקרב נשים ברחבי העולם. קיומה של תת-אוכלוסייה של תאי גזע מסרטן השד (BCSCs) תורם לעלייה בגרורות 26,43,44,45,46 ולעמידות לטיפול21,47,48....

הבנת המנגנונים התאיים והמולקולריים של תאי גזע מסרטן השד האנושי (BCSCs) היא חיונית להתמודדות עם האתגרים המטופלים בטיפול בסרטן השד. הופעתו של מושג BCSC מתוארכת לתחילת המאהה-21, שם אוכלוסייה קטנה של תאי סרטן שד נמוכים מסוג CD44+CD24/Low נמצאה מסוגלת לייצר גידולים הטרוגניים בעכברים 1,2. לאחר מכן, נצפה כי תאי סרטן שד אנושיים עם פעילות אנזימטית גבוהה של אלדהיד דהידרוגנאז (ALDHגבוה) הציגו גם תכונות דומות דמויות תאי גזע3. BCSCs אלה מייצגים אוכלוסייה קטנה של תאים המסוגלים להתחדשות עצמית והתמיינות, ותורמים לאופי ההטרוגני של גידולים בתפזורת 1,2,3. ראיות מצטברות מצביעות על כך ששינויים במסלולי איתות משומרים אבולוציונית מניעים הישרדות ותחזוקה של BCSC 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . בנוסף, המיקרו-סביבה החיצונית של התא הוכחה כממלאת תפקיד מרכזי בהכתבת פונקציות BCSC שונות15,16,17. מסלולים מולקולריים אלה והגורמים החיצוניים המווסתים את תפקוד BCSC תורמים להישנות סרטן השד, גרורות18 ופיתוח עמידות לטיפולים 19,20,21, כאשר הקיום השיורי של BCSCs לאחר הטיפול מציב אתגר גדול להישרדות הכוללת של חולות סרטן השד22,23 . לפיכך, הערכה פרה-קלינית של גורמים אלה חשובה מאוד לזיהוי טיפולים ממוקדי BCSC שיכולים להועיל להשגת תוצאות טיפול טובות יותר ולשיפור ההישרדות הכוללת בחולות סרטן השד.
מספר מודלים של קו תאי סרטן שד אנושיים במבחנה ומודלים של קסנוגרפט אנושי in vivo שימשו לאפיון BCSCs 24,25,26,27,28,29. היכולת של קווי תאים להתאכלס מחדש ברציפות לאחר כל מעבר עוקב הופכת אותם למערכת מודל אידיאלית לביצוע מחקרים מבוססי אומיקה ופרמקוגנומיה. עם זאת, קווי תאים לעתים קרובות אינם מצליחים לשחזר את ההטרוגניות שנצפתה בדגימות של מטופלים. לפיכך, חשוב להשלים את נתוני קו התא עם דגימות שמקורן בחולה. בידוד של BCSCs בצורתם הטהורה ביותר חשוב כדי לאפשר אפיון מפורט של BCSCs. השגת טוהר זה תלויה בבחירת סמנים פנוטיפיים ספציפיים ל- BCSCs. נכון לעכשיו, הפנוטיפ של תאי CD44+CD24הגבוהשל ALDH משמש בדרך כלל להבחנה ולבידוד של BCSCs אנושיים מאוכלוסיות תאי סרטן שד בתפזורת באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS) לטוהר מרבי1, 3,26. יתר על כן, ניתן להעריך את התכונות של BCSCs מבודדים כגון התחדשות עצמית, התפשטות והתמיינות באמצעות טכניקות in vitro ו- in vivo.
לדוגמה, ניתן להשתמש במבחנים ליצירת מושבות חוץ גופיות כדי להעריך את יכולתו של תא בודד לחדש את עצמו וליצור מושבה של 50 תאים או יותר בנוכחות תנאי טיפול שונים30. ניתן להשתמש במבחני ממוספרה גם כדי להעריך את פוטנציאל ההתחדשות העצמית של תאי סרטן השד בתנאים שאינם תלויים בעוגן. בדיקה זו מודדת את יכולתם של תאים בודדים ליצור ולגדול ככדורים (תערובת של BCSCs ושאינם BCSCs) בכל מעבר עוקב בתנאי תרבית ללא סרוםללא דבק 31. בנוסף, ניתן להשתמש במודלים של תרביות תלת-ממדיות (3D) כדי להעריך את תפקוד ה-BCSC, כולל אינטראקציות תא-תא ומטריצת תאים, אשר מסכמות מקרוב את המיקרו-סביבה in vivo ומאפשרות לחקור את הפעילות של טיפולים פוטנציאליים ממוקדי BCSC32. למרות היישומים המגוונים של מודלים במבחנה, קשה למדל את המורכבות של תנאי in vivo באמצעות מבחני in vitro בלבד. ניתן להתגבר על אתגר זה על ידי שימוש במודלים של xenograft עכבר כדי להעריך את התנהגות BCSC in vivo. בפרט, מודלים אלה משמשים כמערכת אידיאלית להערכת גרורות של סרטן השד33, חקירת אינטראקציות עם המיקרו-סביבה במהלך התקדמות המחלה 34, הדמיה in vivo 35, ולניבוי רעילות ויעילות ספציפיות למטופל של חומרים אנטי-סרטניים34.
פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט לבידוד של CD44+CD24- BCSCsגבוהיםשל ALDH אנושי בטוהר מרבי מאוכלוסיות גדולות של תאי סרטן שד הטרוגניים. אנו מספקים גם תיאור מפורט של שלוש טכניקות in vitro (בדיקת יצירת מושבה, בדיקת ממוספרה ומודל תרבית תלת-ממדית) ובדיקת קסנוגרפט גידול in vivo שניתן להשתמש בה כדי להעריך פונקציות שונות של BCSCs. שיטות אלה יתאימו לשימוש על ידי חוקרים המעוניינים לבודד ולאפיין BCSCs מקווי תאי סרטן שד אנושיים או מתאי סרטן שד שמקורם בחולה ראשוני ורקמת הגידול לצורך הבנת הביולוגיה של BCSC ו/או חקירת טיפולים חדשניים המכוונים ל-BCSC.

<table><tbody><tr><td>7-Aminoactinomycin D (7AAD)</td><td>BD</td><td>51-68981E</td><td>suggested: 0.25 &amp;micro;g/1x10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; cells</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher</td><td>A18-1</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyde dehydrogenase (ALDH) substrate</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td>Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer&#039;s instructions for ALDH substrate preparation</td></tr><tr><td>Basement membrane extract (BME)</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Sold under the commercial name Matrigel</td></tr><tr><td>Cell culture plates: 6 well</td><td>Corning</td><td>877218</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture plates: 60mm</td><td>Corning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture plates: 96-well ultra low attachment</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer: 40 micron</td><td>BD</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Collagen</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7001</td><td>Prepare 1:30 dilution of 3 mg/mL collagen in PBS</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma</td><td>11088807001</td><td>1x</td></tr><tr><td>Conical tubes: 50 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>05-539-7</td><td></td></tr><tr><td>Crystal violet</td><td>Sigma</td><td>C6158</td><td>Use 0.05% crystal violet solution in water for staining</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7913</td><td>5U/mL</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>D5052</td><td>0.1 mg/mL final concentration</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Avantor Seradigm Lifescience</td><td>97068-085</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Flow tubes: 5ml</td><td>BD</td><td>352063</td><td>Polypropylene round-bottom tubes</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>84124</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-Human CD24 antibody</td><td>BD</td><td>561646</td><td>R-phycoerythrin and Cyanine dye conjugated Clone: ML5</td></tr><tr><td>mouse anti-Human CD44 antibody</td><td>BD</td><td>555479</td><td>R-phycoerythrin conjugated, Clone: G44-26</td></tr><tr><td>N,N-diethylaminobenzaldehyde (DEAB)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td>Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer&#039;s instructions DEAB preparation</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wisent Inc</td><td>311-425-CL</td><td>1x, Without calcium and magnesium</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mammosphere Media Composition&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-44</td><td>1x</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Bioshop</td><td>ALB003</td><td>04%</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>16634</td><td>5 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3D Organoid Media Composition&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A8301</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-44</td><td>1x</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>1x</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>N-acetylcysteine</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>Neuregulin &amp;beta;1</td><td>Peprotech</td><td>100-03</td><td>5 nM</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>R-spondin3</td><td>R&amp;amp;D</td><td>3500</td><td>250 ng/mL</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma</td><td>S7067</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>5 &amp;micro;M</td></tr></tbody></table>

isolation and functional assessment of human breast cancer stem cells from cell and tissue samples

תאי גזע של סרטן השד (BCSCs) הם תאים סרטניים בעלי מאפיינים תורשתיים או נרכשים דמויי תאי גזע. למרות התדירות הנמוכה שלהם, הם תורמים עיקריים להתחלת סרטן השד, הישנות, גרורות ועמידות לטיפול. חובה להבין את הביולוגיה של תאי גזע מסרטן השד על מנת לזהות מטרות טיפוליות חדשניות לטיפול בסרטן השד. תאי גזע של סרטן השד מבודדים ומאופיינים על סמך ביטוי של סמני פני שטח ייחודיים של תאים כגון CD44, CD24 ופעילות אנזימטית של אלדהיד דהידרוגנאז (ALDH). תאי CD44+CD24גבוהיםאלה של ALDH מהווים את אוכלוסיית ה-BCSC וניתן לבודד אותם באמצעות מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנציה (FACS) לצורך מחקרים פונקציונליים במורד הזרם. בהתאם לשאלה המדעית, ניתן להשתמש בשיטות in vitro ו- in vivo שונות כדי להעריך את המאפיינים הפונקציונליים של BCSCs. כאן, אנו מספקים פרוטוקול ניסיוני מפורט לבידוד BCSCs אנושיים הן מאוכלוסיות הטרוגניות של תאי סרטן השד והן מרקמת גידול ראשונית המתקבלת מחולות סרטן השד. בנוסף, אנו מדגישים את הבדיקות הפונקציונליות in vitro ו- in vivo במורד הזרם, כולל מבחנים ליצירת מושבה, מבחני ממוספרה, מודלים של תרביות תלת-ממדיות ומבחני xenograft של גידולים שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את תפקוד BCSC.

הפרוטוקול המתואר מאפשר בידוד של BCSCs אנושיים מאוכלוסייה הטרוגנית של תאי סרטן השד, בין אם מקווי תאים או מרקמת גידול מנותקת. עבור כל קו תאים נתון או דגימת רקמה, חיוני ליצור תרחיף חד-תאי אחיד כדי לבודד BCSCs בטוהר מרבי, שכן זיהום אוכלוסיות שאינן BCSC עלול לגרום לתגובות תאיות משתנות, במיוחד אם מטרת המ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples at JoVE.com

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

פרוטוקול ניסיוני זה מתאר את הבידוד של BCSCs מדגימות תאים ורקמות של סרטן השד, כמו גם את מבחני in vitro ו - in vivo שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את הפנוטיפ והתפקוד של BCSC.

בידוד והערכה תפקודית של תאי גזע מסרטן השד האנושי מדגימות תאים ורקמות

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

isolation-functional-assessment-human-breast-cancer-stem-cells-from

Research

JoVE Journal

Cancer Research

4.4K Views.  London Regional Cancer Program. פרוטוקול ניסיוני זה מתאר את הבידוד של BCSCs מדגימות תאים ורקמות של סרטן השד, כמו גם את מבחני in vitro ו - in vivo שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את הפנוטיפ והתפקוד של BCSC.

Video: Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains poor when metastasis has occurred. The Cancer Stem Cell (CSC) theory holds that there is a subset of tumor cells within the tumor that have stem-like characteristics, including the capacity to maintain the tumor and to resist multidrug chemotherapy. Therefore, a better understanding of OS biology and pathogenesis is needed in order to advance the development of targeted therapies to eradicate this particular subset and to reduce morbidity and mortality among patients. Isolating CSCs, establishing cell cultures of CSCs, and studying their biology are important steps to improving our understanding of OS biology and pathogenesis. The establishment of human-derived OS-CSCs from biopsies of OS has been made possible using several methods, including the capacity to create 3-dimensional stem cell cultures under nonadherent conditions. Under these conditions, CSCs are able to create spherical floating colonies formed by daughter stem cells; these colonies are termed &#34;cellular spheres&#34;. Here, we describe a method to establish CSC cultures from primary cell cultures of conventional OS obtained from OS biopsies. We clearly describe the several passages required to isolate and characterize CSCs.

The presence of cancer stem cells (CSCs) in bone sarcomas has recently been linked to their pathogenesis. In this article, we present the isolation of CSCs from primary cell cultures obtained from human biopsies of conventional osteosarcoma (OS) using the ability of CSCs to grow under nonadherent conditions.

הקמת סרטן גזע תא תרבויות מן האדם הקונבנציונלי אוסטאוסרקומה

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an anti-inflammatory drug to standard cancer regiments may improve patient outcome. One such drug, aspirin (acetylsalicylic acid, ASA), has been explored for cancer chemoprevention and anti-tumor activity. Besides inhibiting the cyclooxygenase 2-prostaglandin axis, ASA&#39;s anti-cancer activities have also been attributed to nuclear factor &#312;B (NF&#312;B) inhibition. Because prolonged ASA use may cause gastrointestinal toxicity, a prodrug strategy has been implemented successfully. In this prodrug design the carboxylic acid of ASA is masked and additional pharmacophores are incorporated.
This protocol describes how we synthesized an aspirin-fumarate prodrug, GTCpFE, and characterized its inhibition of the NF&#312;B pathway in breast cancer cells and attenuation of the cancer stem-like properties, an important NF&#312;B-dependent phenotype. GTCpFE effectively inhibits the NF&#312;B pathway in breast cancer cell lines whereas ASA lacks any inhibitory activity, indicating that adding fumarate to ASA structure significantly contributes to its activity. In addition, GTCpFE shows significant anti-cancer stem cell activity by blocking mammosphere formation and attenuating the cancer stem cell associated CD44+CD24- immunophenotype. These results establish a viable strategy to develop improved anti-inflammatory drugs for chemoprevention and cancer therapy.

This procedure will demonstrate how we synthesized and characterized the anti-NF&#954;B and anti-cancer stem cell activity of an aspirin-fumarate prodrug.

סינתזה ואפיון של prodrug אספירין-fumarate המעכבת תאי גזע סרטניים פעילות השד NFκB

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

עיבוד של רקמת גידול במוח העיקרית למבחנים בתאי גזע וזרימת מיון

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Medicine

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

קבלת סרטן גזע כדורים מגינקולוגית סרטן השד גידולים

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident stem cells are relatively quiescent with niche restraints in adult tissues, they enter the cell cycle in anchor-free three-dimensional (3D) culture and undergo both symmetric and asymmetric cell division, giving rise to both stem and progenitor cells. The latter proliferate rapidly and are the major cell population at various stages of lineage commitment, forming heterogeneous spheroids. Using primary normal human prostate epithelial cells (HPrEC), a spheroid-based, label-retention assay was developed that permits the identification and functional isolation of the spheroid-initiating stem cells at a single cell resolution.
HPrEC or cell lines are two-dimensionally (2D) cultured with BrdU for 10 days to permit its incorporation into the DNA of all dividing cells, including self-renewing stem cells. Wash out commences upon transfer to the 3D culture for 5 days, during which stem cells self-renew through asymmetric division and initiate spheroid formation. While relatively quiescent daughter stem cells retain BrdU-labeled parental DNA, the daughter progenitors rapidly proliferate, losing the BrdU label. BrdU can be substituted with CFSE or Far Red pro-dyes, which permit live stem cell isolation by FACS. Stem cell characteristics are confirmed by in vitro spheroid formation, in vivo tissue regeneration assays, and by documenting their symmetric/asymmetric cell divisions. The isolated label-retaining stem cells can be rigorously interrogated by downstream molecular and biologic studies, including RNA-seq, ChIP-seq, single cell capture, metabolic activity, proteome profiling, immunocytochemistry, organoid formation, and in vivo tissue regeneration. Importantly, this marker-free functional stem cell isolation approach identifies stem-like cells from fresh cancer specimens and cancer cell lines from multiple organs, suggesting wide applicability. It can be used to identify cancer stem-like cell biomarkers, screen pharmaceuticals targeting cancer stem-like cells, and discover novel therapeutic targets in cancers.

Using human primary prostate epithelial cells, we report a novel biomarker-free method of functional characterization of stem-like cells by a spheroid-based label-retention assay. A step-by-step protocol is described for BrdU, CFSE, or Far Red 2D cell labeling; three-dimensional spheroid formation; label-retaining stem-like cell identification by immunocytochemistry; and isolation by FACS.

בידוד של תאים כמו גזע מתרבויות תלת ממדיות ספרואיד

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

תרבות מטופל נגזר סלולרי ובידוד של CD133<sup&gt; +</sup&gt; תאי גזע סרטני משוערים מלנומה

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

בידוד של תאי גזע סרטני מדגימות אדם סרטן הערמונית

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.

הערכה של מאפייני תא גזע בקרצינומה של תאי השחלות אדם באמצעות Multi ומבחני Spheres מבוסס תא בודדים

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal and produce differentiated progeny1. These properties allow CSCs to recapitulate the original tumor when injected into immunocompromised mice. CSCs within an epithelial malignancy were first described in breast cancer and found to display specific cell surface antigen expression (CD44+CD24low/-)2. Since then, CSCs have been identified in an increasing number of other human malignancies using CD44 and CD24 as well as a number of other surface antigens. Physiologic properties, including aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity, have also been used to isolate CSCs from malignant tissues3-5.
Recently, we and others identified CSCs from pancreatic adenocarcinoma based on
ALDH activity and the expression of the cell surface antigens CD44 and CD24, and CD1336-8. These highly tumorigenic populations may or may not be overlapping and display other functions. We found that ALDH+ and CD44+CD24+ pancreatic CSCs are similarly tumorigenic, but ALDH+ cells are relatively more invasive8. In this protocol we describe a method to isolate viable pancreatic CSCs from low-passage human
xenografts9. Xenografted tumors are harvested from mice and made into a single-cell suspension. Tissue debris and dead cells are separated from live cells and then stained using antibodies against CD44 and CD24 and using the ALDEFLUOR reagent,
a fluorescent substrate of ALDH10. CSCs are then isolated by fluorescence activated cell sorting. Isolated CSCs can then be used for analytical or functional assays requiring viable cells.

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a number of malignancies. In this protocol we describe a flow cytometric method utilizing aldehyde dehydrogenase activity and CD44 and CD24 expression to isolate CSCs from human pancreatic adenocarcinoma xenografts. These viable cells can then be used in functional and analytical studies.

בידוד של בתאי גזע xenografts סרטן הלבלב האנושי

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Biology

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Assay גיבוש Mammosphere משד אדם סרטן רקמות וקווים סלולריים

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...