המחברים מודים לפרופ &#39;מ Dietel ודירק שומאכר לתמיכה בעבודה זו ובביקורתיות קרא את כתב היד. המחקר שיוביל לתוצאות אלה קבל תמיכה מההתחייבות החדשנית תרופות היוזמה המשותפת תחת הסכם המענק n ° 115234, משאבים של אשר מורכבים של תרומה כספית מהתכנית השביעית של האיחוד האירופי Framework (FP7/2007-2013) וחברות EFPIA &#39;ב תרומה נדיבה. עבודה זו נתמכה גם על ידי ברלינר Krebsgesellschaft (BKG).

המערך הכולל של הניסוי כולל הכנת תאים בודדים עיקריים מרקמת גידול, אפיון של תרבות התא העיקרי, דלדול פיברובלסטים ומיון תא המגנטי של CD133 + ו CD133 - תאים מלנומה מוצג באיור 1. 1. רכישת מדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו לאישור אתי לפני שתשקול את הצעדים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את צינור מ&quot;ל 50 עם סטרילי PBS בתוספת 1% ריכוז פניצילין-סטרפטומיצין סופי ולמסור לניתוח או לצוות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארגן את התחבורה מהירה של רקמת גידול מניתוח למעבדת תרבית תאים ב 4 ° C. </li></ol> 2. הכנת תאים יחידים מלנומה ראשוניים מרקמת גידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את כל השלבים תחת תנאים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני resecting גידול, צריך להכין את תערובת דיסוציאציה. לערבב 10 מ&quot;ל דיסוציאציה לרקמה 2-4 גרמו נדרש. התערובת יכולה לשמש immediately או מאוחסן ב10 aliquots מ&quot;ל ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסה המכילה נתרן כלורי mM 150. מערבב בעזרת מערבולת עד הפתרון הוא ברור. אם פתרון נחוץ עקר תסנין נתרן כלורי באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשקול את DNase ולהכין תמיסה המכילה 10 מיליליטר DNase אני בנתרן כלורי 150mm מ&quot;ג /. מערבב על ידי היפוך עד הפתרון הוא ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסה המכילה 100mg/ml collagenase הרביעי ב PBS. מערבב על ידי היפוך עד הפתרון הוא ברור. Aliquots של פתרון collagenase ניתן לאחסן ב -20 ° C למשך מספר חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת הניתוק עם ריכוז סופי של 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1 מ&quot;ג / המ&quot;ל collagenase IV ו 0.1 מ&quot;ג / מיליליטר DNase אני במדיום 263 קוונטית. מערבב בעזרת מערבולת. אופציונלי: בעת שימוש ברקמה מלנומה נגזרת מפתרון עור תוספת Amphotericin B לתערובת דיסוציאציה לריכוז סופי של 1.5 מיקרוגרם / המ&quot;ל Amphotericin B. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום החם reqכמויות uired של דיסוציאציה תמהיל, PBS ובינוני 263 קוונטית עד 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת גידול מניח על צלחת פטרי סטרילית. לשאוב פתרון מוגזם מהרקמות ולהוסיף תערובת דיסוציאציה 500 μl. ברר בגידול לחתיכות קטנות של 2-4 מ&quot;מ באמצעות אזמלים טריים, מעוקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 2-4 גרם טחון רקמת גידול לתוך צינור gentleMACS C המכיל תערובת 5 מ&quot;ל דיסוציאציה. יש לשטוף את צלחת פטרי עם תוספת 4.5 מ&quot;ל דיסוציאציה לערבב ולהוסיף קטעי רקמה שנותר לTube C gentleMACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור צינור C gentleMACS ולצרפה הפוכים על שרוול Dissociator gentleMACS. הפעל gentleMACS התכנית &quot;h_tumor_01&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק צינור C gentleMACS מdissociator ודגירת המדגם למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בסיבוב רציף באמצעות Rotator Tube MACSmix על מהירות ריצה הגבוהה ביותר (12 סל&quot;ד) או על ידי סיבוב הצינור באופן ידני כל 5 דקות כדי resuspend שברי רקמות מסולקות . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף צינור C gentleMACS הפוך על השרוול של tהוא gentleMACS Dissociator ולהפעיל gentleMACS התכנית &quot;h_tumor_02&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק צינור C gentleMACS מdissociator ודגירת המדגם למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בסיבוב רציף באמצעות Rotator Tube MACSmix על מהירות ריצה הגבוהה ביותר (12 סל&quot;ד) או על ידי סיבוב הצינור באופן ידני כל 5 דקות כדי resuspend שברי רקמות מסולקות . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף צינור C gentleMACS הפוך על שרוול Dissociator gentleMACS ולהפעיל gentleMACS התכנית &quot;h_tumor_03&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק צינור C gentleMACS מdissociator המדגם, resuspend ולהחיל השעית התא למסננת תא 70 מיקרומטר מונח על צינור מ&quot;ל 50. אם סתימה של המסנן מתרחשת, מערבבי השעית תא עם פילטר סטרילי עד ההשעיה המוחלטת עברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את מסננת עם תא בינוני 5 מ&quot;ל קוונטית 263. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: אם עדיין יש לך שברי רקמות שנותרו שבברי הסינון, resuspend במדיום וזרעם בתא תרבות דיס המתאים קוונטית 263ח. דגירת ברים על 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך מסננת תא ולסגור את צינור המ&quot;ל 50 עם השעית התא המעוכל. צנטריפוגה השעית תא למשך 5 דקות ב 300 XG ולהשליך supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: אם תא הגלולה נראית אדומה בשל כמות גבוהה של אריתרוציטים להכין פתרון 1x תא דם אדום תמוגה על ידי דילול 1:10 פתרון 10x במים מזוקקי פעמים, resuspend תא גלול ב 500 PBS μl ולהוסיף תמוגה 5 מ&quot;ל 1x תא דם אדום פתרון. מערבולת 5 שניות ולדגור בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 XG ולהשליך supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים סרטניים עם Quantum 263 וזרע התאים בתרבית תאי בקבוקון מתאים. תאים סרטניים תרבות ב 37 ° C ו 5% CO 2 ובאופן שגרתי תאי מעבר כאשר הם מגיעים למפגש 80%. </li></ol> 3. אפיון של תרבות הראשונית של תא ודלדול פיברובלסטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את תרבות תאים העיקרית phenotypically באמצעות microscope. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למסוק כמות קטנה (0.5x 10 6 תאים) של תרבית התאים הראשונית ולבצע RT-PCR עם פריימרים ל- neoplastic, מלנומה,-גזע ותאי גני stroma סלולריים סמן. הגנים החשובים ביותר לניתוח הם CD90 (סמן פיברובלסטים), Tyr (מלנומה / סמן מלנוציט), CD133 (סמן של תאי גזע לסרטן), CD83 (סמן לתאים דנדריטים בשלים) וגן משק (למשל HPRT או GAPDH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ניתוח מיקרוסקופי וביטוי גבוה של CD90 במהלך RT-PCR התגלו זיהום גבוה של מלנומה הראשונית עם התרבות fibroblasts, אתה צריך לרוקן את fibroblasts באמצעות microbeads Anti-fibroblasts ועמודות D מMiltenyi. </li></ol> 4. מיון מגנטי סלולרי של CD133 + ו CD133 - תאים מלנומה בעמודות LS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ MACS מכיל 2 mM EDTA ו5% FCS ב PBS. מיקס ידי חיץ היפוך ועקר תסנין באמצעות יחידת 0.22 מיקרומטר Steritop-GP סינון. חיץ צינה כדי 4-8 מעלות צלזיוסודגה לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חם Accutase, PBS ובינוני 263 קוונטית עד 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאי confluent 80% עם PBS. הוסף כמות מתאימה של Accutase ולדגור עד תאים להתנתק ממשטח התרבות. איסוף תאים בצינור 50 מ&quot;ל באמצעות מדיום 263 קוונטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר התא וחובצה את המספר הדרוש של תאים (על פי הפרוטוקול של Miltenyi מספר מרבי של 2x 10 9 תאים ניתן לטעון לטור LS. מספרים אופטימליים ספציפיים קו סלולרי צריכים להיות נחושים ויכולים להיות נמוכה באופן משמעותי.) למשך 5 דקות ב 300 XG ו4-8 ° C. לשאוב supernatant לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend מקסימום של 1x 10 8 תאים עם חיץ MACS μl 350 (למספרים סלולריים גבוהים יותר בהיקף של עד כל חיץ MACS הבא, FCR מגיב חסימה, וCD133/1-Biotin microbeads אנטי ביוטין כרכים בהתאם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מגיב FCR חסימת μl 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף CD133/1-Biotin μl 50. מערבב היטב בעזרת מערבולת ולדגור על 4-8 מעלות צלזיוס ואו 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים על ידי הוספת 10 חיץ וצנטריפוגה MACS מ&quot;ל למשך 5 דקות ב 300 XG ו4-8 ° C. לשאוב supernatant לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב כביסה (4.8) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלול עם חיץ MACS μl 400. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 microbeads μl אנטי ביוטין. מערבב היטב בעזרת מערבולת ולדגור על 4-8 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים מכין את מפריד MACS להפרדה המגנטית. צרף QuadroMACS למעמד מולטי מפריד MACS. הכנס את המספר הנדרש של עמודות LS עם כנפי העמודה לחזית בשדה המגנטי של QuadroMACS. הנח סינון לפני פרידה (עם רשת ניילון מיקרומטר 30) לכל עמודת LS וצינור איסוף מתאים (15 מ&quot;ל או 50 מ&quot;ל) מתחת לכל עמודה. הכן את המסנן ועמודה על ידי שטיפה עם חיץ 3 מ&quot;ל MACS. השלך זרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים על ידי הוספת 10 חיץ וצנטריפוגה MACS מ&quot;ל למשך 5 דקות ב 300 XG ו4-8 ° C. לשאוב supernatant לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים עם 500 μlMACS יבלום ולהחיל השעית תא על עמודת LS עם המסנן לפני פרידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים עם חיץ 3 מ&quot;ל MACS לעמודה. רק להוסיף מאגר חדש כאשר מאגר העמודה ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אספו שפכי סך מכילים CD133 ללא תווית - שבריר תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך את המסנן שלפני פרידה, להסיר עמודה מהמפריד ולמקם אותו על צינור איסוף מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל חיץ 5 מ&quot;ל MACS. מייד לשטוף את CD133 + התאים שכותרתו על ידי דחיפת הבוכנה בחוזקה לעמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגביר את טוהר החלק השלילי, יחול השעית תא על עמודת LS מתאזן חדשה הוכנסה בQuadroMACS. השפכים מכילים CD133 - החלקיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך עמודות. </li></ol>

<ol>
	<li>Garibyan, L., Fisher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+sunlight+causes+melanoma.">How sunlight causes melanoma.</a> Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).</li><li>Radovic-Kovacevic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+analysis+in+patients+with+cutaneous+malignant+melanoma.">Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma.</a> Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).</li><li>Lens, M. B., Eisen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+chemotherapy+in+the+treatment+of+malignant+melanoma.">Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma.</a> Expert Opin. Pharmacother. 4, 2205-2211 (2003).</li><li>Nashan, D., Muller, M. L., Grabbe, S., Wustlich, S., Enk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+therapy+of+disseminated+malignant+melanoma:+an+evidence-based+overview+of+the+state-of-the-art+in+daily+routine.">Systemic therapy of disseminated malignant melanoma: an evidence-based overview of the state-of-the-art in daily routine.</a> J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 21, 1305-1318 (2007).</li><li>Eigentler, T. K., Meier, F., Keilholz, U., Hauschild, A., Garbe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Der Onkologe. 16, 1160-1166 (2010).</li><li>Keilholz, U., Tilgen, W., Hohenberger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemische+Therapie+des+metastasierten+Melanoms:+Ergebnisse+randomisierter+Studien+der+letzten+zehn+Jahre.">Systemische Therapie des metastasierten Melanoms: Ergebnisse randomisierter Studien der letzten zehn Jahre.</a> Deutsches &#196;rzteblatt. 100, (2003).</li><li>Chapman, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+with+vemurafenib+in+melanoma+with+BRAF+V600E+mutation.">Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation.</a> N. Engl. J. Med. 364, 2507-2516 (2011).</li><li>Burdall, S. E., Hanby, A. M., Lansdown, M. R., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+cell+lines:+friend+or+foe.">Breast cancer cell lines: friend or foe.</a> Breast Cancer Research : BCR. 5, 89-95 (2003).</li><li>Osborne, C. K., Hobbs, K., Trent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+differences+among+MCF-7+human+breast+cancer+cell+lines+from+different+laboratories.">Biological differences among MCF-7 human breast cancer cell lines from different laboratories.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 9, 111-121 (1987).</li><li>Hiorns, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+RNA+expression+and+genomic+DNA+content+acquired+during+cell+culture.">Variation in RNA expression and genomic DNA content acquired during cell culture.</a> Br. J. Cancer. 90, 476-482 (2004).</li><li>Nelson-Rees, W. A., Daniels, D. W., Flandermeyer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-contamination+of+cells+in+culture.">Cross-contamination of cells in culture.</a> Science. 212, 446-452 (1981).</li><li>MacLeod, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+intraspecies+cross-contamination+of+human+tumor+cell+lines+arising+at+source.">Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source.</a> Int. J. Cancer. 83, 555-563 (1999).</li><li>Masters, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cancer+cell+lines:+fact+and+fantasy.">Human cancer cell lines: fact and fantasy.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 233-236 (2000).</li><li>Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Single-Cell+Suspensions+from+Mouse+Neural+Tissue.">Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue.</a> J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).</li><li>Zabierowski, S. E., Fukunaga-Kalabis, M., Li, L., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermis-derived+stem+cells:+a+source+of+epidermal+melanocytes+and+melanoma.">Dermis-derived stem cells: a source of epidermal melanocytes and melanoma.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 24, 422-429 (2011).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li><li>Ieta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+genetic+characteristics+of+tumor-initiating+cells+in+colon+cancer.">Biological and genetic characteristics of tumor-initiating cells in colon cancer.</a> Ann. Surg. Oncol. 15, 638-648 (2008).</li><li>Bertolini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+tumorigenic+lung+cancer+CD133++cells+display+stem-like+features+and+are+spared+by+cisplatin+treatment.">Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16281-16286 (2009).</li><li>Monzani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+contains+CD133+and+ABCG2+positive+cells+with+enhanced+tumourigenic+potential.">Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential.</a> Eur. J. Cancer. 43, 935-946 (2007).</li><li>Gedye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer/testis+antigens+can+be+immunological+targets+in+clonogenic+CD133++melanoma+cells.">Cancer/testis antigens can be immunological targets in clonogenic CD133+ melanoma cells.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. 58, 1635-1646 (2009).</li><li>Kobari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133++cell+selection+is+an+alternative+to+CD34++cell+selection+for+ex+vivo+expansion+of+hematopoietic+stem+cells.">CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells.</a> J. Hematother. Stem Cell Res. 10, 273-281 (2001).</li><li>Quirici, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+expansion+of+endothelial+cells+from+human+bone+marrow+CD133(+)+cells.">Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells.</a> Br. J. Haematol. 115, 186-194 (2001).</li><li>Pfenninger, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+is+not+present+on+neurogenic+astrocytes+in+the+adult+subventricular+zone,+but+on+embryonic+neural+stem+cells,+ependymal+cells,+and+glioblastoma+cells.">CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells.</a> Cancer Res. 67, 5727-5736 (2007).</li><li>Dubreuil, V., Marzesco, A. M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbody+and+primary+cilium+of+neural+progenitors+release+extracellular+membrane+particles+enriched+in+the+stem+cell+marker+prominin-1.">Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1.</a> J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).</li><li>Florek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+neural+and+hematopoietic+stem+cell+marker,+is+expressed+in+adult+human+differentiated+cells+and+certain+types+of+kidney+cancer.">a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer.</a> Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+Mouse+Lymph+Nodes+Using+Miltenyi+MACS+Purification.">Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification.</a> J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).</li><li>Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Immune+Cells+from+Primary+Tumors.">Isolation of Immune Cells from Primary Tumors.</a> J. Vis. Exp. (64), e3952 (2012).</li><li>Mollamohammadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+cryopreservation+method+for+feeder-free+dissociated+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+human+embryonic+stem+cells.">A simple and efficient cryopreservation method for feeder-free dissociated human induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells.</a> Hum. Reprod. 24, 2468-2476 (2009).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

על מנת להסיר זיהומים כדוריים אדומים מתא גלולת גידול מומלץ מאוד להשתמש בפתרון תמוגה תא הדם האדום מMiltenyi. היתרונות של lysing את אריתרוציטים מעל צנטריפוגה שיפוע צפיפות Ficoll המסורתית הם כי הוא מהיר יותר ופשוט יותר. יתר על כן, עם זיהומי Ficoll או תאי דם אדומים ואובדן של תאים סרטניים נמנעים. כשאתה מתבונן על הצמיחה של fibroblasts בתרבית התאים הראשוניות יש להסיר באופן מיידי שכן הם בדרך כלל לגדול יותר התאים הסרטניים כשמחכים יותר מדי זמן. בעת מיון תאים עם הטכניקה של MACS Miltenyi אנו ממליצים קצירת תאי enzymatically. באמצעות מגרד תא עלול להיות עדין יותר לתאים ואפיטופים פני השטח שלהם, אבל גם ייצור שברי תאים, אשר נקלטים nonspecifically לעמודות המקים ולסתום את העמודות. היתרונות של Accutase מעל הטיפול המסורתי טריפסין / EDTA כוללים לחץ מופחת תא, לאהדינג לכדאיות השתפרה וסיכון מזערי של החדרת סוכני adventitious לתוך תרביות תאים. הכנת Accutase אינו מכילה חלבוני יונקים או חיידקי רקומביננטי 28. כדי למנוע מיצוי של נוגדנים על פני התא וסימון תאים לא ספציפי אחד צריך לעבוד מהר, לשמור על תאים קרים ולהשתמש בפתרונות מראש מקוררים. יש לבצע את כל שלבי הדגירה ב2-8 מעלות צלזיוס, אך לא על קרח מאז טמפרטורות נמוכות עלולות להגביר את זמני דגירה. מספר התא האידיאלי לעמודה צריך להיקבע לכל תרבית תאים חדשים. במעבדה שלנו שעבדנו עם שורות תאים מלנומה שבו מספר תא מרבי של 10 7 תאי 4x יכול להיות מיושמות לכל עמודת LS. עמודות MS לא עובדות בכלל לסוג תא זה. לתאים גדולים מאוד Miltenyi מספק גם עמודות של תאים גדולות, שאמור להיות בשימוש במקום. חיץ MACS המומלץ על ידי Miltenyi מכיל 2 המ&quot;מ EDTA ו0.5% BSA ב PBS. אם ירד דרךbility של התאים לאחר מיון מגנטי הוא ציין, זה יכול להיות בגלל BSA ו / או EDTA במאגר. כדי לשפר BSA כדאיויות תא יכול להיות מוחלף על ידי 5% FCS, שהוא בדרך כלל נסבל טוב יותר מאשר BSA. EDTA במאגר MACS ניתן להשמיט להגדיל כדאיות של התא, אך תקטין את טוהר המיון לפי 2-3%. חיץ MACS נהג לאזן את העמודות אמור להיות מושלך. לא מומלץ לאסוף את התאים הממוינים בפתרון האיזון הזה שכן הוא יכול לגרום ניזק לתאים. במקום זאת, תאים ממוינים יש לאסוף בצינור שסופק עם התרבות בינונית כדי לייצב את התאים ישירות לאחר מיון. כדי למנוע סתימה של העמודות חשוב לקבל השעית תא בודד לפני המיון מגנטי על ידי העברת התאים דרך רשת ניילון מיקרומטר 30 (= מסננים טרום הפרדה). כדי להגביר את טוהר החלק השלילי, ריצה שנייה דרך עמודה טריה, מתאזנת LS או אפילו טור LD(= לדלדול של תאים) הוא הציע.

מלנומה ממאיר עורית הם הסוג הפחות שכיח, אך קטלני ביותר של סרטן העור. בשל שכיחות גוברת, ציון גבוה של ממאירות והפצה מהירה, מלנומה כעת חשבון עבור 75% מגידולי עור ממאירים הקשורים 1,2 מקרי מוות. מלבד כריתה כירורגית של גידול הראשוני, כימותרפיה, הקרנות, כימותרפיה ואימונותרפיה והטיפול החיסוני המשולב של מלנומה עם גרורות הן אסטרטגיות מדינה-of-the-art לטיפול במלנומה 3,4. עם זאת, מלנומה ממאיר מאופיין בתגובה ירודה לchemotherapeutics (5-12%) 5,6, ורק אלה 50-70% מחולים מלנומה הנושאים את המוטציה בגן יתרון V600E BRAF ממבטיח טיפולים ממוקדים חדשים כטיפול עם 7 vemurafenib כדי לשפר את ההישרדות כוללת, הבנה טובה יותר של המנגנונים של tumorigenesis לנומה היא זקוקות. ללמוד המנגנונים האלה בcommer העבר, המבוסס היטבשורות תאי cially זמינות היו בשימוש. גישות מאוחרות יותר כדי לחקור את האירועים המולקולריים של ייזום הסרטן וההתקדמות לנצל תרבויות עיקריות הנגזרות ישירות מרקמת גידול - יתרונות סעפת נושאי אסטרטגיה: החוקר יש שליטה מלאה של מטופל ובחירת רקמות. התאים שנדגמו נרכשו מרקמת גידול שנבחר במומחיות, דומה גידול עם כל ההטרוגניות שלה ומעקב נתונים של המטופל ופתולוגיות מפורטות זמינים כדי לאפשר את המאפיינים של התרבות שיש בהשוואה לאלו של גידול המקורי 8. בניגוד לכך, השימוש בשורות תאים הוקמו כמערכות מודל רלוונטיות בחקר הסרטן נדון שנוי במחלוקת. כבר בשנת 1987 אוסבורן ועמיתים תארו הבדלים ביולוגיים משמעותיים בין קווי MCF-7 אדם תאי סרטן שד ממעבדות שונות 9. חוסר יציבות זו נרחבת גנומי ווריאציה בביטוי RNA במהלך תת היה שותףnfirmed ידי Hiorns et al. וספק נתונים תומכים לראיות ששורות תאים אל להתפתח בתרבות, ובכך להחליש את הרלוונטיות הישירות של תרבויות מבוססות כמו מודלים של הסרטן האנושי 10. שיקול חשוב נוסף, אשר במידה רבה כבר התעלם במשך השנים, הוא הסיכון לזיהום או צמיחת יתר של תרבויות עם תאים שאינם קשורים &#39;שווא&#39;, שהיה מודגש ראשון מעל לפני עשרים שנה על ידי הוכחה כי מספר רב של שורות תאים היו מזוהם על ידי הלה תאים 8,11. הפירוש לא הנכון של נתונים משורות תאים &quot;לא צודק&quot; הגיע לאחרונה לאור בספרות שוב. באמצעות שילוב של פרופיל ה-DNA וציטוגנטיקה מולקולרית, מקלאוד et al. חשף כי מתוך 252 שורות תאים אנושיות חדשות המופקות מגידול הופקד באוסף הגרמני של מיקרואורגניזמים ותרביות תאים (DSMZ), כמעט 18% נמצאו intraspecies או interspecies צלב מזהמים-12,13. כדי להימנע מבעיות אלה ולעשות שימוש ביתרונות שהוזכרו לעיל, החלטנו להקים שורות תאים מלנומה, מעבר נמוך מגרורות כרותות טרי. טכנולוגיות הפרדה וניתוח סלולריים חזקות דורשות הכנות תא בודד שנוצרו תוך הגבלת מוות של תאים והרס של חלבוני שטח אופייניים. מכשיר benchtop לניתוק האוטומטי של רקמות להשעיות תא בודד הוא Dissociator gentleMACS מיוצר על ידי Miltenyi. כאשר משתמשים בשילוב עם gentleMACS C צינורות ופתרונות אופטימיזציה דיסוציאציה, ניתוק יעיל ועדין של רקמת גידול במערכת סגורה מושגת תוך שמירת אפיטופים אנטיגן וצמצום אובדן תא. המכשיר מציע תוכניות מותאמות, שנקבעו מראש עבור מגוון רחב של יישומים וערבויות הכנה סטנדרטית של השעיות תא בודד מרקמות מלנומה 14 ספציפיים. &lt;כיתת p = &quot;jove_content&quot;&gt; הדיווחים האחרונים עולים כי רוב גידולי נמל subpopulation קטן של תאי הגזע סרטני שנקראו (CSCS), אשר באופן בלעדי תערוכת ייזום-גידול עצמי וחידוש בקיבולת. זיהוי של תאי גזע מלנוציט לייצור בדרמיס של העור הוביל להשערה כי תאים אלה עשויים להיות המקור של תאי גזע סרטני (CSCS) מלנומה מאז חשיפה לקרינת UVA יכולה להכין תאים אלה לשינוי ממאיר 15. התוצאה של פגיעה גנטית שכזה תהיה תאים כי נמל שילוב של גידול ובמאפיינים של תאי גזע. אחד מסמני המפתח שהוצעו לייצג את תת האוכלוסיות של CSCS במלנומה הוא CD133 16-20. CD133 (הידוע גם כ1 Prominin), חבר של גליקופרוטאינים הטרנסממברני pentaspan, מתבטא בתאי גזע, תאי hematopoietic אנדותל, תאי גזע עצביים וגליה 21-23. ביטוי של CD133 מתואם עםחלוקה סימטרית תא 24, וepitope המסוכר של CD133 הוצגה להיות downregulated על התמיינות תא 25. לאחרונה, CD133 + תאים מלנומה, הראו לי התחדשות עצמית ויכולת גידול ייזום 19,20. כדי לחקור את תפקידו של CD133 + המשוער לנום CSCS, יש לנו שונים ומותאם למערכת המיון מגנטי הופעל הסלולרי (MACS) מMiltenyi יוטק להשיג אוכלוסיות מועשרות ובת הקיימא ביותר של CD133 + וCD133 - תאים. הפרדת תא חרוז מבוסס מגנטית מאפשרת גם סלקציה שלילית כפי שמוצג על ידי Matheu et al. 26 או סלקציה חיובית כפי שאנו מציגים כאן. במהלך סלקציה חיובית סוג מסוים יעד התא, למשל CD133 תאים לבטא, מתויג מגנטי עם microbeads, חלקיקים פאראמגנטי 50-nm שמצומד לנוגדנים הספציפיים ביותר נגדאנטיגן תא שטח מסוים. במהלך הפרדה, התאים שהכותרת מגנטית נשמרים בתוך העמודה בשדה המגנטי של המפריד, ואילו תאים ללא תווית לזרום. בעקבות צעדי כביסה, העמודה תוסר מהשדה המגנטי של המפריד, ואת תאי יעד eluted מהעמודה. עמודות MS LS או שימוש במהלך בחירת תוצאה החיובית בשברים של תאים שכותרת וללא תווית עם טוהר גבוה. מצד השני, עמודות LD, המשמשות לסלקציה שלילית, מביא לטוהר מעט נמוך יותר של החלק המסומן. בשל צפוף אריזה של המטריצה ​​שלהם את קצב הזרימה בעמודות אלה הוא נמוכים וכתוצאה מכך בסיכון גבוה יותר של תאים ללא תווית כדי להיות לכוד בעמודה. עמודות LD לכן יש להשתמש רק לדלדול חמור של תת אוכלוסיות של תאים לא רצויות. סלקציה חיובית יכולה להתבצע על ידי תיוג מגנטי ישיר (נוגדן מצמיד microbeads) או עקיף (דגירה עם microbeads בעקבות incubation עם הנוגדן הראשוני). Microbeads מקים מסוים זמינים לסלקציה החיובית של תאים מסוגים רבים של תאים סרטניים ראשוניים כמו ערמונית או מלנומה 27.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> מגיב </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Paa מעבדות GmbH </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> פתרון Amphotericin B 250 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​במי deionized </td><td> סיגמה אולדריץ, Inc </td><td> A2942-50 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> microbeads אנטי פיברובלסטים </td><td> Miltenyi BIOTEC GmbH </td><td> 130-050-601 </td><td></td></tr><tr><td> CD133 / 1 (W6B3C1) </td><td> Miltenyi BIOTEC GmbH </td><td> 130-092-395 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase IV </td><td> סיגמה אולדריץ, Inc </td><td> C5138 </td><td></td></tr><tr><td> אני DNase </td><td> Applichem GmbH </td><td> A3778.0050 </td><td></td></tr><tr><td> D-PBS בלי Ca, Mg </td><td> Paa מעבדות GmbH </td><td> H15-002 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> מייבשי ethylenediaminetetraacetic חומצת disodium מלח (EDTA) </td><td> סיגמה אולדריץ, Inc </td><td> E-7889 </td><td></td></tr><tr><td> FBS Superior </td><td> Biochrom </td><td> S0615 </td><td></td></tr><tr><td> CD133 אנושי ערכת מייקרו חרוז עקיף </td><td> Miltenyi BIOTEC GmbH </td><td> 130-091-895 </td><td> כולל: CD133 / 1 (AC133)-ביוטין, microbeads אנטי ביוטין ומגיב חסימת FCR </td></tr><tr><td> פניצילין סטרפטומיצין, נוזל (100x) </td><td> Invitrogen GmbH </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> קוונטי 263 </td><td> Paa מעבדות GmbH </td><td> U15-815 </td><td></td></tr><tr><td> פתרון תא דם אדום תמוגה (10x) </td><td> Miltenyi BIOTEC GmbH </td><td> 130-094-183 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ציוד </td></tr><tr> &lt;td&gt; סלולרית המסננת (70 מיקרומטר) </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS C צינורות </td><td> Miltenyi BIOTEC GmbH </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS dissociator </td><td> Miltenyi BIOTEC GmbH </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> מעמד רב מפריד MACS </td><td> Miltenyi BIOTEC GmbH </td><td> 130-042-303 </td><td></td></tr><tr><td> עמודות הפרדת מקים 25 עמודות LS </td><td> Miltenyi BIOTEC GmbH </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> Rotator Tube MACSmix </td><td> Miltenyi BIOTEC GmbH </td><td> 130-090-753 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> המרק KGaA </td><td> 567440-1 ק&quot;ג </td><td></td></tr><tr><td> מסננים מראש הפרדה </td><td> Miltenyi BIOTEC GmbH </td><td> 130-041-407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> מפריד QuadroMACS </td><td> Miltenyi BIOTEC GmbH </td><td> 130-090-976 </td><td></td></tr><tr><td> מסנני Rotilabo-מזרק (0.22 מיקרומטר, PES) </td><td> קרל רוט GmbH &amp; Co KG </td><td> P668.1 </td><td></td></tr><tr><td> Steritop-GP מסנן יחידת 500 מ&quot;ל </td><td> Miltenyi BIOTEC GmbH </td><td> SCGPS05RE </td><td></td></tr></tbody></table>

patient derived cell culture and isolation of cd133+ putative cancer stem cells from melanoma

למרות אפשרויות טיפולים משופרות עבור מלנומה זמין היום, חולים עם מלנומה ממאירה מתקדמת עדיין יש פרוגנוזה גרועה להישרדות ללא התקדמות וכוללת. לכן, מחקר translational צריך לספק ראיות מולקולריות נוסף כדי לשפר את הטיפולים ממוקדים עבור מלנומה ממאיר. במנגנונים האחרונים, שהעור הקשורים ללנומה נחקרו בהרחבה בשורות תאים ותיקות. בדרך למשטרי טיפול מותאמים אישית המבוססים על פרופיל גנטי אישי, אנו מציעים להשתמש בשורות תאי חולה המופקים במקום קווים סלולריים גנריות. יחד עם נתוני איכות גבוהות קליניים, במיוחד על מעקב מטופל, תאים אלה יהיו סייעו כדי להבין טובים יותר את המנגנונים המולקולריים מאחורי התקדמות מלנומה. כאן, אנו מדווחים על הקמת תרבויות מלנומה ראשוניות מרקמת גידול טריה גזורה. הליך זה כולל ריסוק וניתוק של הרקמה לתאים בודדים, מחדשmoval של זיהומים עם אריתרוציטים ופיברובלסטים, כמו גם תרבות ראשונית ואימות אמינה ממוצא מלנומה של התאים. הדיווחים האחרונים עולים כי מלנומה, כמו מרבית גידולים, נמל subpopulation קטן של תאי גזע סרטני (CSCS), אשר נראו באופן בלעדי לתדלוק ייזום והתקדמות גידול כלפי המדינה גרורתי. אחד הסמנים המרכזיים לזיהוי ובידוד CSC מלנומה הוא CD133. כדי לבודד CD133 + CSCS מתרבויות מלנומה העיקריות, יש לנו שונים ומותאם המיון מגנטי הופעל הסלולריים (MACS) הליך מMiltenyi כתוצאה טוהר מיון גבוה וכדאיות של CD133 + CSCS וCD133 - בתפזורת, שיכול להיות מתורבת ותפקודי נותח לאחר מכן.

הכנה של תאים בודדים מרקמת גידול איור 2 מדגים גרורות ימפה resected של חולה מלנומה בשלב מאוחר לפני () ואחרי (ב &#39;) לניתוק מכאני 2-4 חתיכות מ&quot;מ. בעקבות ניתוק האנזימטית של הרקמה והסינון דרך רשת ניילון מיקרומטר 70, תאים היו pelleted וsupernatant מושלכים. בשלב זה אנו נצפינו זיהום גבוה עם אריתרוציטים כפי שצוין על ידי הצבע האדמדם של התא גלול ב האיור 2C. כתוצאה מכך, אנחנו מרוקנים את תאי הדם האדום, דבר שהביאו בתא כדורי צבע חום בהיר (האיור 2D). תאים אלה resuspended ותרבית עם 263 בינוניים קוונטית ב 37 ° C ו 5% CO 2. אפיון של תרביות תאים ראשוניות כדי לאמת אם התאים שמקורם גידול ולא מסביבת stroma, בצע RT-PCRשל melanocyte/melanoma-, פיברובלסטים-, הדנדריטים וגנים סמן בתאי גזע. מלנוציטים מבוגרים שמשו כתאי ביקורת נורמליות לTyr וNCCIT קרצינומה של תאים העוברי הקו כביקורת חיובית עבור סמן תאי גזע CD133. תוצאות PCR, המוצגות באיור 3, התגלו כי כמה תאים ראשוניים הם אכן ממוצא melanocytic (חיובי לTyr) ושליליים למרקר לתאים דנדריטים בשלים (CD83). יתר על כן, שורות תאים מלנומה נמצאו מפורש CD133, גן ​​חיוני לחלוקת תאים סימטריים וסמן תאי גזע סרטן ידוע. HPRT שמשה טעינת שליטה. בתחילה, תרבית התאים הראשונית הכילה גם זיהום גבוה עם fibroblasts כפי שעולה מהביטוי הגבוה של CD90 (איור 3 שמאל, פנל העליון). בעקבות דלדול פיברובלסט, תרבות תא זה הכילה רק Tyr + תא מלנומהזה ולא יותר (fibroblasts CD90 -) (איור 3 שמאל, פנל תחתון). היעדר fibroblasts יכול להיות מאושר על ידי מיקרוסקופיה brightfield, כפי שמוצג באיור 4. תא מגנטי מיון של CD133 + ו CD133 - תאים מלנומה תאים מלנומה ראשוניים, אשר מראים CD133 ביטוי כפי שצוין על ידי RT-PCR ניתן למיין לCD133 + ו CD133 - תאים. עם פרוטוקול השונים מהעקיפים CD133 Microbead הקיט, טוהר גבוה (&gt; 99.75%) ותשואה של CD133 + ו-CD133 שברים, כמו גם כדאיות גבוהה של שני השברים לאחר מיון, מושגת. יעילות וטוהר המיון תמיד צריכות להיות מאומתת על ידי צביעת immunofluoresence או ניתוח כתם מערבי כפי שמוצגים באיור 5 א &#39;וב&#39;. <img src="/files/ftp_upload/50200/50200fig1.jpg" alt="איור 1"fo: תוכן רוחב = &quot;3.5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50200/50200fig1highres.jpg&quot; /&gt; איור 1. מערך כולל של הניסוי. התרבות ראשית מלנומה ובידוד של תאי CD133 + בתאי גזע סרטני משוערים כולל כריתה של גידול ואחרי ניתוק מכאני והאנזימטית של התאים הסרטניים באמצעות שילוב עם ניתוק DNase אני וcollagenase הרביעי וDissociator gentleMACS. אם תאי הגידול מזוהמים מאוד עם תאי דם אדומים, צעד דלדול כדורי אדום מומלץ. תרבית תאים ראשוניים אז חייבים להיות מאופיינים וMicroscopical RT-PCR ניתוח כדי לאשר אם הם תאים מלנומה. זיהום גבוה עם fibroblasts שצוין על ידי ביטוי של CD90 ניתן להסיר על ידי דלדול פיברובלסטים באמצעות microbeads של Miltenyi אנטי פיברובלסטים. לבסוף, CD133 + ותאים מלנומה יכולים להיות מופרדים CD133 באמצעות אדם העקיף CD133 מייקרו חרוז מקיט Miltenyi. לאחר מיון, טוהר והוא אשר CD133 +ד שברי CD133 מלנומה יכולים להיות מנותחים לצד זה. <img src="/files/ftp_upload/50200/50200fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. הכנה של תאים בודדים מרקמת גידול. .: דוגמה של גרורות מלנומה resected לפני הניתוק לתאים בודדים B: גרורות מלנומה לאחר ניתוק מכאני של רקמת גידול לחתיכות 2-4 מ&quot;מ באמצעות שני אזמלים סטריליים C:. גלולה של תאים בודדים המזוהמים ביותר בתאי דם אדומים D. : גלולה של תאים בודדים לאחר דלדול כדורי אדום. <img src="/files/ftp_upload/50200/50200fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. ניתוח ביטוי של תרביות תאים ראשוניות. ניתוח RT-PCR של גנים הקשורים לייצור המלנין (Tyr), סמן פיברובלסט (CD90), סמן תאים דנדריטים (<html> CD83) וגנים חיוניים לחלוקת תאים סימטרית (CD133) הראו כי בתחילה, תרבית התאים העיקרית כלולה CD133 + תאים מלנומה (Tyr +) ולא תאים דנדריטים (CD83-) אבל מאוד היו מזוהם בfibroblasts (CD90 +) (פנל שמאלי, עליון) . דלדול פיברובלסטים הבא תרבית התאים הכיל רק + Tyr ותאי CD90 מלנומה (שמאלי, פנל תחתון). HPRT שמש טעינת שליטה. NCCIT ומלנוציטים מבוגרים שמשו כביקורת חיובית לCD133 וTyr, בהתאמה. <img src="/files/ftp_upload/50200/50200fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. Micrographs של תרביות תאים ראשוניות לפני ואחרי דלדול פיברובלסטים. : מיקרוסקופ brightfield של תרבית תאים ראשונית מאוד מזוהם בfibroblasts B:. Brightfield מיקרוסקופ של אותה התרבות של תאים מלנומה הראשונית לאחר דלדול פיברובלסטים. e_content &quot;fo: לשמור-together.within עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50200/50200fig5.jpg" alt="איור 5" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50200/50200fig5highres.jpg"/> איור 5. אימות של MACS באמצעות צביעת immunofluorescence והסופג מערבי. : Micrographs immunofluorescence של תאים מלנומה 24 שעות לאחר מיון עם הערכה העקיפה CD133 Microbead מMiltenyi. תאים נזרעו בתלושי כיסוי ומוכתם בCD133 / 1 (W6B3C1) נוגדן ואחרי דגירה עם נוגדן Alexa פלואוריד 488 עיזים נגד ארנב משני. רק בחלק הקטן CD133 + אות מסוימת בקרום התא נצפתה כפי שצוינה על ידי חצים לבנים (פנל שמאלי). CD133-תאים לא כתם לנוכחות של החלבון (לוח ימני) B:. אישור על טוהר מיון לפי סופג מערבי ניאון כמותית. CD133 איתות חזקה זוהתה בשבריר CD133 +, ואילו CD133 ביטוי חלש מאוד נצפה בדואר CD133-אוכלוסייה.

Watch this Scientific Journal Video about Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma at JoVE.com

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

מאמר זה מתאר את ההכנה של רקמה המתקבלת מלנומה טרי לתרבויות העיקריות של תאים, וכיצד להסיר זיהומים של אריתרוציטים ופיברובלסטים מתאי הגידול. לבסוף, אנו מתארים כיצד CD133<sup&gt; +</sup&gt; תאי גזע מלנומה משוערים ממוינים מCD133<sup&gt; -</sup&gt; כמות גדולה באמצעות מיון מגנטי הופעל סלולרי (MACS).

תרבות מטופל נגזר סלולרי ובידוד של CD133<sup&gt; +</sup&gt; תאי גזע סרטני משוערים מלנומה

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

patient-derived-cell-culture-isolation-cd133-putative-cancer-stem

Google

Research

JoVE Journal

Medicine

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

21.1K Views.  Charité - Universitätsmedizin Berlin. מאמר זה מתאר את ההכנה של רקמה המתקבלת מלנומה טרי לתרבויות העיקריות של תאים, וכיצד להסיר זיהומים של אריתרוציטים ופיברובלסטים מתאי הגידול. לבסוף, אנו מתארים כיצד CD133 + תאי גזע מלנומה משוערים ממוינים מCD133 - כמות גדולה באמצעות מיון מגנטי הופעל סלולר...

Video: Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

הבידוד של גרעיני Cardiomyocyte מרקמות שלאחר המוות

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

הדמית זמן לשגות של תאי אפיתל חלב Preneoplastic ראשוניים הנגזרת ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סרטן השד

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

בידוד של תאי גזע סרטני מדגימות אדם סרטן הערמונית

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

העשרה לתאי גזע Chemoresistant סרטן השחלות משורות תאים אנושיות

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

בידוד והנצחה של שורות תאים שמקורם בחולה מביופסיה של שריר למחל דוגמנות

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

הרחבת בידוד והתרבות של תאי האנדותל גידול ספציפי

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

דור של חולה סרטן הערמונית נגזר מודלי xenograft ממחזור תאים סרטניים

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

בידוד נייד phenotyping של בתאי גזע mesenchymal נגזר הסינוביאלי נוזל מח עצם של Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...