אז שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על היכולת של ליגנדים אסטרוגניים לווסת אלפא קולטן אסטרוגן ואת המנגנונים של אפנון קולטן אסטרוגן סלקטיבי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזו שיטה פשוטה. זה מדגים את קולטן אסטרוגן תלוי ליגנד אלפא ליגנד איגוד פעילות עמעום התחום בתאים.
הדגמת ההליך תהיה טאנר ג'פרסון, סטודנט פוסט-דוק מהקבוצה שלנו. שיטה זו משתמשת בשלושה פלסמידים שונים כדי לזהות את פעילות עמעום תחום מחייבת של קולטן אסטרוגן בתאים. pG5-לוק הוא כתב luciferase פלסמיד לגילוי היעילות של פעילות עמעום.
pBIND עכבר אסטרוגן קולטן אלפא EF הוא גורם שעתוק תגובה גלקטוז GAL4 DNA מחייב לעכבר התמזג הראשי אסטרוגן אלפא ליגנד מחייב ביטוי תחום פלסמיד כי נקשר אלמנט מגיב GAL4 על הכתב pG5-Luc. pACT עכבר אסטרוגן קולטן אלפא EF הוא וירוס הרפס סימפלקס ביצוע קטע חלבון VP16 תחום הפעלה מותך עכבר קולטן אלפא ליגנד מחייב ביטוי תחום פלסמיד שאינו נקשר ישירות לכתב pG5-Luc. כאשר ligand הנכון קיים, החלבונים נגזר קולטן האסטרוגן עכבר pBIND אלפא EF ו pACT עכבר קולטן אסטרוגן אלפא EF פלסמידים לאגד דרך התחום מחייב אלפא ליגנד קולטן אסטרוגן.
יעילות העמעום נקבעת על ידי פעילות לוציפראז. הצעד החשוב ביותר הוא שליטה על הפעילות של pBIND עכבר אסטרוגן קולטן אלפא EF נגזר חלבון. יש להעריך את הפעילות של תחום איגוד אלפא ליגנד של קולטן אסטרוגן שמקורו ב- pBIND בכל ליגנד ללא קולטן האסטרוגן pACT אלפא EF פלסמיד לפני ניתוח פעילות עמעום התחום הכריכה של קולטן האסטרוגן התלויה בליגה.
התחל על ידי הוספת שילובי פלסמיד המתאימים לשני צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר לכל שילוב. מכינים את שני השילובים של תערובת הדנ"א. הצינור הראשון מכיל את pG5-Luc, קולטן pBIND-אסטרוגן-אלפא EF, ופלסמידים pACT ריקים.
הצינור השני מכיל את pG5-Luc, קולטן pBIND-אסטרוגן-אלפא EF, ו pACT-אסטרוגן קולטן-אלפא EF פלסמידים. כדי לזרז את ה-DNA, להוסיף 1/9 של נפח תערובת ה-DNA של שלושה אצטט נתרן טוחן ונפח 20X שלושה נתרן אצטט טוחן של 100% אתנול לתערובת ה- DNA בכל צינור ומערבולת הצינורות. לאחסן את תערובות ב 20 מעלות צלזיוס לילה לפני צנטריפוגה במהירות מקסימלית למחרת בבוקר.
השליכו את העל-טבעיים והתינו מחדש את הכדורים הבלתי נראים ב-120 מיקרוליטרים של 75% אתנול לצינור, ודאגו לשטוף כל דנ"א שדבק בחלק הפנימי של הצינורות. לאחר צנטריפוגה שנייה באותם תנאים, להשליך את supernatants ולייבש את ה-DNA במרכז ואקום במשך 30 דקות. עבור transfection, לשטוף את תאי קרצינומה hepatocellular האנושי מוכן פעמיים עם 0.5 מיליליטר של PBS בטמפרטורת החדר לכל רחצה ולהאכיל את התאים עם 0.5 מיליליטר של טרי 37 מעלות צלזיוס פנול אדום חינם MEM בתוספת 10%פחם הפשיט חום בלתי פעיל זרע שור העובר ושני מילימולר L-גלוטמין.
לאחר מכן, להשעות תערובת DNA פלסמיד מיובשת ו reagent transfection בנפח המתאים של DMEM למספר בארות בודדים 1.5 מיליליטר צינורות מיקרוצנטריפוגה. הוסף נפח שווה של מדיום רגנט transfection לכל צינור תערובת DNA פלסמיד תלוי DMEM. לאחר דגירה של 5 עד 10 דקות בטמפרטורת החדר, הוסיפו 25 מיקרוליטרים של תערובת דנ"א לבירות הניסוי המתאימות של צלחת תרבות תאי ההפטוצלומה האנושית בת 24 הבאר לתפנית של שש שעות באינקובטור תרבות התאים.
וסוף הדגירה, להחליף את מדיום transfection עם 0.5 מיליליטר של טרי 37 מעלות צלזיוס פנול אדום חינם MEM בתוספת 10%פחם הפשיטו חום inactivated FBS, שני מילימולר L-גלוטמין, 1% פניצילין סטרפטומיצין, ו ligand ל הבאר ולהחזיר את התאים לחממה תרבות התאים עוד 16 עד 18 שעות. למחרת בבוקר, לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של PBS ל הבאר ולצרף את התאים מכל באר עם 100 microliters של חיץ תיזה פסיבית ל הבאר ורעידות נמרצות עם מערבל מערבולת. ואז להקפיא את התא lysates בחנקן נוזלי.
ביום של בדיקה כפולה luciferase, לנער את lysates על שייקר עד הצלחת מגיעה לטמפרטורת החדר, ולהעביר 10 microliters של lysate ל בארות בודדות של צלחת פלסטיק לבן 96 היטב. לאחר מכן קרא את פעילות לוציפראז של כל תא ליסט מדגם על קורא מיקרופלסטיק. הטיפול של pBIND עכבר אסטרוגן קולטן אלפא EF ו pACT פלסמידים פלסמידים transfected תאים עם 10 אסטרדיול ננו-מולאר מגרה פעילות לוציפראז כמו הקולטן אסטרוגן אלפא ליגנד מחייב תחום מכיל את התחום הפונקציונלי transactivation תלוי ליגנד, AF-2.
ריכוז אחד ו -10 ננו-מולאר עם זאת, לגרום לפעילות luciferase בתאים transfected עם השילוב של pBIND ו pACT עכבר אסטרוגן קולטן אלפא EF פלסמידים, מה שמרמז על היתכנות של הליך זה להערכת קולטן אסטרוגן אלפא רצועה מחייב פעילות עמעום תחום עד ננומול אחד של טיפול אסטרדיול. טיפול עם 4-הידרוקסי-טמוקסיפן אינו פולט פעילות לוציפראז ב pBIND עכבר אסטרוגן קולטן אלפא EF ו pACT פלסמיד פלסמיד תאים מומרים, מה שמרמז כי הפונקציה AF-2 של אלפא קולטן אסטרוגן אינו מופעל על ידי ליגנד זה. עד 10 ריכוזי nanomolar עם זאת, גורם לפעילות luciferase בתאים מומרים עם השילוב של pBIND ו pACT עכבר אסטרוגן קולטן אלפא EF פלסמידים, מה שמרמז כי הליך זה הוא ריאלי להערכת קולטן אסטרוגן אלפא רצועה מחייב פעילות עמעום תחום עד 10 nanomolar של 4-הידרוקסי-tamoxifen טיפול.
הפעילות מהשילוב של pBIND ו pACT עכבר קולטן אסטרוגן אלפא ליגנד מחייב ביטוי תחום פלסמידים עם 4-הידרוקסי-טמוקסיפן הוא גבוה משמעותית מאשר השילוב של pBIND ו pACT קולטן אסטרוגן אנושי אלפא ליגנד מחייב ביטוי תחום פלסמידים. הדבר מצביע על כך שפעילות הומודימריזציה תלוית 4-הידרוקסי-טמוקסיפן של תחום איגוד אלפא ליגנד של קולטן האסטרוגן העכבר חזקה יותר מתחום איגוד אלפא ליגנד של קולטן האסטרוגן האנושי. יתר על כן, 4-הידרוקסי-טמוקסיפן תלוי פעילות הומודימריזציה של קולטן העכבר אסטרוגן אלפא ליגנד מחייב תחום המכיל תחום F אנושי נמוך משמעותית מזה של סוג פראי קולטן אסטרוגן אלפא ליגנד מחייב תחום.
לעומת זאת, פעילות הומודימריזציה תלוית 4-הידרוקסי-טמוקסיפן של תחום מחייב אלפא ליגנד קולטן אסטרוגן אנושי המכיל תחום עכבר F גבוה משמעותית מזה של סוג פראי קולטן אסטרוגן אנושי אלפא ליגנד מחייב תחום. זה מרמז כי תחום F יש השפעה על מינים ספציפיים 4-הידרוקסי-טמוקסיפין תלוי קולטן אסטרוגן אלפא ליגנד מחייב פעילות הומודימריזציה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבדוק את הפעילות הבסיסית של GAL4 DNA מחייב תחום התמזגו קולטן אסטרוגן אלפא ליגנד לאגד פעילות תחום עם ligand שלך.
פעילות זו צריכה להיות זהה לטיפול ברכב.
