Таким образом, этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о способности эстрогенных лигандов регулировать альфа-рецептор эстрогена и механизмы селективных модуляторов рецепторов эстрогена. Основным преимуществом этой техники является то, что это простой метод. Он демонстрирует лиганд-зависимых рецепторов эстрогена альфа лиганд связывания домена димеризации деятельности в клетках.
Демонстрация процедуры будет Таннер Джефферсон, аспирант из нашей группы. Этот метод использует три различных плазмиды для обнаружения эстрогена рецептора лиганд связывания домена димеризации деятельности в клетках. pG5-Luc является плазмидой люциферазы для определения эффективности активности димеризации.
pBIND мыши эстроген рецептор альфа EF является галактозы реагировать транскрипции фактор GAL4 ДНК связывания с основным сплавленных мыши эстроген альфа лиганд связывания домена выражение плазмида, которая связывается с GAL4 отзывчивый элемент на pG5-Luc репортер. pACT мыши эстроген рецептор альфа EF является вирусом простого герпеса, трансактивирующий сегмент белка VP16 активации домена сплавленных мыши эстроген рецептор альфа лиганд связывания домена выражение плазмида, которая не связывается непосредственно с pG5-Luc репортер. При надлежащем лиганд присутствует, белки, полученные из PBIND мыши эстроген рецептор альфа EF и pACT мыши эстроген рецептор альфа ЭФ плазмиды связывают через рецептор эстрогена альфа лиганд связывания домена.
Эффективность димеризации определяется активностью люциферазы. Наиболее важным шагом является контроль активности pBIND мыши эстроген рецептор альфа EF производный белок. Активность pBIND-производных рецепторов эстрогена альфа лиганд связывают домена в каждом лиганде без рецептора pACT эстрогена альфа-плазмида EF должны быть оценены, прежде чем анализировать лиганд-зависимых рецепторов эстрогена лиганд связывания домена димеризации деятельности.
Начните с добавления соответствующих плазмидных комбинаций в две 1,5-миллилитровые микроцентрифуги на комбинацию. Подготовь две комбинации смеси ДНК. Первая трубка содержит pG5-Luc, рецептор pBIND-эстроген-альфа EF, и пустые плазмиды pACT.
Вторая трубка содержит pG5-Luc, рецептор pBIND-эстроген-альфа EF, и pACT-эстрогенный рецептор-альфа-плазмиды EF. Чтобы вызвать ДНК, добавьте 1/9 объема смеси ДНК из трех ацетатов натрия моляра и 20X три молярного ацетата натрия объем 100% этанола в смеси ДНК в каждой трубке и вихрь труб. Храните смеси при 20 градусах по Цельсию на ночь перед центрифугой на максимальной скорости на следующее утро.
Отбросьте supernatants и resuspend незримые гранулы в 120 microliters 75% этанола в пробку, заботясь для того чтобы промыть вниз с любой дна вставленной к внутренностям пробок. После второй центрифугации при тех же условиях, отбросить супернатанты и высушить ДНК в вакуумном концентраторе в течение 30 минут. Для трансфекции, мыть подготовленные человеческие гепатоцеллюлярные клетки карциномы два раза с 0,5 миллилитров комнатной температуры PBS на колодец за стирку и кормить клетки с 0,5 миллилитров свежих 37 градусов по Цельсию фенол красный свободный MEM дополнен 10% древесного угля полосатый тепло-инактивированных плода сыворотки крупного рогатого скота и два миллимолара L-glutamine.
Далее приостанавливаем высушенную плазмидную смесь ДНК и трансфектический реагент в соответствующем объеме ДМЭМ на количество скважин в отдельных 1,5-миллилитровых микроцентрифуговых трубках. Добавьте равный объем трансфектионные реагенты к каждой DMEM-приостановленной плазмидной трубки смеси ДНК. После пяти-10-минутной инкубации при комнатной температуре добавьте 25 микролитров смеси ДНК в соответствующие экспериментальные скважины 24-хорошо человека гепатоцеллюлярной карциномы клеточной культуры пластины для шестичасовой трансфекции в инкубаторе клеточной культуры.
И в конце инкубации, заменить трансфекции среды с 0,5 миллилитров свежих 37 градусов по Цельсию фенол красный свободный MEM дополнен 10% древесного угля полосатый тепло-инактивированных FBS, два миллимолара L-глутамин, 1%пенициллин стрептомицин, и лиганд на колодец и вернуть клетки в инкубатор клеточной культуры еще на 16 до 18 часов. На следующее утро, мыть клетки с одним миллилитров PBS на колодец и прикрепить клетки из каждого хорошо с 100 микролитров пассивного буфера лиза на колодец и энергичные встряхивания с вихрем смесителя. Затем заморозить клетку лизатов в жидком азоте.
В день двойного анализа люциферазы встряхните лизаты на шейкере до тех пор, пока пластина не достигнет комнатной температуры, и перенесите 10 микролитров лизата в отдельные колодцы 96-ну белой пластиковой пластины. Затем прочитайте активность люциферазы каждой клетки облеантинировать образец на микроплее считыватель. Лечение pBIND мыши эстроген рецептор альфа EF и pACT плазмиды трансфицированных клеток с 10 наномолярных эстрадиола стимулирует активность люциферазы, как эстроген рецептор альфа лиганд связывания домена содержит лиганд-зависимых трансактивации функционального домена, AF-2.
Один и 10-наномоляных концентраций однако, вызывают активность люциферазы в клетках, трансфицированных с сочетанием pBIND и pACT мыши эстроген рецептор альфа-плазмиды EF, предлагая осуществимость этой процедуры для оценки эстрогена рецептор альфа лиганд связывания домена димеризации деятельности до одного наномолярного лечения эстрадиола. Лечение 4-гидрокси-тамоксифен не вызывает активности люциферазы в pBIND мыши эстроген рецептор альфа EF и PACT плазмидных трансфицированных клеток, предполагая, что функция AF-2 рецептора эстрогена альфа не активируется этим лигандом. До 10 концентраций наномолярных однако, индуцирует активность люциферазы в клетках, трансфицированных с сочетанием pBIND и pACT мыши эстроген рецептор альфа ЭФ плазмидов, предполагая, что эта процедура осуществима для оценки эстрогена рецептор альфа лиганд связывания домена димеризации деятельности до 10 наномолярных 4-гидроксифен лечения.
Активность от сочетания pBIND и pACT мыши эстроген рецептор альфа лиганд связывания домена выражение плазмидов с 4-гидрокси-тамоксифен значительно выше, чем сочетание pBIND и pACT человеческого рецептора эстрогена альфа-лиганд связывания домена выражения плазмидов. Это указывает на то, что 4-гидрокси-тамоксифен-зависимых гомодимеризации деятельности мыши эстроген рецептор альфа лиганд связывания домена является более мощным, чем человеческий рецептор эстрогена альфа лиганд связывания домена. Кроме того, 4-гидрокси-тамоксифен-зависимых гомодимеризации деятельности мыши эстроген рецептор альфа лиганд связывания домена, содержащего человека F домен значительно ниже, чем у дикого типа мыши эстроген рецептор альфа лиганд связывания домена.
В отличие от этого, 4-гидрокси-тамоксифен-зависимых гомодимеризации деятельности человека эстроген рецептор альфа лиганд связывания домена, содержащего мышь F домен значительно выше, чем у дикого типа человеческого рецептора эстрогена альфа лиганд связывания домена. Это говорит о том, что домен F оказывает влияние на вид-специфических 4-гидрокси-тамоксифен-зависимых рецепторов эстрогена альфа лиганд связывания домена гомодимеризации деятельности. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы проверить базальную активность GAL4 ДНК связывания домена сплавленных рецепторов эстрогена альфа лиганд связывают доменной активности с лигандом.
Эта деятельность должна быть такой же, как лечение транспортных средств.
