אנו מודים לד&quot;ר Xiaolian גאו, אוניברסיטת יוסטון, למתן ייעוץ לפלטפורמת microarray LC מדעי מירנה, ד&quot;ר קארין Edvardsson, מכון קרולינסקה, שוודיה, וד&quot;ר Eylem איידוגדו, אוניברסיטת יוסטון, לשיתוף המומחיות של מירנה . מחקר שפורסם בפרסום זה נתמכה על ידי המכון הלאומי לסרטן של המכון הלאומי לבריאות במספר פרס R01CA172437. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות. עבודה זו נתמכה גם על ידי מענקים מהקרן מתעוררים טקסס הטכנולוגיה, על פי הסכם שלא. 300-9-1958.

<ol>
	<li>Katchy, A., Edvardsson, K., Aydogdu, E., Williams, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol-activated+estrogen+receptor+alpha+does+not+regulate+mature+microRNAs+in+T47D+breast+cancer+cells.">Estradiol-activated estrogen receptor alpha does not regulate mature microRNAs in T47D breast cancer cells.</a> J. Steroid Biochem. Mol Biol. 128 (3-5), 145-153 (2012).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Wickramasinghe, N. S., Manavalan, T. T., Dougherty, S. M., Riggs, K. A., Li, Y., Klinge, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells.">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acids Res. 37 (8), 2584-2595 (2009).</li><li>Bhat-Nakshatri, P., Wang, G., Collins, N. R., Thomson, M. J., Geistlinger, T. R., Carroll, J. S., Brown, M., Hammond, S., Srour, E. F., Liu, Y., Nakshatri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol-regulated+microRNAs+control+estradiol+response+in+breast+cancer+cells.">Estradiol-regulated microRNAs control estradiol response in breast cancer cells.</a> Nucleic Acids Res. 37 (14), 4850-4861 (2009).</li><li>Klinge, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs+and+estrogen+action.">miRNAs and estrogen action.</a> Trends Endocrinol. Metab. 23 (5), 223-233 (2012).</li><li>Gupta, A., Caffrey, E., Callagy, G., Gupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oestrogen-dependent+regulation+of+miRNA+biogenesis:+many+ways+to+skin+the+cat.">Oestrogen-dependent regulation of miRNA biogenesis: many ways to skin the cat.</a> Biochem. Soc. Trans. 40 (4), 752-758 (2012).</li><li>Kao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+breast+cancer+cell+lines+defines+relevant+tumor+models+and+provides+a+resource+for+cancer+gene+discovery.">Molecular profiling of breast cancer cell lines defines relevant tumor models and provides a resource for cancer gene discovery.</a> PLoS One. 4 (7), e6146 (2009).</li><li>Lacroix, M., Leclercq, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+breast+cancer+cell+lines+as+models+for+breast+tumours:+an+update.">Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update.</a> Breast Cancer Res. Treat. 83 (3), 249-289 (2004).</li><li>Ross, D. T., Perou, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+gene+expression+signatures+from+breast+tumors+and+breast+tissue+derived+cell+lines.">A comparison of gene expression signatures from breast tumors and breast tissue derived cell lines.</a> Dis. Markers. 17 (2), 99-109 (2001).</li><li>Neve, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+collection+of+breast+cancer+cell+lines+for+the+study+of+functionally+distinct+cancer+subtypes.">A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes.</a> Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling:+separating+signal+from+noise.">MicroRNA profiling: separating signal from noise.</a> Nat. Methods. 7 (9), 687-692 (2010).</li><li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+using+microParaflo+microfluidic+array+technology.">MicroRNA profiling using microParaflo microfluidic array technology.</a> Methods Mol. Biol. 822, 153-182 (2012).</li><li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+microRNA+sequences,+targets+and+gene+nomenclature.">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Res. 34, 140-144 (2006).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR.">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).</li><li>Ruedl, C., Cappelletti, V., Coradini, D., Granata, G., Di Fronzo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+culture+conditions+on+the+estrogenic+cell+growth+stimulation+of+human+breast+cancer+cells.">Influence of culture conditions on the estrogenic cell growth stimulation of human breast cancer cells.</a> J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 37 (2), 195-200 (1990).</li><li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells.">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Mol. Cell. 46 (6), 893-895 (2012).</li><li>Williams, C., Edvardsson, K., Lewandowski, S. A., Strom, A., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+study+of+the+repressive+effects+of+estrogen+receptor+beta+on+estrogen+receptor+alpha+signaling+in+breast+cancer+cells.">A genome-wide study of the repressive effects of estrogen receptor beta on estrogen receptor alpha signaling in breast cancer cells.</a> Oncogene. 27 (7), 1019-1032 (2008).</li><li>Yu, Y. T., Maroney, P. A., Darzynkiwicz, E., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U6+snRNA+function+in+nuclear+pre-mRNA+splicing:+a+phosphorothioate+interference+analysis+of+the+U6+phosphate+backbone.">U6 snRNA function in nuclear pre-mRNA splicing: a phosphorothioate interference analysis of the U6 phosphate backbone.</a> RNA. 1 (1), 46-54 (1995).</li><li>Wesierska-Gadek, J., Schreiner, T., Maurer, M., Waringer, A., Ranftler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+red+in+the+culture+medium+strongly+affects+the+susceptibility+of+human+MCF-7+cells+to+roscovitine.">Phenol red in the culture medium strongly affects the susceptibility of human MCF-7 cells to roscovitine.</a> Cell Mol. Biol. Lett. 12 (2), 280-293 (2007).</li><li>Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenic+activity+of+phenol+red.">Estrogenic activity of phenol red.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 57 (3), 169-178 (1988).</li><li>Benes, V., Castoldi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+of+microRNA+using+real-time+quantitative+PCR,+how+to+use+it+and+what+is+available.">Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available.</a> Methods. 50 (4), 244-249 (2010).</li><li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+microarray+profiling,+real-time+PCR,+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression.">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).</li><li>Schmittgen, T. D., Jiang, J., Liu, Q., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+to+monitor+the+expression+of+microRNA+precursors.">A high-throughput method to monitor the expression of microRNA precursors.</a> Nucleic Acids Res. 32 (4), e43 (2004).</li><li>Setiawan, A. N., Lokman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+reference+gene+selection+programs+to+study+the+silvering+transformation+in+a+freshwater+eel+Anguilla+australis:+a+cautionary+tale.">The use of reference gene selection programs to study the silvering transformation in a freshwater eel Anguilla australis: a cautionary tale.</a> BMC Mol. Biol. 11, 75 (2010).</li><li>Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+analysis+of+real-time+PCR+data.">Statistical analysis of real-time PCR data.</a> BMC Bioinform. 7, 85 (2006).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

קביעת המנגנון לויסות הורמונלי של מירנה בתאי סרטן השד יכולה לספק פלטפורמה להבנת מחלה זו והוא יכול לספק טיפול פוטנציאלי לסרטן השד. Culturing תאים אלה כדי לספק את התנאים אופטימליים לפעולת הורמון הוא חשוב מאוד. הנה, בפרוטוקול שמבטיח כי ההורמון של עניין (אסטרוגן) לא נכלל לפני הטיפול ושמינון אופטימלי של E2 שימש לזמן מתאים במהלך הטיפול שתואר. השפעות גורם הורמונלי וצמיחה אחרות הוחזקו לכל הפחות על ידי הורדה הדרגתית של הרמות בסרום ובאמצעות DCC-FBS, שהוא FBS שהופשט מרוב ההורמונים שלה, ציטוקינים וגורמי גדילה. תקשורת האדומה ללא פנול שימשה נוסף כדי למזער את השפעות nonhormonal אחרות, בהתחשב בכך שפנול אדום כבר דווח כי פעילות אסטרוגנית ומשפיע על פונקציות מסוימות בשורות תאי 20,21. זמן חשיפה של התאים להורמון הוא בעל חשיבות רבה. לרגולציה הקשורים לאסטרוגן של גנים, זה כבר הראה בעבר כי 24 hrexposure לייצר תגובה משמעותית של גנים המטרה ישירים בתאי סרטן שד 1,18. מאז miRNAs מתועתק על ידי RNA פולימראז II, כמו mRNAs, מתקבל על הדעת שמדוברת בנקודת זמן מתאימה כדי לזהות רגולציה ישירה גם של miRNAs. זה עדיין לא נקבע אם וכיצד miRNAs אלה משפיע על הביטוי של מטרות ER הידועים אלה בתאי סרטן השד. פרופיל ביטוי מירנה יכול להיות מאתגר בגלל גודלו הקטן יחסית של מירנה, העובדה שניתן למצוא את רצף מירנה בוגר גם בפרי מירנה וטרום מירנה, ובגלל ההטרוגניות בתוכן GC 22. טכניקות אפיון כמה וכימיה של להיות מועסקים על מנת להתגבר על קושי זה. בין אלה גישות שונות של microarray וניתוח qPCR (איור 2) הן. למרות microarray מקובל לאנאלי הגנום כולויסיס, הוא יכול לספק נגטיבים שווא וקיים הבדלים בין הפלטפורמות הזמינות, החל הכימיה לטכנולוגיית הדפסת 23. גם תהליך הנורמליזציה מציג אתגר בניתוח יחסית מעט גנים מירנה, שנספרים באלפים בהשוואה לעשרות אלפי תעתיקי mRNA. qPCR, לעומת זאת, הוא רגיש יותר, והוא טוב יותר מיושם כאשר פחות גנים הם להילקח בחשבון. עם זאת, כאשר היא מבוצעת ב384 גם צלחות גדולות, עם לשכפל טכני אחת בלבד לכל צלחת, צלחות מרובות צריכים להיות מנותחות עבור כל דגימה שהופך את הניתוח יקר. כמו כן, בידיים שלנו, רבות תוצאות שליליות יותר שווא התקבלו באמצעות ניתוח DLP-LDA לעומת microarray. בהתחשב בכך את רצף מירנה בוגר נמצא בפרי, מירנה והרצפים טרום מירנה, זה עניין להבדיל בין תעתיקים אלה באמצעות טכניקות PCR 24. בדיקות DLP זמינות גם ל- miRNAs מראש, וspיכולים גם להיות מתוכננים פריימרים ecific להוציא בוגר או מבשר שונים גרסאות באמצעות טכנולוגיית qPCR צבע Cyanine. qPCR הוא תקן זהב עבור אימות ביטוי ההפרש מפרופיל תוצאות. היעילות של qPCR, לעומת זאת, תלויה במספר פרמטרים הכוללים מיצוי RNA, שלמות RNA (איכות), סינתזת cDNA, עיצוב פריימר, שיטת זיהוי (כימיה), וגן ההתייחסות לנורמליזציה נתונים 1,22,25. האפשרויות לעיצוב פריימר לניתוח מירנה היא מוגבלות מאוד, שכן אורך רצף מירנה הקצר אינו נותן מקום להרבה עיצוב פריימר חלופי, ורק אחד פריימר ניתן טיפח ברצף קצר זה. לפיכך, הצורך במניפולציות חלופיות כפי שמודגמות באיור 2. משכפל טכני חשוב כדי לאמת את חוסנו של שיטת ההגברה והתהליך המועסק. משכפל ביולוגי נדרש לייצוג של variatio הביולוגי הכלליn, לרבות תגובה משתנה ליגנד טיפול, וכדי להראות שתופעות ראו בתא הן לשחזור. בהתבסס על הניסיון שלנו, שינויים בביטוי מירנה בין תרביות תאים יכולים להתרחש. בדרך כלל ההבדלים האלה הם פחות מ פי 1.3, והממוצע של ערכים וSD המתאימים מזהה את הווריאציה הטבעית וטכנולוגית. וריאציה זו יכולה לנבוע מגורמים שונים, כולל, צפיפות תאים והעובדה שפונקציות תא יכולים להשתנות מקטע לקטע. כדי לזהות ביטויים סטטיסטיים משמעותיים כתוצאה מטיפול ליגנד, משמעות מקובלת היא כאשר p-הערך הוא פחות מ 0.05. הנה, כבר בשימוש על מבחן t של סטודנט על משכפל הביולוגי וטכני באמצעות ההפצה שני זנב ופרמטרים שונות שאינם שווים שני מדגם. פרמטרים מבחן t אחרים קיימים, והבחירה תלויה בהתקנה הניסיונית 26. פרוטוקול מפורט בהערכת תקנות ההורמונלית של הבוגר miRNA בתאי סרטן שד כבר סיפק. וטכנולוגיות חשובות כימיה באפיון ואימות של ביטויי מירנה אלה הוסברו באופן ברור. הטכנולוגיה שנבחרה למחקרים של מירנה בתאי סרטן השד תלויה בסופו של דבר מה בדיוק נחקר.

אסטרוגן הוא הורמון חשוב במהלך התפתחות בלוטת החלב. אסטרוגן גם ממלא תפקידים חשובים בפיתוח, תחזוקה, סיכון, וטיפול בסרטן השד 1. אסטרוגן מפעיל הפונקציה שלה על ידי קשירה לחדרי מיון, שהם גורמי שעתוק ולהסדיר גנים המטרה ספציפיים. של שתי גרסאות קולט, ERα הוא חיוני לשגשוג תלוי באסטרוגן בתאי סרטן השד. רוב מקרי סרטן השד הם ERα חיוביים ותלוי באסטרוגן לצמיחה. זה הפך את איתות אסטרוגן וERα יעד לטיפול בסרטן השד חיובי הורמון לקולטן. הבנת המנגנון הבסיסי של ERα חשובה כדי לשפר את תוצאות טיפול, להתגבר על התנגדות לטיפול, ולהבין כיצד מתפתח סרטן השד. miRNAs ממלא תפקידים קריטיים בפונקציות תא בשל ההשפעה הגדולה שלהם בויסות הגנים לאחר תעתיק. miRNAs קצר 19-24 נוקלאוטידים, אחד תקוע, Noncoding RNAs אשר עיבד לראשונה על ידי RNA פולימראז II לתעתיקי מירנה ראשוניים (פרי מירנה). הם מעובדים בגרעין על ידי Drosha למבשר-miRNAs קצר סיכה (טרום מירנה) ומעובד לאחר מכן על ידי דייסר ומופרד לגדילים יחיד ליצירת miRNAs הבוגרת בציטופלסמה. MiRNAs הבוגרת חד גדילים מועברות לחלבוני argonaute ליצירת מורכב RISC. לאחר מכן, miRNAs יכול להכליא אזורי 3&#39;-מתורגמים (3&#39;-UTR) של mRNA יעד, מה שמוביל לרגולציה לאחר תעתיק על ידי חסימת תרגום או משפיל את ה-mRNA היעד 2. בשל התפקיד החשוב שגם אסטרוגן וmiRNAs לשחק בהתקדמות גידול, זיהוי miRNAs קשורים איתות אסטרוגן נורמלית או שיבש הוא חשוב על מנת לשפר את ההבנה של ההתפתחות שלנו ולשפר את הטיפול בסרטן השד. אמנם יש הבנה טובה של איך ERα מסדיר גנים המקודדים חלבונים, ההארכהופרטים של noncoding תקנות RNA נשארים להיחקר ביסודיות. מחקרים ראשוניים במטרה להבהיר הרגולציה ERα של מירנה בשורות תאי סרטן השד הניבו תוצאות סותרות, גם כאשר באותו קו התא כבר ניתח 3-6. זה עשוי להיות תוצאה של טיפולים שונים, וריאציות ביולוגיות, השימוש בטכניקות שונות, והעובדה שהגודל הקטן של miRNAs לגרום להם מאתגר לנתח. כאן, פרוטוקול השולט לוריאציות וחפצי שיטה מתואר. כדי לזהות איזה miRNAs מוסדר על ידי אסטרוגן, פרופיל של מודל סרטן שד מוגדר היטב של פעילות ERα הוא צעד ראשון. שורות תאים כמה כבר נוצרו מגידולים אנושיים ERα החיובי לסרטן השד, התלויים באסטרוגן הדומה לרוב מקרי סרטן השד קליניים. המאפיינים המולקולריים של שתי שורות תאים אלה, T47D וMCF7, כולל הביטוי של ERα והמטרה במורד הזרם שלו,קולטן הורמון פרוגסטרון (PR), חוסר הביטוי של הקולטן HER2 הקרום, יחד עם ביטוי של גנים בידול אסטרוגן להגיב וluminal-אפיתל, לגרום להם מתאים כמודלים לתת luminal של גידולים בשד 7-10. 17β-אסטרדיול (E2) הוא הצורה הדומיננטית של אסטרוגן, והריכוזים ונקודתי זמן להפעלת תעתיק אופטימלי של ERα היו מאופיינים במחקרים רבים. בטיפול זה פרוטוקול 10 ננומטר E2 ל24 שעות משמש וT47D וMCF7 כמודלים לפעילות ERα בתאי סרטן השד 1. בנוסף, תקנות מירנה תלוית זמן ניתן לנתח באופן ספציפי במרווח של למשל 1-72 שעות זמן. שנית, יש מירנה ניתוח אתגרים נפרדים, בין שאר בשל הגדלים שלהם קצרים. miRNAs אינם נשמרים גם בסך הכל הכנת RNA כאשר thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol משקעי RNA הרגילים guanidinium מבוצעים, או כאשר stpurifications עמודת andard משמשות. אמצעי זהירות מיוחדת יש לנקוט כדי לשמור או להעשיר עבור החלק הקטן יותר של RNAs. על ידי הגדלת נפח isopropanol, הורדת הטמפרטורה לפני צנטריפוגה (-80 ° C), והשמטת הכביסה ב70% אתנול, התמך של miRNAs יכול להיות משופר במשקעים. לחלופין, ניתן להשתמש בעמודות ספציפיות ומאגרים להכנה איכותית וחזקה של רנ&quot;א הכל המכיל מירנה. גם לניתוח עצמו, הגדלים שלהם קצרים ליצור אתגרים. להקרנת מירנה הגנום כולו, יש שלוש מירנה המשותפת פרופיל טכניקות לבחירה: microarrays, qPCR, והדור הבא של רצף. כל טכניקה יכולה להתבצע באמצעות פלטפורמות שונות מרובות, והכנות מדגם שונות נדרשות, כל אחד עם סיכונים שונים של החדרת חפצים. בmicroarray מירנה, שקופיות הוא הבחין או מסונתז עם אלפי oligonucleotides. oligonucleotides אלה משמשות כמו בדיקות, וכל אחד מהחלליתים נועד להכליא רצף מירנה בפרט. הכנת המדגם עבור microarrays, כפי שבוצעה במחקר זה, מעשירה ראשונה לmiRNAs ולאחר מכן מציגה תיוג Cy5 וCy3 על miRNAs. Microarray נותן את ההזדמנות כדי לבחון את רמות הביטוי היחסית של מספר רב של גנים בו זמנית, הוא מהיר ומתאים להקרנה של מספר הגדול של דגימות, אבל רק יכול לנתח רצפי הווה על microarray ולמשל לא לזהות שינויים בבלתי ידוע או שעבר מוטציה miRNAs. ניתוח microarray כפי שבוצע בפרוטוקול זה דורש גם כמויות גדולות יחסית, כ -5 מיקרוגרם, של רנ&quot;א הכל לדגימה לצורך הניתוח. פרופיל הצפיפות נמוכה qPCR מירנה דורש פחות חומר (700 ng / מדגם ולשכפל), ומאפשר לאיתור והכימות של miRNAs. רמות תמליל ניתן לקבוע, והכמות יכולה להיות סכום מוחלט או סכום יחסי. ניתוח qPCR דורש ראשון המרה של מירנה לתוך cDNA, כאן על ידי שימוש בכרךפריימר לכל מירנה הספציפית הבטחת הניתוח רק מתבגר מירנה. זה יוצר תבנית ארוכה יותר שיכול להיות מוגברות ניצול פריימר קדימה מירנה הספציפית ופריימר הפוכה אוניברסלית משלימה את רצף הכרך, ויכול נמל הכללת בדיקה כפול תווית לייחוד. qPCR ניתן להשתמש בתבנית בצפיפות נמוכה שבו מאות miRNAs ניתן לאתרם במקביל תוך שימוש באחת או כמה צלחות 384 גם עם זוגות פריימר בודדים בכל הטוב 11. הדור הבא של רצף, לעומת זאת, הוא רק של טכניקות אלה המאפשרים הגילוי של רומן, miRNAs מוטציה או עריכה, כפי שיכול להיות רצף כל RNAs במדגם 11. טכניקה זו, עם זאת, דורשת שלבים מרובים להעשיר RNAs הקטן ולייצר ספריית RNA קטנה באמצעות מספר צעדים של ligations מקשר וpurifications עם סיכונים משופרים הבאים של ויסות רמות הביטוי היחסית שלהם בין דגימות. זה גם דורש bioinformati המשמעותיניתוח cs. בהתחשב בטכניקות השונות לפרופיל מירנה, הטכניקה המתאימה ביותר תלויה ביישומים. Microarrays הם מתאים ביותר כאשר חומר הוא יחסית בשפע והעניין הוא להגדיר ביטוי ההפרש של miRNAs כבר ידוע. מערכי qPCR בצפיפות נמוכה הם מתאימים ביותר כאשר כמות מוגבלת של מדגם היא זמינה ורגישות גבוהה של miRNAs הביע נמוך נדרש. רצף הוא מתאים ביותר כאשר הניתוח של miRNAs ידוע, שעבר מוטציה או isoforms שונה של מירנה נדרש. במסגרת המחקר של miRNAs מוסדר אסטרוגן בסרטן השד, נמצאים בשימוש בשני קווי תאי מודל, T47D וMCF7, שבו כמויות גדולות של RNA זמינות. שורת תאים כל אחד מהם נותחה בתרביות תאים משוכפלים באמצעות קטעים שונים, כל אחד בחזרות טכניות של טיפול. זה מאפשר לגילוי חזק של reproducibly, miRNAs המוסדר ERα. רמות ביטוי מירנה יחסית הושוו באמצעות שני microarray ומירנהבדיקות כפולה תווית - מערכי צפיפות נמוכה (DLP-LDA) ותוקפות את התוצאות עם qPCR הספציפי באמצעות שני לצבוע Cyanine וכימיה של DLP. תקנות מירנה נותחו לאחר מכן עוד זמן סדרה בלהגדיר הרגולציה המדויקת שלהם לאורך זמן, אשר יכול לעזור להבדיל וריאציות אקראיות או היממה מתקנות מושרה אסטרוגן, ומצביע על השפעות עיקריות מהשפעות משניות. השוואות Bioinformatical עם לימודים מחייבים הכרומטין של ERα יכולות לקדם את הסיוע בבידול של ראשוני לעומת השפעות משניות. Assay הביא להערכה אמינה של תקנות מירנה שבו ניתן להקים כי לאחר תעתיקים מקודדי חלבוני טיפול E2 24 שעות הוסדרו בקלות אך miRNAs הבוגרת לא הושפעה 1. עם זאת, לא מן הנמנע כי miRNAs מוסדרים בזמן נקודות מאוחר יותר, כפי שמודגם בניתוח סדרת הזמן של miRNAs שנבחר 1. הפרטים צריכים להיחקר עוד יותר והפרוטוקול המובא כאן מספק Robusדרך לא ללמוד ויסות הורמונלי של miRNAs הבוגר בשורות תאי סרטן השד.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1277">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">DMEM</td>
			<td style="width:364px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:399px;">11885092</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11765054</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926-500ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phenol red-free DMEM&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11054020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrapure Water</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Specific equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DCC-FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6765-500ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100X L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS tablet</td>
			<td>Medicago, Accurate chemicals</td>
			<td>Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">17&#946;-estradiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2758</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ICI 182,780&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4409</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-600ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T47D or MCF7 cells lines</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 flask&#160;</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>BD353136 (vented cap)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300062</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serological pipet</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>53300. For 5mL (53300-421)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Countess Cell Counting chamber</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10228</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10227</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm plates&#160;</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>25382-166</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596026</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rubber cell scraper&#160;</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>82050-470</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rnase-Free DNase I&#160; kit (DNA degradation)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-free water (Nuclease-free water)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>SH30538.02</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 1000 Spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>ND-1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent RNA 6000 Nano Assay kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1512</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2938C and for software (G2946)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">All primers (except TaqMan primers)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Specific per order for each gene/miRNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18080085</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroAmp Fast 96-Well reaction plate&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4346906</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Optical Adhesive Covers</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4311971</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2X SYBR green PCR master mix (Cyanine dye)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4385612</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7500 Fast Real-Time PCR System and software</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4351106</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#956;Paraflo Microfluidic Biochip Technology&#160;</td>
			<td>LCSciences</td>
			<td>MRA-1001 and AS-2001(for result analysis)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4400928</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4366596</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneAmp PCR System 9700 thermocycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4310899</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual Labeled Probes (TaqMan) 2X Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4324018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7900HT Fast Real-Time PCR system</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4329001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS and RQ manager softwares</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4444202</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MIRC-50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X DPL (TaqMan) RT primers</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Specific for each miRNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20X DPL (TaqMan) real-time assay primer&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Specific for each miRNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling of estrogen-regulated micrornas in breast cancer cells

אסטרוגן ממלא תפקידים חיוניים בהתפתחות בלוטת החלב והתקדמות סרטן השד. זה מתווך את תפקודו באמצעות קשירה והפעלה קולטני אסטרוגן (ERS), ERα, וERβ. ERα לעתים קרובות שהוגברו בסרטן השד ומניע את ההתפשטות של תאי סרטן השד. המיונים לתפקד כגורמי שעתוק ולווסת את ביטוי הגנים. ואילו ההסדרה של ERα של גנים המקודדים חלבונים היא מבוססת היטב, הפיקוח עליה של noncoding microRNA (מירנה) הוא נחקר פחות. miRNAs לשחק תפקיד מרכזי בוויסות לאחר התעתיק של גנים, התרגום המעכב שלהם או משפיל את ה-mRNA שלהם. miRNAs יכול לתפקד כאונקוגנים או מדכאי גידול וגם מבטיחים סמנים ביולוגיים. בין מבחני מירנה הזמינים, microarray ותגובה הכמותית בזמן אמת שרשרת פולימרז (qPCR) נעשה שימוש נרחב כדי לזהות ולכמת רמות מירנה. לזהות miRNAs מוסדר על ידי איתות לאסטרוגן בסרטן השד, הביטוי EIR בשורות תאי סרטן שד ERα חיוביות הושווה לפני ואחרי אסטרוגן הפעלה באמצעות שני microarrays μParaflo-microfluidic והכפול תווית בדיקות נמוכות מערכי צפיפות. תוצאות אומתו באמצעות מבחני qPCR ספציפיים, החלת שני תווית כימיה מבוססת בדיקות מבוססות צבע Cyanine וכפול. יתר על כן, assay נקודת הזמן היה בשימוש כדי לזהות תקנות לאורך זמן. יתרונות של גישת assay מירנה השתמשה במחקר זה הוא שהוא מאפשר הקרנה מהירה של תקנות הבוגרת מירנה בדגימות רבות, גם עם כמויות מדגם מוגבלות. הפריסה, לרבות התנאים הספציפיים לתרבית תאים והטיפול באסטרוגן, משכפל ביולוגי וטכני, והקרנה בקנה מידה גדולה ואחרי אישורים מעמיקים תוך שימוש בטכניקות שונות, מבטיח זיהוי חזק של תקנות מירנה, ומבטל תוצאות חיוביות שגויות וממצאים אחרים. עם זאת, miRNAs מוטציה או לא ידוע, או תקנות בleve התמליל הראשוני והמקדיםl, לא יזוהה. השיטה המוצגת כאן מייצגת חקירה יסודית של הרגולציה מירנה בתיווך אסטרוגן.

סקירה של הגישה מוצגת באיור 1 והשוואה של ההכנות מדגם השונות ושינויי חומצות גרעין הנדרשים לכל טכניקה היא מדמיין באיור 2. המצב והסביבה של התאים לפני טיפול עם הורמון חשוב בקביעת ההשפעות בפועל של ההורמון 16. חלקם בינוני וסרום מכילים גורמי גדילה שעשויה להשפיע על תוצאות, ולכן תאי סרום המורעב כדי להבטיח שכל השפעות הורמונליות צומצמו למינימום. לפיכך, בעת טיפול עם E2, יש ודאות יותר כי ההשפעות שנצפו קשורות-E2. גורם חשוב הוא confluency של תאים, אשר משפיע על קשר בין תאים והתנהגויות כגון איתות תאי תאים והתרבות. תאים הורשו להיות מחוברות 80% (איור 3 א) וכן מצורף כדי לאפשר צמיחה ולמנוע אובדן של תאים במהלך ch כביסה ואמצעי התקשורת הבאAnge. התנאים במהלך חילוץ ואחסון RNA חשובים לאיכות של RNA וניתוח שלאחר מכן. ידועים גם כי מספר התאים, שיטת החילוץ, ותוכן GC של מירנה יכולים להשפיע על התפוקה והאיכות של שניהם mRNAs וmiRNAs 17. לפיכך, יש צורך לבצע מיצוי RNA בתנאי RNase חינם וכדי לבדוק את האיכות של RNA לפני שתמשיך עם ניסויים. לאחר חילוץ, כימות של RNA מספקת מידע על הריכוז של RNA הכולל (המכיל גם mRNAs וmiRNAs), המאפשר תצפית של תשואה. הוא גם מספק ייצוג גרפי של תוצאות כפי שניתן לראות באיור 3 ב, וזה מאפשר לתצפית של טוהר המדגם (בדרך כלל מצויינים על ידי שיא אחד, פנל עליון). תשואה ירודה של RNA הייתי לייצר שום קליטה ספציפית ב260 ננומטר (איור 3B, פנל תחתון). כדי לקבוע אם ה-RNA הוא באיכות גבוהה, RNAיושרה נמדדה. מספר שלמות RNA (רין) של בין 9-10 מבטיח כי RNA הוא לא מושפל והוא באיכות אופטימלית. כמו כן, הייצוג הגרפי של RNA יש לשים לב, ו18S ו28S rRNA צריך פסגות כפי שמוצג באיור 4 (פנל באמצע). השוואה עם הסולם (איור 4, פנל עליון) מזהה את הגודל של הפסגות. RNA מושפל יהיה פסגות פחות ברורות וכמות היחסית מופחתת של 18S ו28S rRNA (איור 4, פנל תחתון). חלק קטן של RNA הקטן נוסף יכול להיות מובטח באמצעות Agilent RNA הקטן קיט. מומלץ לאמת את תגובת אסטרוגן לאחר טיפול, תחת תנאי ניסוי שצוינו, לפני שתמשיך להקרנת מירנה. ניתן לבצע qPCR בגן יעד ER ידוע כגון PS2 או SPINK4 18, תוך שימוש בתבנית cDNA. גנים כאלה הם בדרך כלל שהוגברו בתוך 1-24 שעות לאחר טיפול E2. ברגע שהאיכות של RNA והתגובה לאסטרוגןכבר העריך, ניסוי יכול להמשיך להתנהל. Microarray הוא עדיין טכניקה המשמשת באופן נרחב להקרנה בקנה מידה גדולה לביטוי מירנה בתאים. לדוגמא, microarray מירנה ששימש בעבר כלול 894 miRNAs בוגרת ו50 בקרות בדיקות ייחודיות ברביעיית 1. הכלאות בוצעו בכפילויות עם הליך החלפת צבע. תוצאות microarray מירנה בדרך כלל מיוצגות בצורה גרפית על ידי מפות חום. איור 5A מציג מפת חום, המייצג את הנתונים מהשוואת microarray מירנה בין הרכב והדגימות טופלו E2. אדום מצביע על כך שמירנה היא שהוגברו במדגם שטופל-E2 (ביטוי גבוה יותר), ואילו הירוק הצביעה downregulation של מירנה (ביטוי נמוך יותר). בחירת מירנה בדרך כלל תלויה במשמעות שלהם בביטוי, ובדרך כלל p-value פחות מ 0.05 נחשבת משמעותי. MiRNAs שמסומנים לבוא לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי צריך להיות תוקף נוסף wה-i qPCR, כדי להבדיל אותם מתוצאות חיוביות שגויות. מערך DLP-LDA, לעומת זאת, משתמש בשיטה מבוססת qPCR למסך עבור miRNAs המוסדר בפורמט 384 גם. בדרך כלל שתי צלחות 384 גם (כרטיסים) מסופקות, בריכות וברכה ב &#39;מכיל בדרך כלל מאופיין יותר ויותר הביע מאוד miRNAs מאשר ב&#39; הבריכה ברמה היחסית של כל מירנה נקבעת על ידי qPCR, שבו הוא ניתח למירנה היטב (איור 5). ערך Ct גבוה יותר מצביע על ביטוי פחותים מירנה. בדומה microarray מירנה, תוצאות שהושגו מDLP-LDA צריכים להיות תוקף נוסף כדי להבטיח דיוק. ניתן לבצע אימותים באמצעות qPCR. הנה, שתי שיטות זיהוי qPCR מתוארות כדי למנוע הטיה שיטה ולאפשר לאישור וחקירה של תקנות מירנה יסודיים. הכימיה זיהוי מבוסס צבע Cyanine עובדת שונה מאשר DLP שפרופיל DLP-LDA מבוסס על, והוא מתאים לאישורמטרות ation. זה יכול להיות פחות ספציפי כפי שהוא מזהה את כל גדילי הדנ&quot;א הכפול המוגבר, אבל ההומוגניות של המדגם ניתן להעריך על ידי ביצוע ניתוח היתוך עקום. איור 6 א (משמאל פנל) מציג את ניתוח היתוך העקום של מירנה, ו שיא אחיד מוגדר וברור שניתן לראות. פסגות מרובות יהיו ציינו אם פריימר הוא כמויות ספציפיות או משמעותיות של פריימר-dimer הוא נוצר (איור 6 א, פנל מימין). מבחני DLP מירנה לעומת זאת, הוא יותר ספציפיים כהגברה בלבד של היעד מירנה מזוהה. חלקות הגברה של כל יעד מירנה ניתן לצפות, כפי שהודגמה באיור 6. האפשרות לשליטה להתרחשות של מוצרי הגברה מרובים באמצעות הניתוח עקום התכה היא, עם זאת, אינו זמינה עם הכימיה הזאת ולצבוע Cyanine qPCR הוא פחות יקר. יכולים לפעמים נוצרו מבחני צבע Cyanine וDLP qPCR תוצאות שונות במקצת. עבור שני מבחני qPCR, השוואה לrefeגן לורנס נדרש כדי לקבוע את הביטוי היחסי של גנים בין שתי דגימות. גן ההתייחסות, המכונה גם גן משק, צריך להיות גן שהביטוי שלו הוא לא השתנה, והוא בא לידי ביטוי ברמות דומות לגן של עניין. דוגמא של גן התייחסות מתאים בשורות תאי סרטן השד אלה היא ARHGDIA, התמ&quot;ג-דיסוציאציה מונעי Rho שמתפקד תהליכי חילוף התמ&quot;ג / GTP של חלבוני Rho. כפי שנצפה באיור 6C (למעלה), ברמת ה-mRNA של ARHGDIA אינה משתנית בין הרכב לבין הדגימות שטופלה יגנד. יכול לשמש גם 18S rRNA, אם כי הביטוי הגבוה שלה דורש 1:500 דילול נפרד של מניית cDNA ולכן פחות מתאים. לניתוח מירנה, יש עדיין ויכוח על גן התייחסות מוגדרת היטב. עד כה, snRNA U6 הוא גן התייחסות שמקובל לניתוח מירנה. U6 snRNA הוא RNA ~ הארוך 110 נוקלאוטיד, noncoding הקטן הגרעיני המתפקדים בSPL מראש mRNA הגרעיניהדובדבן 19. כפי שנצפה באיור 6C (בחלק תחתון), רמות ביטוי U6 הן בערך אותו הדבר בכל הדגימות שמוצגים, ובכך מאפשרות לחישובים של הרמות המשתנה של מירנה. ייצוג גרפי של תוצאת מירנה qPCR להשוואה בין כלי הרכב והתאים שטופלו-E2, כי כבר מנורמל U6 ההתייחסות ניתן לראות באיור 6 ד. זה ממחיש מירנה, שאותרו כnonregulated לאחר טיפול E2 24 שעות, אבל שמטפח אתרים מחייב הכרומטין ER הקרובים למיקומו הגנומי, וניתוח סדרת הזמן זיהה רגולציה משמעותית 72 שעות לאחר טיפול. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig1.jpg" /> איור 1. סקירה של הגישה מועסקות לצורך זיהוי של רגולציה הורמונלית של מירנה בתאי סרטן השד. </strאונג&gt; תהליך מתחיל בתרבית תאים וטיפול, ואחריו בקנה מידה גדול מירנה פרופיל לזהות miRNAs אולי הביע באופן דיפרנציאלי, ומסתיים עם אימותי qRT-PCR של תוצאות מערך. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig2.jpg" /> איור 2. השוואה בין התכשירים השונים מדגם ומניפולציות חומצות גרעין לכל טכניקת זיהוי מירנה. () Microarray מירנה בשיטת טכנולוגית μParaflo כולל העשרה, poly-עוקב וסימון קשירה. (ב) הכנת מדגם טכנולוגיית DLP ושיטת זיהוי כוללים פריימר סינתזת cDNA כרך המשתרע לאחר שלב denaturation ומספק שבר כבר מחסה הכנת מדגם טכנולוגיית צבע Cyanine לאחור תחל ורצף בדיקה. (C)ושיטה לגילוי כולל עוקב פולי, וסינתזת cDNA עם פריימרים אוליגו-DT כולל רצף אוניברסלי 5 &#39;. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig3.jpg" /> איור 3. תרבית תאים ומיצוי RNA. (א) בתאים בתרבית כדי להמחיש 80% confluency צורך לפני טיפול עם ליגנד. (ב) ייצוג גרפי של ריכוז RNA ובטהרה לאחר חילוץ. שיא כל אלו מהווה מדגם ותהליך חילוץ מוצלח מניב RNA הטהור (פנל עליון). RNA חילוץ גרוע לא מראה שיא ספיגה ברור ב260 ננומטר (פנל תחתון). <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig4.jpg" /> איור 4. &amp; #160; בקרת איכות RNA תוצאות מניתוח שלמות RNA מראה ייצוג גרפי לסולם (למעלה), RNA באיכות טובה (באמצע) ומדגם RNA מושפל (תחתון).. <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig5.jpg" /> איור 5. איור של תוצאות פרופיל מירנה. (א) ייצוג מפת החום של תוצאות microarray מירנה לmiRNAs הביע באופן דיפרנציאלי. miR-A, B, C הם שהוגברו בטופל מדגם E2 כפי שצוין באדום, ואילו miR-D, E, F, G הם downregulated במדגם שטופל ב-E2 כפי שצוין בירוק. חלקות הגברה (ב) לכל מירנה מתוצאות DLP-LDA. מירנה זוהתה הם מוגברים כפי שצוינו על ידי גידול בשווי Rn. <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51285/51285fig6highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51285/51285fig6.jpg&quot; /&gt; איור 6. ניתוח qPCR של תקנות מירנה. () ניתוח התכה עקום למירנה נותח באמצעות זיהוי צבע Cyanine, מראה ההומוגניות של כל נבדקו הדגימות (משמאל) וההגברה של שברים מרובים (מימין). חלקות (ב &#39;) הגברה עבור כל דגימה עבור מירנה. זה יכול להיות גם מצבע Cyanine או DLP שיטות זיהוי. (ג) ייצוג גרף עמודות של גנים מתאימים התייחסות לmRNA ניתוח ARHGDIA (למעלה) ולU6 מירנה ניתוח snRNA (תחתון), לא מראים ביטוי ההפרש משמעותי בין דגימות. (D) תוצאות מירנה qPCR כדי להמחיש השוואה של רמות ביטוי היחסית של miR-135a מעל כמובן זמן. איור 6 ד &#39;הודפסה מחדש מKatchy et al. 1 באישור Elsevier. ערכים הם בדרך כלל הממוצע של exper הנפרדiments (כפילויות ביולוגיות) ± SD. מבחן t של הסטודנט משמש כדי להדגים משמעות: * p &lt;0.05.

Watch this Scientific Journal Video about Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells at JoVE.com

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

מולקולרי איתות דרך גם אסטרוגן ומייקרו RNA הם קריטיים בהתפתחות סרטן השד וצמיחה. אסטרוגן מפעיל את קולטני האסטרוגן, שהם גורמי שעתוק. גורמי שעתוק רבים יכולים לווסת את הביטוי של מיקרו RNA, והוא יכול להיות צדודית מיקרו RNA מוסדר אסטרוגן תוך שימוש בטכניקות שונות בקנה מידה גדולה.

פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

profiling-of-estrogen-regulated-micrornas-in-breast-cancer-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

19.9K Views.  University of Houston.  מולקולרי איתות דרך גם אסטרוגן ומייקרו RNA הם קריטיים בהתפתחות סרטן השד וצמיחה. אסטרוגן מפעיל את קולטני האסטרוגן, שהם גורמי שעתוק. גורמי שעתוק רבים יכולים לווסת את הביטוי של מיקרו RNA, והוא יכול להיות צדודית מיקרו RNA מוסדר אסטרוגן תוך שימוש בטכ?...

Video: Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

בתחום ההדמיה vivo של פליטת אור Dynamics היפוקסיה גידול של גרורות סרטן השד המוח במודל של עכברים

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

רב מודלי הדמיה של אנגיוגנזה מודל עכברים עירום של גרורות סרטן השד עצם באמצעות דימות תהודה מגנטית, טומוגרפיה ממוחשבת נפחית ו אולטראסאונד

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

חי הדמיה של תגובות סמים בmicroenvironment הגידול במודלים עכבריים של סרטן השד

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

שלוש תרבויות ממדים: כלי ללמוד רגיל אדריכלות acinar לעומת שינוי ממאיר של תאי שד

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

כימות של הפולשנות תאי סרטן השד תוך שימוש במודל תלת ממדים (3D)

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

מולקולרי פרופיל של microenvironment הגידול פולש במודל 3 ממדים של תאי סרטן המעי הגס ו<em&gt; Ex vivo</em&gt; פיברובלסטים

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

הזרקת orthotopic של תאי סרטן השד לחלב שומן Pad של עכברים לחקר התפתחות גידול.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo לשעבר vivo גישות לחקר סרטן השחלות גרורתי התיישבות של מבני ספוט החלב בהצפק שומני

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation assay (hereafter called soft agar assay), which measures the ability of cells to proliferate in semi-solid matrices, remain a hallmark of cancer research. A key advantage of this technique over conventional 2D monolayer or 3D spheroid cell culture assays is the close mimicry of the 3D cellular environment to that seen in vivo. Importantly, the soft agar assay also provides an ideal tool to rigorously test the effects of novel compounds or treatment conditions on cell proliferation and migration. Additionally, this assay enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations. We recently identified peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. Here we highlight the utility of the soft agar assay for preclinical anti-cancer studies by testing the effects of the PADI inhibitor, BB-Cl-amidine (BB-CLA), on the tumorigenicity of human ductal carcinoma in situ (MCF10DCIS) cells.

Here, we document the use of the soft agar colony formation assay to test the effects of a peptidylarginine deiminase (PADI) enzyme inhibitor, BB-Cl-amidine, on breast cancer tumorigenicity in vitro.

ניצול של assay כינונה רך אגר מושבה לזיהוי מעכבי tumorigenicity בתאי סרטן השד

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.