בסרטון זה, אנו מתארים שיטה פשוטה ויעילה לדמיין ולנתח רפרטואר נוגדנים ברמה הגלובלית. ניתן לתאר רפרטוארים שלמים של תאי B אצל אנשים ואת השינויים הדינמיים שלהם בתגובה לגירוי חיסוני. שיטה זו יכולה להיות מיושמת כדי לנתח דגימות פתולוגיות מחולים של זיהומים ויראליים המתעוררים כדי לקבל את הנתונים עם תובנה חסרת תקדים לתוך הפתוגנזה של הזיהום.
אחד התחומים המרגשים ביותר עבור היישום הוא בקרת חיסון. יעילות החיסון יכולה להיות מוערכת על ידי ניתוח הדינמיקה של רפרטואר נוגדנים גלובלי אצל אנשים המנוהלים על ידי חיסונים. הפרט הם חדשים בשיטה זו ייתכן שיהיה צורך לייעל את תנאי PCR כי היעילות של הגברה גן נוגדנים תלוי בסוגי החומרים ההתחלתיים.
פלה-שר לזיהוי אמפילונים אימונוגלובולין. חשוב להדגים פעולות אלה באופן חזותי. הדגימו את ההליך יהיו מיס סיורי ימגוצ'י ומר הנבינג שו, טכנאי וסטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל בהליך זה, לנתח את הרקמה מעכבר שחור C57 בן שמונה שבועות ולהעביר אותו דרך רשת נירוסטה עם שני מיליליטר של PBS כדי להשיג תאים מפוזרים. מעבירים את ההשעיה התא לצינור מיקרוצנטריפוגה שני מיליליטר וצנטריפוגה ב 600 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והוסף 800 מיקרוליטרים של מאגר ליזילינג ACK לכדור.
דגירה על קרח במשך שתי דקות כדי לריס תאי הדם האדומים ברקמה. לאחר מכן, לשטוף את תאי הרקמה שלוש פעמים באמצעות שלושה מיליליטר של PBS עבור כל לשטוף. צנטריפוגה שוב ב 600 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
השליכו את העל-טבעי והוסיפו 800 מיקרוליטרים של ריאגנט פנול/גואנידין איסקיוצ'ינאט לכדור ולמערבולת ביסודיות. דגירה ב 25 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, מוסיפים 200 מיקרוליטרים של כלורופורם ומנערים ידנית למשך 15 שניות.
דגירה ב 25 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים g וב 25 מעלות צלזיוס כדי להפריד את השלבים. מעבירים את השלב הממימי העליון לצינור טרי.
הוסף אמצעי אחסון אחד של 70%אתנול. מערבולת בקצרה ולהחיל תערובת זו על עמוד ספין סיליקה. אלוט RNA עם 30 עד 100 microliters של מים.
לאחר מכן, השתמש פלואורומטר לכמת את ריכוז RNA הראשוני. אחסן את ה-RNA המטוהר במינוס 80 מעלות צלזיוס. ראשית, לסנתז את cDNA הגדיל הראשון משניים עד 10 מיקרוגרם של תבנית RNA הכוללת באמצעות פריימר CDS 5'RACE ואת oligonucleotide SMART-PCR על פי הוראות היצרן.
עבור אימונוגלובולין העכבר, PCR להגביר cDNA עם פולימראז DNA נאמנות גבוהה, באמצעות פריימר קדימה אוניברסלי פריימרים הפוכים ספציפיים בכיתה אימונוגלובולין, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. עבור האימונוגלובולין האנושי, בצע את ה- PCR הראשון באמצעות פריימר קדימה אוניברסלי פריימרים הפוכים ספציפיים בכיתה אימונוגלובולין עם רצפי תגים. כלול את רצפי האינדקס עבור כל מדגם לפי PCR שני באמצעות פריימרים של רצף אינדקסים.
לאחר מכן, אלקטרופורזה אחד המוצרים PCR על ג'ל 2%agarose. דמיינו את רצועות הדנ"א על טרנסילומינטור UV ובלו את פרוסת הג'ל המכילה את הרצועה הרחבה בין 600 ל-800 זוגות בסיסים. הוסיפו 10 מיקרוליטרים של תוסף מחייב קרום לכל 10 מיליגרם פרוסת ג'ל.
מערבבים ומטמיבים ב-50 עד 65 מעלות עד שפרוסות הג'ל מתמוססות לחלוטין. לאחר מכן, להעביר את פתרון הג'ל על עמוד ספין קרום סיליקה. לשטוף את העמוד פעם אחת עם חיץ כביסה ולחמק ה-DNA עם 50 microliters של מים ללא גרעין.
באמצעות פלואורומטר, לכמת את האמפיקונים מטוהרים בריכה אמפילונים מכל מחלקה אימונוגלובולין בכמויות שוות עבור רצף NGS. לאחר מכן, השתמש באלקטרופורזה מבוססת מיקרו-קפרית עם שבב גודל DNA כדי לקבוע את הגודל והריכוז של הספריות. אחסן את הספריות במינוס 20 מעלות צלזיוס.
תחילה, צור גיליון אלקטרוני לדוגמה של רצף הפעלה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הפשיר מחסנית רייגנט והספריות. הפוך פתרון נורמלי 0.2 של נתרן הידרוקסיד לדלל את הספריות כדי להשיג את הריכוזים התותחנים הרצויים.
לאחר מכן, לשטוף ולייבש את תא הזרימה ולהוסיף 600 microliters של פתרון הספרייה מדולל denatured לתוך הבאר של מחסנית reagent, ולהתחיל את הריצוף לרוץ. פרספקטיבה של רפרטואר נוגדנים מורין ככלל ניתן להשיג תאים או רקמות כגון הטחול, מח עצם, בלוטות הלימפה, או דם. תוצאות מייצגות של IgM, IgG1, IgG2c, ו רפרטואר שרשרת אור אימונוגלובולין מתוך טחול עכבר נאיבי מוצגים כאן.
בסידור מחדש של V(D)J על-ידי התוויה תלת-מימדית V(D)J, הגודל של כל כדור מייצג את המספר היחסי של קריאות. במילים אחרות, הוא מייצג את מספר mRNAs נוגדנים בתאי B שלמים. רשת 3D מורכב 110 גנים שרשרת כבדה אימונוגלובולין V, 12 גנים שרשרת כבדה immunoglobulin D, וארבעה גנים שרשרת כבדה אימונוגלובולין J, אשר מיושרים כדי לשקף את הסדר שלהם על כרומוזום.
העלילה 2D VJ מציג את הפרופיל של סידור מחדש VJ רפרטואר IGL. האורך של כל מייצג מייצג את המספר היחסי של קריאות. ציר ה-X מייצג 101 גנים של שרשרת אור אימונוגלובולין V-kappa, ושלושה גנים של שרשרת אור אימונוגלובולין V-lambda, וציר Y מייצג ארבעה גנים של שרשרת אור אימונוגלובולין J-kappa, ושלושה גנים של שרשרת אור אימונוגלובולין J-lambda.
פרספקטיבה של רפרטואר נוגדנים אנושי ככלל ניתן לנתח מרקמות שונות כולל תאים מונונוקלאריים בדם היקפיים או רקמות פתולוגיות. התוצאות הייצוגיות של IgM, IgG סה"כ, IgA הכולל, IgD, IgE, ו IgL רפרטוארים של תאים מונונוקלאריים בדם היקפי תקין מוצגים כאן. בדומה לדגם המורין, פרופיל הרפרטואר של סידור מחדש של V(D)J מוצג בעלילה תלת-מימדית של V(D)J שבה גודלו של כל כדור מייצג את המספר היחסי של קריאות.
רשת 3D מורכבת 56 גנים שרשרת כבדה אימונוגלובולין V, 27 גנים שרשרת כבדה אימונוגלובולין D, ושישה גנים שרשרת כבדה אימונוגלובולין J, מיושר בסדר שהם מופיעים על כרומוזום. הפרופיל של סידור מחדש של VJ ברפרטואר IgL מתואר בעלילה של VJ הדו-מימדי שבה האורך של כל מייצג מייצג את המספר היחסי של קריאות. ציר ה-X מייצג 41 גנים של שרשרת אור אימונוגלובולין V-kappa, ו-32 גנים של שרשרת אור אימונוגלובולין V-lambda, וציר ה-Y מייצג חמישה גנים של שרשרת אור אימונוגלובולין J-kappa, וחמישה גנים של שרשרת אור אימונוגלובולין J-lambda.
בחומר המחקר של פרוטוקול זה, מספר קטן של תאים ממוינים לפי ציטומטריה זרימה או אפילו cryosections של דגימות פתולוגיות הם שמיש. עם זאת, אופטימיזציה זהירה של תנאי PCR יהיה צורך. מכיוון שמידע התפוקה של פרוטוקול זה הוא עצום, אוריינות ביואינפורמטיקה תעזור למצוא את המבנה של רשת הנוגדנים.
זה יוביל ללא קשר להבנה עמוקה של המערכת החיסונית.
