טכניקה זו ממנפת מיקרוסקופיה מרובת פוטונים לסריקת לייזר בשילוב עם פוטוליזה של לייזר-פלאש של מולקולת ניקוטין פוטואקטיבית. המאפשר הפעלה מדויקת של קולטני כולין ניקוטין. טכניקה זו מאפשרת שליטה מרחבית עדין על יישום אגוניסט קולטן nicotinic, מתן כלי רב עוצמה לחקר דפוסי ביטוי תפקודי קולטן שידור סינפטית כולין או נפח.
לפני תחילת ההליך, השתמש במשוך פיפטה ניתן לתיכנת כדי למשוך מיקרופיגט זכוכית בקוטר פתיחה של 20 עד 40 מיקרומטר. מסננים כמיליליטר של פתרון הקלטה באמצעות מסנן 0.22 מיקרון. ולתלות מחדש מספיק ניקוטין פוטו-אקטיביזציה lyophilized בתת פתרון ההקלטה המסונן כדי להניב ריכוז סופי של שני מילימולים.
למילוי אחורי של מיקרופיגט היישום המקומי משך עם 50 microliters של התרופה photoactivatable, ולאבטח את פיפטה במחזיק פיפטה רכוב על מיקרומניפולטור. חבר את מחזיק פיפטה באמצעות אורך מתאים של צינורות למערכת פליטת לחץ המסוגלת להתקיים יישום בלחץ נמוך. ולהשתמש במיקרומניפולטור כדי לתמרן את פיפטה היישום המקומי לתוך פתרון הקלטה חוץ תאית.
מקם את קצה פיפטה מעט מעל מדגם רקמת המוח של העכבר, כ 50 מיקרומטר מתא העניין. ולזמן קצר להחיל אחד עד שני קילוגרמים לאינץ 'מרובע של לחץ על פיפטה. צריך להיות מינימום עד שום עקירה של התא של עניין.
לאחר השגת מהדק תיקון יציב שלם התא, להפעיל את היישום נמוך על מכשיר פליטת הלחץ, ולרווה את הרקמה המקיפה את התא עם ניקוטין photoactivatable במשך 1 עד 2 דקות. היישום המקומי מציג מורכבות נוספת לניסוי. אבל זה חוסך תרכובת ומאפשר ריכוזים גבוהים יותר של PA-Nic להיות מנוצל.
עבור יישום אמבטיה של ניקוטין photoactivatable, הראשון להמיס מספיק של התרופה lyophilized בנפח של פתרון הקלטה מתאים recirculation מתמשך לריכוז סופי 100 מיקרומולר. ותטעינה את התערובת שנוצרת למערכת חיסון. לאחר מכן התחילו בהשבתת תותבת הניקוטין הפוטואקטיבית בקצב של 1.5 עד 2 מילימטר לדקה, תוך שימוש באמבטים בקוטר פנימי מינימלי ובאורך כולל כדי למזער את נפח ההיקף הנדרש.
במהלך recirculation, ברציפות בועה הפתרון עם קרבוגן, ולשמור על טמפרטורת האמבטיה ב 32 מעלות צלזיוס בתנאי תאורה נמוכה. יישום אמבטיה נהנה הפשטות ואחידות של חלחלה PA-Nic של הרקמה. אבל זה בהכרח מנצל ריכוזי PA-Nic מיקרומולרים נמוכים יותר, ומ Expends כמויות כוללות גבוהות יותר של תרכובת.
להדמיה חיה של נוירון habenula המדיאלי, להשתמש אור משודר או אינפרא אדום הפרעה דיפרנציאלית ניגודיות אופטיקה ומצלמת וידאו כדי להקים יציב, כל התא תיקון מהדק הקלטה. לאחר יצירת התצורה המחוברת לתאים בעלי התנגדות גבוהה, אך לפני הפריצה, העבר את ההתקנה והתוכנה למצב סריקת לייזר. לאחר הפריצה, השתמש בסריקת לייזר כדי לוודא שצבע ההדמיה של העניין ממלא באופן פסיבי את הנוירון על ידי דיפוזיה.
אפשר לצבע למלא את התאים התאיים לפחות 20 עד 30 דקות לפני השימוש בפונקציית הסריקה החיה כדי לדמיין את הנוירון ואת תא העניין התת-תאי. בחר פרמטרי דימות המאפשרים תצוגה חזותית חיה מדויקת של התכונות העצביות, טיפול בהגדרות המתאימות כדי להשפיע או לשנות את התצוגה החזותית, הרזולוציה, יחס אות לרעש ותזמן רכישת מסגרת תמונה לפי הצורך. כדי לשפר את ניגודיות האות, פתח את חלון טבלת בדיקת המידע והתאם את הגדרות רצפת שולחן בדיקת המידע והתקרה.
כדי לאתר אזור עניין בתוך הרקמה, בחר את הזום האופטי 1X ולהשתמש בפקדי גלילה. השתמש בכלי סידרת Z כדי לבחור מיקום התחלה ו עצירה המכיל את תא העניין. קבעו גודל צעד של מיקרומטר אחד ובחרו גודל תמונה שיניב תמונה ברזולוציה הגבוהה ביותר.
לעתים קרובות 1, 024 על ידי 1, 024 פיקסלים לכל שורה. ואז ברציפות תמונה הנוירון בכל מישור Z המכיל את התא. כדי לכייל את גירוי הלייזר, התחל את סריקת המערכת עם כוח לייזר הדמיה גדול מהמינימום, וכוונן את המיקוד האובייקטיבי לשכבת הפלואורסצנטיות הדקה של הסמן האדום.
בחרו אזור בתוך שדה הפלואורסצנטיות נקי מפסולת ומצויד באופן שווה בסמן, פתחו את הכלים, הכיול ותפריט היישור כדי לבחור את פונקציית הגלבוקליברציה הבלתי משתנה. בצע את הדרכת כתמי הכוויה לכיול המרחבי של זוג המראה השני של גלוונומטר, בחירת לייזר 405 ננומטר, כוח גירוי לייזר של 400, ומשך גירוי של 20 אלפיות שנייה. כדי להניב חורים בקוטר 1 עד 5 מיקרומטר בסמן האדום.
בחר עדכן כדי לעורר ולרענן את התמונה לאחר שריפת הנקודה המרכזית, והזז את המחוון האדום העגול למיקום הנקודה בפועל של נקודות המרכז, המרכז-ימין והמרכז התחתון כדי לקבל רשת של תשע נקודות. כדי לבדוק את הכיול, פתח את חלון נקודות הסימון והפעל ידנית את פרמטרי הגירוי של הנקודות המוגדרות באזור חדש של המדגם, תוך טיפול טען של קובץ הכיול העדכני ביותר הנכון לחלון נקודות הסימון. לאחר מכן החל פעימת בדיקה כדי לאמת את הכיול הנכון.
כדי לתדמיין ולאתר בקצרה את אזור העניין התת-תאי, בחר סריקה חיה ולהשתמש בהגדלת הזום האופטי כדי לדמיין מבנים קטנים לפי הצורך. מקם את הכוונת החד-נקודתית של נקודת הסימון הסמוכה מיד לממברנה של התא והגדר את פרמטרי הפוטו-טימוזיה למשך של 1 עד 50 אלפיות שנייה, כוח לייזר של 1 עד 4 מילי-וואט ולפחות משפט אחד. לאחר מכן בחר נקודות סימון ריצה כדי ליזום את פרוטוקול נקודות הסימון, ובחן את רכישת הנתונים האלקטרופיזיולוגיים בזמן אמת.
פוטואקטיביות ניקוטין 2PE פלואורסצנטיות של PA-Nic מילימולר אחד מזוהה בקלות במהלך פליטת לחץ מ pipette יישום מקומי כפי שהודגם. בעוד שהמשלוח של המוצרים הפפוטוכימיים העיקריים של תגובת הניקוטין פוטוליזה פוטואקטיבית אינו יוצר אות פלואורסצנטי באותו ריכוז ועוצמת עירור ואורך גל. הדגמת הספציפיות של תוצאות הניקוטין photoactivatable.
הדמיה של ניקוטין photoactivatable להחיל על רקמת המוח כפי שהוכח מגלה את נוכחותה של התרופה בתוך 100 עד 200 מיקרומטר של פיפטה היישום המקומי. אישור כי ניקוטין photoactivatable יכול להיות מועבר ביעילות לרקמת המוח באמצעות יישום מקומי. כאן מוצגות תמונות באיכות גבוהה שבהן המורפולוגיה העצבית הושלמה, הרעש ממוזער והפסולת אינה מפריעה לפרשנות המורפולוגיה התאית.
תמונות אלה, לעומת זאת, הן באיכות נמוכה יותר. בשל יחס אות-לרקע נמוך יותר ופסולת משמעותית. זיווג מיקרוסקופיה סריקת לייזר שני פוטון של נוירונים habenula המדיאלי בפרוסות המוח עם פוטוליזה פלאש לייזר של PA-Nic כפי שהוכח, מאפשר התאמה של תגובות אלקטרופיזיולוגיות עם מורפולוגיה הסלולר.
פוטוליזה של נקודה אחת המבוצעת במרווחים של 10 שניות מאפשרת זמן התאוששות מספיק עבור זרם ההחזקה הבסיסי. בעוד מרווח קצר יותר של שנייה אחת מוביל לעלייה הדרגתית בזרם האחזקה ככל שהפרוטוקול ממשיך. מה שמרמז כי לניקוטין אין מספיק זמן להתפזר הרחק מהמערכת עם המרווחים הקצרים יותר.
בתכנון ניסויים המשתמשים במולקולות פוטואקטיביות, חשוב לזכור לבחור אינדיקטורים פלואורסצנטיים ולדווח על פלואורופורים עם ספקטרום פליטת עירור תואם. PA-Nic תואם את רוב הפלואורופורים הנפוצים בשל שיא הפוטוליזה באורך הגל הקצר שלו. בעת בחירת טכניקת היישום המתאימה ביותר PA-Nic, חשוב לשקול בזהירות את הביטוי הפונקציונלי, פעילות פיזיולוגית של הקולטנים nicotinic בנוירונים של עניין.
ניצול מיומן של טכניקה זו מאפשר שליטה מרחבית עדינה של יישום ניקוטין, המאפשר אפשרויות חדשות ומלהיבות לחקר הקינטיקה של מעורבות קולטן ניקוטיני מקומי, לוקליזציה תת תאית, ואפנן של פעילות עצבית על ידי הפעלת קולטן ניקוטיני.
