שיטה זו יכולה לעזור לפענח את השלבים בחילופי גדילי DNA וחושפת את תפקידי המולקולה של חלבונים שונים המעורבים בשילוב במהלך התיקון. בעזרת טכניקה זו אנו יכולים לפקח על חילופי גדילי DNA בזמן אמת ללא כל הפרעה לתגובה ולהשתמש באולם הניתוח כדי לקבוע את הקינטיקה של כל שלב תגובה. עם כמה התאמות קלות, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד את הפעילויות של חלבונים רקומבנציה מטוהרים שמקורם מינים אחרים, כגון יונקים וצמחים.
הדגמת ההליך תהיה קנטארו איטו, פוסט דוק מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, הכן את מאגר התגובה A בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להוסיף 36 ננומול 16FA-oligonucleotide למאגר עבור בדיקת זיווג DNA.
הדגירה את התערובת ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. מוסיפים חלבון RAD-51 בריכוז סופי של 1.5 מיקרו שומות לתערובת ומאדרים אותו ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. מוסיפים חלבון SWI5-SFR1 בריכוז סופי של 0.15 מיקרו שומות לתערובת, ומדגרים אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות נוספות.
מעבירים 1.5 מיליליטר של התערובת ב 1.0 על ידי 1.0 cuvette קוורץ המכיל ערבוב מגנטי. מכניסים את ה cuvette לתוך ספקטרופלואורומטר ולהמשיך להתאים את בקר הטמפרטורה ואת stirrer מגנטי. רשום את השינוי ב פליטת פלואורסצנטיות FAM ב 525 ננומטר עם העירור ב 493 ננומטר במרווחים של שנייה אחת במשך 100 שניות.
לבסוף, עם מזרק, להזריק ROX שכותרתו דנ"א כפול תקוע בריכוז הסופי של 36 ננו שומות לתוך cuvette. רשום את השינוי ב פליטת פלואורסצנטיות במרווחים של שנייה אחת במשך 30 דקות. כדי להשוות את ספקטרום הפלואורסצנטיות בין המצעים לבין המוצרים הסופיים, הכנס כל קובט המכיל את 16 ה- FA-oligonucleotides עם או בלי RAD-51 לספקטרופלואורומטר ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
לאחר מכן, להקליט את פליטת פלואורסצנטיות FAM ב 500 כדי 600 ננו מטרים על העירור ב 493 ננומטר. כדי לבדוק את ההשפעה של RAD-51 על ספקטרום הפלואורסצנטיות, להוסיף RAD-51 בריכוז סופי של 1.5 שומות מיקרו. ו דגירה את התערובת ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
לבסוף, להקליט את ספקטרום פלואורסצנטי מ 500 כדי 600 ננומטר על העירור ב 493 ננומטר. היעילות המרבית של FRET מתקבלת על ידי מדידת הירידה המרבית בעוצמת הפלואורסצנטיות כאשר כל מצע הדנ"א החד-גדילי מומר לדנ"א דו-גדילי בבדיקת הזוגות. או על ידי מדידת העלייה המרבית בעוצמה כאשר כל מצע הדנ"א הדו-גדילי מומר לדנ"א חד-גדילי בבדיקת התזוזה.
בשני המקרים, תוספת של חלבון RAD-51 לא השפיעה על פליטת פלואורסצנטיות של FAM, או על יעילותה המהבהב על ידי סלעים. ההשפעות של התגובות הספונטניות בין DNAs מצע הלבנת התמונה הבאים הם קטנים. כפי שמוצג על ידי השינויים הזניפים בהפחתת FAM ללא RAD-51, בהשוואה לשינויים המהותיים שנראו עם RAD-51.
הוספת קומפלקס SWI5-SFR1 מעוררת מאוד את פעילות השיוך של RAD-51. תגובת הזוג מדומה באמצעות מודל תלת-שלבי, המורכב מהיווצרות הביניים הראשון בעל שלושת הגדילים, מעבר לתוך הביניים השני ושחרור הדנ"א החד-גדילי והיווצרות הדופלקס ההטרו. השוואה בין מודל שלושת השלבים למודל דו-שלבי מצביעה על כך שמודל שלושת השלבים מתאים יותר להדמיית זיווג דנ"א, ללא או עם קומפלקס SWI5-SFR1.
קבוע שיווי המשקל המחושב של כל שלב תגובה, עם או בלי SWI5-SFR1, מראה כי קומפלקס SWI5-SFR1 אינו מגרה את היווצרות הביניים הראשון בעל שלושת הגדילים, אך מגרה מאוד את המעבר בין שני מתווכים בעלי שלושה גדילים, ואת שחרורו של דנ"א SS. זה חיוני כדי לוודא כי כל אצווה של חלבון מטוהר הוא ללא גרעין וזיהום הליקלאז.
