この方法は、DNA鎖交換のステップを解読するのに役立ち、修復中に組み合わせに関与する異なるタンパク質の分子役割を明らかにすることができます。この技術により、反応を中断することなくDNA鎖交換をリアルタイムで監視し、手術室を使用して各反応ステップの動態を決定することができます。いくつかの微調整を用いて、この技術は、哺乳類や植物などの他の種に由来する精製再結合タンパク質の活動を研究するために適用することができる。
この手順のデモンストレーションは、私の研究室のポストドックであるイト健太郎です。開始するには、テキストプロトコルに従って反応バッファAを準備する。次に、DNA対ペアリングアッセイ用のバッファーに36ナノモル16FAオリゴヌクレオチドを加える。
37°Cで5分間インキュベートします。混合物に1.5マイクロモルの最終濃度でRAD-51タンパク質を加え、5分間摂氏37度でインキュベートします。混合物に0.15マイクロモルの最終濃度でSWI5-SFR1タンパク質を加え、さらに5分間摂氏37度でインキュベートします。
磁気スターラーを含む1.0 cmの石英キュベットで1.5ミリリットルの混合物を移す。キュベットを分光フルオロメーターに挿入し、温度コントローラと磁気攪拌機の調整に進みます。493ナノメートルでの励起時に525ナノメートルでFAM蛍光放射の変化を100秒間1秒間記録します。
最後に、注射器で、36ナノモルの最終濃度で標識されたROX標識された二本鎖DNAをキュベットに注入する。蛍光発光の変化を1秒間隔で30分間記録します。基質と最終製品の間の蛍光スペクトルを比較するには、RAD-51の有無にかかわらず16個のFAオリゴヌクレオチドを含む各キュベットを分光蛍光計に挿入し、摂氏37度で5分間インキュベートします。
次に、493ナノメートルで励起した時に500〜600ナノメートルでFAM蛍光放射を記録する。蛍光スペクトルに対するRAD-51の効果をテストするには、RAD-51を最終濃度の1.5マイクロモルで追加します。そして、5分間摂氏37度で混合物をインキュベートします。
最後に、493ナノメートルの励起時に500〜600ナノメートルの蛍光スペクトルを記録します。最大FRET効率は、全ての一本鎖DNA基質がペアリングアッセイで二本鎖DNAに変換された場合の蛍光強度の最大低減を測定することによって得られる。または、変位アッセイにおいて全ての二本鎖DNA基質が一本鎖DNAに変換されたときの強度の最大増加を測定する。
どちらのアッセイにおいても、RAD-51タンパク質の添加は、FAMの蛍光発光、または岩石による焼入れ効率に影響を及ぼさなかった。基質DNAとその後の写真の漂白との自然反応の影響は小さい。RAD-51を使用しないFAMの発光のわずかな変化によって示されるように、RAD-51で見られる実質的な変化と比較した。
SWI5-SFR1複合体を追加すると、RAD-51のペアリング活性が強く刺激されます。この対合反応は、第1の3本鎖中間体の形成、第2中間体への移行、および一本鎖DNAの放出およびヘテロ二重鎖の形成からなる3段階モデルを用いてシミュレートされる。3ステップモデルと2ステップモデルの比較は、SWI5-SFR1複合体を使用せずに、DNAペアをシミュレートするのに3段階モデルが適していることを示しています。
各反応ステップの算出された平衡定数は、SWI5-SFR1の有無にかかわらず、SWI5-SFR1複合体が最初の3本鎖中間体の形成を刺激せず、2つの三鎖中間体とSS DNAの放出を強く刺激することを示している。精製タンパク質の各バッチにヌクレアーゼおよびヘリケース汚染がないことの確認が不可欠です。
