Este método pode ajudar a decifrar os passos na troca de fios de DNA e revela os papéis da molécula de diferentes proteínas envolvidas na combinação durante o reparo. Com esta técnica podemos monitorar a troca de fios de DNA em tempo real sem qualquer interrupção na reação e usar o teatro operacional para determinar a cinética de cada passo de reação. Com alguns pequenos ajustes, essa técnica pode ser aplicada para estudar as atividades de proteínas purificadas de recombinação derivadas de outras espécies, como mamíferos e plantas.
Demonstrando o procedimento será Kentaro Ito, um Post Doc do meu laboratório. Para começar, prepare o buffer de reação A de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, adicione 36-nanomole 16FA-oligonucleotídeo ao buffer para o ensaio de emparelhamento de DNA.
Incubar a mistura a 37 graus Celsius por cinco minutos. Adicione a proteína RAD-51 em uma concentração final de 1,5 micro mols à mistura e incuba-a a 37 graus celsius por cinco minutos. Adicione a proteína SWI5-SFR1 a uma concentração final de 0,15 micro mols à mistura, e incuba-a a 37 graus Celsius por mais cinco minutos.
Transfira 1,5 mililitros da mistura em uma cuvette de quartzo de 1,0 por 1,0 cm contendo um agitador magnético. Insira a cuvette em um espectrofluorômetro e prossiga para ajustar o controlador de temperatura e o agitador magnético. Regissei a alteração na emissão de fluorescência famácida em 525 nanômetros após excitação em 493 nanômetros em intervalos de um segundo por 100 segundos.
Finalmente, com uma seringa, injete ROX rotulado DNA de dupla cadeia em uma concentração final de 36 nano toupeiras no cuvette. Regissore a variação da emissão de fluorescência em intervalos de um segundo por 30 minutos. Para comparar o espectro de fluorescência entre os substratos e os produtos finais, insira cada cuvette contendo os 16 fa-oligonucleotídeos com ou sem RAD-51 em um espectrofluorômetro e incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos.
Em seguida, regise a emissão de fluorescência fam de 500 a 600 nanômetros após a excitação em 493 nanômetros. Para testar o efeito do RAD-51 no espectro da fluorescência, adicione RAD-51 em uma concentração final de 1,5 micro mols. E incubar a mistura a 37 graus Celsius por cinco minutos.
Finalmente, registos o espectro de fluorescência de 500 a 600 nanômetros após excitação em 493 nanômetros. A eficiência máxima do FRET é obtida medindo a redução máxima da intensidade da fluorescência quando todo substrato de DNA de uma única faixa é convertido em DNA de dupla renda no ensaio de pareamento. Ou medindo o aumento máximo da intensidade quando todo substrato de DNA de dupla fita é convertido em DNA de um único fio no ensaio de deslocamento.
Em ambos os ensaios, a adição de proteína RAD-51 não afetou a emissão de fluorescência da FAM, nem sua eficiência saciante pelas rochas. Os efeitos das reações espontâneas entre DNAs substratos e o branqueamento fotográfico subsequente são pequenos. Como mostrado pelas mudanças insignificantes na emissão de FAM sem RAD-51, em comparação com as mudanças substanciais vistas com o RAD-51.
A adição do complexo SWI5-SFR1 estimula fortemente a atividade de pareamento do RAD-51. A reação de emparelhamento é simulada usando um modelo de três etapas, consistindo na formação do primeiro intermediário de três fios, transição para o segundo intermediário, e liberação do DNA de um único fio e formação do hetero duplex. Uma comparação do modelo de três etapas com um modelo de duas etapas indica que o modelo de três etapas é mais adequado para simular o emparelhamento de DNA, sem ou com o complexo SWI5-SFR1.
A constante de equilíbrio calculada de cada passo de reação, com ou sem SWI5-SFR1, mostra que o complexo SWI5-SFR1 não estimula a formação do primeiro intermediário de três fios, mas estimula fortemente a transição entre os dois intermediários de três fios, e a liberação do DNA SS. É essencial verificar se cada lote de proteína purificada está livre de contaminação nuclease e helicase.
