이 방법은 DNA 가닥 교환의 단계를 해독하고 수리 하는 동안 조합에 관련 된 다른 단백질의 분자 역할을 공개 하는 데 도움이 수 있습니다. 이 기술을 통해 우리는 반응에 차질없이 실시간으로 DNA 가닥 교환을 모니터링하고 각 반응 단계의 운동을 결정하기 위해 수술극장을 사용할 수 있습니다. 약간의 조정으로, 이 기술은 포유류 및 식물과 같은 그밖 종에서 파생된 정제된 재조합 단백질의 활동을 연구하기 위하여 적용될 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 포스트 닥터 인 이토 켄타로가 될 것입니다. 먼저 텍스트 프로토콜에 따라 반응 버퍼 A를 준비합니다. 다음으로, DNA 페어링 분석에 대한 완충제에 36나노몰 16FA-올리고뉴클레오티드를 첨가한다.
혼합물을 섭씨 37도에서 5분간 배양합니다. 혼합물에 1.5 마이크로 두더지의 최종 농도에 RAD-51 단백질을 추가하고 5 분 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. SWI5-SFR1 단백질을 혼합물에 0.15 마이크로 두더지의 최종 농도로 추가하고 추가 로 5 분 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오.
자기 교반기를 포함하는 1.0 x 1.0cm 석영 큐벳에 혼합물의 1.5 밀리리터를 전달합니다. 큐벳을 분광계에 삽입하고 온도 조절기와 자기 교반기를 조정합니다. 1초 간격으로 493 나노미터에서 493 나노미터에서 1초 간격으로 525 나노미터에서 FAM 형광 방출의 변화를 기록한다.
마지막으로, 주사기와 함께, CUvette에 36 나노 두더지의 최종 농도에서 이중 좌초 DNA로 표시 ROX를 주입. 형광 방출의 변화를 1초 간격으로 30분 동안 기록합니다. 기판과 최종 제품 사이의 형광 스펙트럼을 비교하려면 RAD-51 의 유무에 관계없이 16 개의 FA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 각 큐벳을 분광계에 삽입하고 5 분 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오.
이어서, 493 나노미터에서 발아시 500 내지 600 나노미터에서 FAM 형광 방출을 기록한다. 형광 스펙트럼에 RAD-51의 효과를 테스트하려면, 1.5 마이크로 두더지의 최종 농도에 RAD-51을 추가합니다. 그리고 혼합물을 섭씨 37도에서 5분간 배양합니다.
마지막으로, 493 나노미터에서 흥분시 500~600나노미터의 형광 스펙트럼을 기록한다. 모든 단일 가닥 DNA 기판이 페어링 분석에서 이중 좌초 DNA로 변환될 때 최대 FRET 효율은 형광 강도의 최대 감소를 측정함으로써 얻어진다. 또는 모든 이중 좌초 된 DNA 기판이 변위 분석에서 단일 좌초 DNA로 변환 될 때 강도의 최대 증가를 측정함으로써.
두 연구서에서 RAD-51 단백질을 첨가하면 FAM의 형광 방출이나 암석에 의한 담금질 효율에 영향을 미치지 않았습니다. 기판 DNA와 후속 사진 표백 사이의 자발적인 반응의 효과는 작습니다. RAD-51없이 FAM의 방출에 무시할 수있는 변화에 의해 표시된 바와 같이, RAD-51로 볼 수있는 실질적인 변화에 비해.
SWI5-SFR1 컴플렉스를 추가하면 RAD-51의 페어링 활성을 강하게 자극합니다. 페어링 반응은 첫 번째 3가닥 중간체의 형성, 제2 중형으로의 전환, 단일 가닥 DNA의 방출 및 이종이중의 형성으로 구성된 3단계 모델을 사용하여 시뮬레이션된다. 3단계 모델과 2단계 모델을 비교하면 3단계 모델이 SWI5-SFR1 복합체가 없거나 결합된 DNA 페어링을 시뮬레이션하는 데 더 적합하다는 것을 나타냅니다.
SWI5-SFR1 유무에 관계없이 각 반응 단계의 계산된 평형 상수는 SWI5-SFR1 복합체가 첫 번째 3가닥 중간체의 형성을 자극하지 않고 두 3가닥 중간체 사이의 전환을 강하게 자극하고 SS DNA의 방출을 나타낸다. 정제 된 단백질의 각 배치는 핵과 헬리콥터 오염이 없는지 확인하는 것이 필수적입니다.
