הערכת הפעילות האנטי-סרטנית In vivo של ננו-חלקיקים פוליאנהידריד IL-1α

פרוטוקולים אלה מספקים דרך יעילה לחקור את הפעילות האנטי-סרטנית של התקפות אפנן חיסוני. יתר על כן, ניתוח הסיכויים הקשורים בציטוקינים במחזור ובאוכלוסיות תאי החיסון יכול להיעשות באמצעות שיטות מוצעות אלה. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שזו דרך קלה וישירה להשתיל גידול ולעקוב אחר צמיחתו. המשמעות הישירה של טכניקה זו היא להעריך את יעילותם של טיפולים או אתגרים מסוימים במחקר נגד סרטן. בנוסף, היבטים מסוימים של טכניקות אלה מתאימים למחקרי רעילות. כדי להתחיל, להפשיר בקבוקון קפוא של תאי EERL מורין באמבט מים שחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס ולהעביר אותם צינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל מדיה תרבית חמה. צנטריפוגה את הצינור החרוטי ב 277 פעמים G במשך חמש דקות ב 25 מעלות צלזיוס כדי להסיר את התקשורת. לאחר מכן השהה מחדש את חיך התא בשלושה עד חמישה מיליליטר מדיה טרייה והעבר אותו לצלוחית תרבית תאים T25. תנו לתאים לגדול באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני, התרחבו לצלוחיות גדולות יותר ועברו כל שלושה ימים. כאשר יש מספיק תאים להשתלה הרצויה לכל העכברים, הסירו את הצלוחיות, השליכו את המדיה ושטפו בעדינות את התאים PBS. לאחר מכן להוסיף ארבעה מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA ולדגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. הוסף מדיה טרייה כדי לעצור את תגובת הטריפסין ולאסוף את תרחיף התא בצינורות חרוטי 50 מיליליטר. השהה מחדש את התאים במדיה חדשה וספור את התאים. צנטריפוגה פעם נוספת, ואז להוסיף PBS קר לתאים כדי ליצור ריכוז סופי של 10 מיליון תאים למיליליטר. שמור את תרחיף התא על קרח לפני ההזרקה. יש לחטא את אזור האגף עם כרית אתנול. כדי להזריק תרחיף תאים לעכברים, שאפו 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים לתוך המזרק והוציאו את כל הבועות והחלל המת מלמעלה. לאחר מכן הזריקו את תרחיף התאים באופן תת עורי בצורה איטית ויציבה לעכברים מורדמים. הכניסו את בעלי החיים לכלובים שלהם והשגיחו עליהם עד שיתאוששו מההרדמה. כדי לאסוף דם, אחוז את העור הרפוי מעל הכתף באמצעות היד הלא דומיננטית ולנקב את הווריד submandibular עם מחט 18 מד או lancet. לאסוף 200 עד 300 מיקרוליטר של דם לתוך 1.5 מיליליטר פוליפרופילן מיקרו צנטריפוגה צינור או צינור מפריד בסרום. לאחר איסוף הדם, יש להפעיל לחץ עדין על אתר הניקוב עד להפסקת הדימום. החזירו את העכברים לכלובים שלהם והתבוננו עד שיתאוששו מההרדמה. תן את הדם שנאסף להיקרש בטמפרטורת החדר במשך 20 עד 30 דקות. לאחר מכן הניחו את הצינורות על קרח עד שהם מוכנים לצנטריפוגה. צנטריפוגות הדם הקרוש ב 1, 540 פעמים G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, בזהירות לאסוף את שכבת הסרום מלמעלה. הפשירו את דגימות הסרום או הפלזמה תוך שמירה עליהן על קרח. לאחר מכן, צנטריפוגו את הדגימות ב 1, 540 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, כדי לשקוע כל פסולת התא בזהירות לאסוף את שכבת הסרום מלמעלה. מניחים את ערכת המרבב בטמפרטורת החדר ומבצעים את הבדיקה בהתאם לפרוטוקול היצרן. הניחו כל עכבר על גבו ורססו 70% אתנול על העור באזור הבטן. השתמש במלקחיים ובמספריים כדי לחתוך את בלוטת הלימפה מהצד הימני של העכברים ואת הגידול החוצה מצד שמאל. אם הגידול גדול, לחתוך אותו לחתיכות קטנות ולקחת כ 500 עד 600 מיליגרם מן הרקמה. הניחו את הרקמות על צינורות הדיסוציאטור המתאימים המכילים שלושה עד חמישה מיליליטר של מדיית RPMI. הומוגניזציה של הרקמה באמצעות דיסוציאטור אוטומטי. לאחר הומוגניזציה, מסננים את תרחיף התא דרך מסנן 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. צנטריפוגה ב 277 פעמים G במשך חמש דקות ב 25 מעלות צלזיוס כדי להסיר את התקשורת. לשטוף ולהשעות מחדש את התאים במיליליטר אחד עד שניים של PBS קר. השתמש 0.4% טריפסין כחול צביעה, כדי לספור את התאים קיימא המוציטומטר.חשב את הנפח הדרוש כדי לקבל שניים עד שלושה מיליון תאים ולהעביר אותם לשפופרת הפקס המתאימה. צנטריפוגה ספרה תאים ב 277 פעמים G במשך חמש דקות ב 25 מעלות צלזיוס.דקנט את supernatant ו resuspend את התאים לתוך 300 מיקרוליטר של PBS. הוסיפו 0.5 למיקרוליטר אחד של צבע זומבי לכל צינור ודגרו בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות בחושך. צנטריפוגה של התאים שטפו אותם עם מיליליטר אחד עד שניים של מאגר פקס והשעו אותם מחדש לתוך 200 מיקרוליטר של מאגר פקס. הוסף חוסם קולטן FC בהתאם לפרוטוקול היצרן ודגר על התאים במשך 10 דקות. צנטריפוגה שוב בהגדרות שתוארו קודם לכן ולשטוף את התאים עם מיליליטר אחד עד שניים של מאגר פקס. מוסיפים את קוקטייל הנוגדנים ודגרים במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך. לאחר הדגירה, צנטריפוגה ולשטוף את התאים עם מיליליטר אחד עד שני מיליליטר fax buffer. הוסף 300 עד 400 מיקרוליטר של תמיסת 2% paraformaldehyde, והשהה מחדש לקיבוע. לאחסן את התאים במשך כמה ימים בארבע מעלות צלזיוס או לנתח מיד על ידי ציטומטר זרימה צבעוני. במחקר זה, הפעילות האנטי-סרטנית של פוליאנהידריד IL-1