פרוטוקול זה מציג MALs חילופי יון, שיטה חדשנית לבקרת איכות חלבון ואפיון, בקרת איכות חיונית עבור עקביות ושלמות של תוצאות במחקר מדעי החיים ופיתוח מוצרים פרמצבטיים. Ion-exchange MALS קובע טוהר חלבון, מצב אוליגומרי, הומוגניות, זהות, קונפורמציה, מבנה, שינויים שלאחר התרגום, ומאפיינים אחרים. המדידות אינן הרסניות והן נעשות בפתרון בתנאי מאגר כמעט פיזיולוגיים.
שיטה זו קובעת במדויק מסה טוחנת של חלבונים או פפטידים, המצב האוליגומרי, ואת מידת ההטיה, למשל, גליקופרוטאינים. זה יכול להיות מיושם גם על חלבוני קרום. IEX מפרידה בין מקרומולקולים באמצעות טעינת פני השטח שלהם.
חילופי אניון, AIEX וחילופי יון, CIEX, מטריצות נקשרות גרסאות טעונות באופן שלילי וחיובי, בהתאמה. עם הפרדה עדין בין אוכלוסיות חלבון שחולקים מסה או צורה קרובה יחסית, IEX-MALS קובע בהצלחה את המסה הטוסורה של כל מצב חלבון בדגימה של תערובת. כדי להתחיל, השתמש במסנן 0.1 מיקרומטר כדי לסנן את כל הריג'ים, כולל מאגרי הכביסה והאלוטיון.
סנן את 50 עד 100 המיליליטרים הראשונים של המאגר לבקבוק פסולת כדי למנוע חלקיקים מהמסנן היבש. בבקבוק נקי וסטרילי שנשטף ביסודיות במים מסוננים וכתר כדי למנוע כניסת אבק, סנן את שאר המאגר. עם חיץ טריס pH-8 ונתרן כלוריד 50 מילימולאר, לדלל מדגם BSA לשישה מיליגרם למיליליטר כך pH וכוח יוני יאפשר מחייב לעמודת חילופי יונים.
השתמש במזרק כדי להזריק לפחות 0.3 עד 0.5 מיליגרם של BSA לעמודה של מיליליטר להשגת ניתוח MALS באיכות טובה. להתחלת ניסוי MALS לחילופי יון, פתחו את New, Experiment from Method בתוכנת MALS ובחרו בשיטה המקוונת מתווית שיטות המערכת של פיזור האור. אם מודול DLS זמין ויש לרכוש נתוני DLS, בחר את השיטה המקוונת מתוך תיקיית המשנה פיזור אור, עם QELS.
כדי להגדיר את הפרמטרים, תחת המקטע תצורה, הגדר תחילה את קצב הזרימה של הריצה במקטע משאבה כללית לקצב הזרימה המשמש ב- FPLC כ- 1.5 מיליליטר לדקה. תחת המקטע ממס, הזן או אמת את פרמטרי המאגר. תחת סעיף מזרק, הזן את שם החלבון כמו BSA, מדד שבירה תוספת קבועה כמו 0.185 מיליליטר לגרם, ואת מקדם הכחדת UV באורך הגל של 280 ננומטר כמו 0.66 ליטר לגרם לס"מ.
בכרטיסיה דגימה, הזן את הריכוז של דגימת החלבון כמו שישה מיליגרם למיליליטר, ולאחר מכן להכניס את נפח המדגם להזרקה כמו 170 microliters גם כן. תחת המקטע שגרות, בכרטיסיה אוסף בסיסי, בחר בתיבת הסימון גורם מפעיל בהזרקה אוטומטית והגדר את משך הריצה ל- 70 מיליליטר כך שאיסוף הנתונים יימשך לפחות חמש דקות לאחר שהמילוי ההדרגתי יגיע לערך הסופי שלו. לאחר מכן, בתוכנת FPLC, צור ניסוי חדש בכרטיסיה עורך שיטות.
לניסוי הראשוני, צור שיפוע ליניארי של מלח או pH, ואילו עבור השיטה האופטימלית ליצור שיפוע ספציפי יותר או תוכנית צעד אחר צעד על פי כתב היד. כלול אות דופק בשיטה שתפעיל איסוף נתונים בתוכנת MALS. לאחר מכן, לפתוח את שסתום המשאבה, ולשטוף עם 0.5-טוחן נתרן הידרוקסיד כדי להסיר זיהומים כבולים בחוזקה, ואחריו לשטוף חיץ נטרול.
לאחר מכן, לשטוף את העמודה עם טריס חיץ pH שמונה, שסתום A עם חיץ כביסה, ואת שסתום B עם חיץ אלוטיום. השתמש במאגר הכביסה עם ריכוז המלח הנמוך ככביסה סופית כדי לשטוף את העמודה, כדי לאפשר את כריכת החלבון למטריצת העמודים. לפני הזרקת הדגימה, לאחר הכביסה, ובסוף האלוטיון, יש לייצב את בסיס פיזור האור כדי להבטיח רעש נמוך ודילול טהור לחלוטין.
בעזרת מזרק, מניחים את דגימת החלבון בלולאה. התחל את הניסוי תחילה בתוכנת MALS על ידי לחיצה על לחצן הפעל ולאחר מכן בתוכנת FPLC. הנתונים ייאספו לאחר קבלת אות הדופק ממכשיר FPLC באמצעות גלאי MALS.
אם ה- MALS של חילופי היונים מבוצע באופן ידני עם מצב זרימה רציף במקום עם שיטה עצמאית, החל את אותם פרמטרים של הריצה והוראות כפי שתואר קודם לכן. לאחר אימות והפעלה של השיטה הסופית, בצע בדיוק את אותה שיטה באמצעות הזרקה ריקה על-ידי טעינת מאגר במקום הדגימה. חשוב כי התזמון בין הדופק להזרקה אוטומטית לבין שיפוע הריצה הריקה זהה לזה של הריצה לדוגמה.
כדי להתחיל בניתוח, תחת המקטע הליכים בתוכנת MALS, השתמש בכרטיסיה Despiking וברמה Normal כדי להחליק את הכרומטוגרמות. אם הם מציגים הרבה רעש, להגדיר את הרמה כבד. בתצוגה בסיסית, הגדר את קו הבסיס עבור כל האותות, כולל גלאי LS, UV ו- RI.
בתצוגה פיקס, הגדר את הפסגות לניתוח. ודא את הערכים הנכונים של מקדם ההכחדה של ערך ההפרש הקבוע של RI dn/dc ו- UV עבור החלבון מתחת לכל שיא. תחת המסה והרדיוס Molar מתצוגת פיזור אור, לנתח את המסה הטהבה ואת הרדיוס באמצעות מודל Zimm ו להתאים מידה של אפס.
אם QELS זמין, תחת התצוגה Rh מ- QUELS, התבונן בערכי Rh ובאיכות מתאים לפונקציית המתאם. אות RI משתנה באופן משמעותי במהלך ריצת MALS חילופי יון עקב הגידול בריכוז המלח. כדי להחסיר את אות הבסיס מההזרקה הריקה, פתחו הן את ניסויי החלבון והן את ניסויי ה-MALS הריקים של חילופי היונים.
לחצו לחיצה ימנית על שם ניסוי החלבון, בחרו 'החל שיטה' ובחרו בתיקייה 'חיסור בסיסי' מ בתיבת הדו-שיח של הקובץ. בחר את השיטה המקוונת לניתוח מסה מוטחנת סטנדרטית. תחת התצוגה חיסור בסיסי, לחץ על ייבוא ריק כדי לייבא את האותות של הריצה הריקה.
תחת מכשירים, לבדוק את כל הגלאים כדי לחסר. כדי לכייל את מערכת ה-MALS של חילופי היונים עם מונומר BSA, תחת תצוגת פרוצדורות ותצורה, יישר את הפסגות. תחת תצוגת נורמליזציה, הזן 3.0 ננומטר כערך Rg כדי לבצע נורמליזציה.
לאחר מכן, תחת הרחבת Band באותה כרטיסיית תצורה, בחר את השיא ולהשתמש בלחצן בצע התאמה כדי להתאים את אותות UV ו- LS לאות RI. גרף התוצאות מוצג בתצוגה 'התאמת תוצאות'. שנה את סרגלי הציר ופרמטרי תרשים אחרים על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על הגרף, בחירה באפשרות עריכה ולאחר מכן לחיצה על לחצן מתקדם.
כדי לקבל אפשרויות תצוגה נוספות, בחר בכרטיסיה גרף EASI, ובחלק העליון של החלון בתפריט הנפתח תצוגה, בחר תוצאות מסה טוחה או Rh Q.All, כולל מסה טוחנת, רדיוס, רמת טוהר ואחרות זמינות בתצוגה דוח תחת המקטע תוצאות. השתמש בלחצן מעצב הדוחות כדי להוסיף תוצאות או פרמטרים נוספים, כמו גם איורים, לדוח. בניסוי זה, BSA נותח על MALS חילופי יון באמצעות עמודה אנליטית חילופי אניון.
הכרומטוגרמות הציגו את ה-UV ב-280 ננומטר, פיזור אור בזווית של 90 מעלות, מדד השחזור ועקומות המוליכות יחד עם המסה הטוחנת של כל שיא. שיפוע ליניארי רחב המורכב מ-30 כרכים של טורים מ-75 מילימולרים עד נתרן כלוריד 350 מ"ל הפריד בין מונומרים של BSA לבין דימרים ואוליגומרים גבוהים יותר. ניתוח MALS במורד הזרם הביא מסה טוחן מונומר מחושב של 66.8 קילודלטונים מסה טוחן עמום מחושב של 130 קילודלטון.
בהתבסס על מוליכות החיץ בפסגות האלוטות, שיפוע שונה לתוכנית אחרת, צעד ארוך של נתרן כלוריד 175 מילימולר, ואחריו שיפוע ליניארי מ 175-מילימולר ל 500 מילימטר נתרן כלורי. ההדרגה החדשה שיפרה מאוד את הרזולוציה והפיקה הפרדה מצוינת בין מונומר BSA לבין מינים אוליגומריים גבוהים יותר. תוכנית צעד חכם של 200 מילימולר ו 250 מילימולר נתרן כלורי הוחל להתמקד גם על מינים אוליגומריים גבוהים.
זה הביא להפרדה מצוינת בין מונומר BSA, עמום, ו trimer. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות כגון ספקטרומטריית מסה, פעילות SDS-PAGE ובדיקות יציבות בכל משתנה המופרד על ידי חילופי יון כדי לזהות ולאפיין עוד יותר כל אחד מהם. מצאנו כי MALS חילופי יון מרחיב את כוחו של ניתוח MALS לדגימות שלא ניתן לנתח באופן מלא על ידי SEC-MALS.
הפרדה לפי תשלום פותרת מינים שונים המשתקים ב-SEC.
