1. הכנת המדגם והעמודה

1. בהדגמה זו, תערובת של 2 חלבונים תופרד על עמוד חילופי קטיונים: המוגלובין וציטכרום C. הוסף 0.2 מ"ל חיץ שיווי משקל (pH 8.1) לדגימת החלבון והמערבולת לערבב ביסודיות. צנטריפוגה במשך 2 דקות כדי להסיר כל קצף.
2. מניחים את עמודת חילופי הקיצונים במבחנה למשך 5 דקות כדי לאפשר לשרף להתיישב. מהדק את המבחנה עם העמוד על דוכן טבעת כדי לוודא שהוא זקוף.
3. פתח את המכסה העליון של העמודה ולאחר מכן את המכסה התחתון. אפשר למאגר בעמודה לטפטף החוצה מתחת לכוח המשיכה לתוך המבחנה.
4. לשטוף את העמודה פעמיים עם אמצעי אחסון עמודה (במקרה זה אמצעי האחסון של העמודה הוא 0.3 מ"ל) של מאגר שקילת. תן לנפח העמודות הראשון (0.3 מ"ל) של מאגר שיווי משקל לטפטף החוצה לתוך ממתקין הפסולת לפני הוספת נפח העמודה השני. שלב זה מאפשר לעמודה להיות מכווצת עם מאגר ההסתה. הוסף את מאגר שיווי משקל לאט בשלב זה כדי לא להפריע שרף.

2. הפעלת דגימת חלבון באמצעות עמודת חילופי Cation

1. שים את העמוד בצינור צנטריפוגה 2 מ"ל שכותרתו "לא מאוגד 1". לטעון בזהירות 0.1 מ"ל של דגימת החלבון על החלק העליון של העמודה.
2. לאחר המדגם נטען על החלק העליון של העמודה, לשטוף אותו עם 0.3 מ"ל של מאגר שיווי משקל על ידי הוספת המאגר בחלק העליון של העמודה ומאפשר לו לטפטף לאורך כל הדרך. חזור על שלב 4x זה (בסך הכל 5 כביסות) ולאסוף כל לשטוף בצינור צנטריפוגה נפרד, 2 מ"ל. תייג את הצינורות כ"לא מאוגד 1-5".
3. עבור 2 הכביסות האחרונות, צנטריפוגה עבור 10 s ב 1,000 x g כדי לוודא שכל המינים הלא מאוגדים יורדים מהעמוד. כל דגימה שנקשרת לעמודה לא צריכה להיות בשטיפה זו, אך מדגם שאינו מאוגד יישטף ללא טעם. צנטריפוגה מספקת כוח רב יותר לשטוף חומרים לא מאוגדים מהעמוד.
4. שים את העמודה בצינור אוסף צנטריפוגות חדש בגודל 2 מ"ל שכותרתו "קשור 1". שים 0.3 מ"ל של חוצץ אלוטיון (מלח גבוה, pH 5.5) על גבי העמודה. צנטריפוגה האלנט המתקבל עבור 10 s ב 1,000 x g.
5. חזור על שלב ההתחמקות 2 פעמים נוספות על ידי הצבת העמודה בצינור צנטריפוגה חדש, הוספת 0.3 מ"ל וצנטריפוגה עבור 10 s. תייג את אלה "קשור 2 ו -3".
6. הקלט שינויים או תצפיות בצבע על השברים. המוגלובין הוא חלבון צבעוני שנראה חום אדמדם בעוד ציטוכרום C הוא בצבע אדמדם.

3. תוצאות: חילופי cation של המוגלובין וציטכרום C

1. לציטוכרום סי יש pI של 10.5 ומוגלובין עם pI של 6.8. לכן, כאשר נעשה שימוש במאגר שיווי משקל pH 8.1, המוגלובין אינו מאוגד לעמודה מכיוון שהוא טעון לרעה. Cytochrome C טעון באופן חיובי ב- pH זה והוא נקשר לעמודה מכיוון שה- pH < pI.
2. המוגלובין נצפה בשברים הלא מאוגדים מכיוון שהוא אינו מאוגד לעמודה.
3. Cytochrome C נצפתה בשברים מאוגדים, מכיוון שהיא הייתה קשורה לעמודת חילופי הקטירות.

איור 1. תמונה של שבר לא מאוגד (המוגלובין) ושבר כבול (ציטוכרום C).