Name: vector competence analyses on aedes aegypti mosquitoes using zika virus
Uploaded: 2020-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus at JoVE.com

אנו מודים לצוות של מרכז ההתייחסות העולמי לווירוסים מתפתחים ו Arboviruses (WRCEVA): ד"ר רוברט טש, הילדה גוזמן, ד"ר קנת פלנטה, ד"ר ג'סיקה פלנטה, דיון שרטון ודיביה מירצ'נדאני, על עבודתם הבלתי נלאה באוצר ובספקת זנים ויראליים רבים המשמשים לניסויי היכולת הווקטורית שלנו ושל קבוצות אחרות. העבודה המוצגת מומנה על ידי קרן מלגות מקלפלין (SRA) ו- NIH מעניקה AI120942 ו- AI121452.

כל ההליכים שבוצעו בפרוטוקולים אלה בוצעו בעמידה מלאה בפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לאבטחה ביולוגית וועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית של הסניף הרפואי של אוניברסיטת טקסס בגלווסטון.
1. להגביר את זיקה מיק"ב בתאי Vero
<ol><li>לגדל תאי Vero (CCL-81 או VeroE6) בשינוי של Dulbecco של המדיום החיוני המינימלי של נשר (DMEM) בתוספת 10% v / v סרום בקר עוברי מומת חום (FBS), ו 1% (v / v) פניצילין-סטרפטומיצין (100 U / mL ו 100 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה) באינקובטור לח של 37 °C עם 5% CO2 עד בין 80−90% conencency בבקבוק תרבית רקמות 150 ס"מ2.</li>
	<li>בארון בטיחות ביולוגית (BSC), להסיר את המדיום ולהיפטר או 10% אקונומיקה או דילול עובד של אמוניום רבוע כפול (שולחן החומרים). מיד לחסן את monolayer עם 1 מ"ל של מלאי ויראלי, מכוון 0.1−1 חלקיק ויראלי זיהומיות לכל תא. להסעיר את הבקבוקון מיד כך inoculum יוצר קשר עם monolayer בשלמותו.</li>
	<li>למעלה המדיום לנפח של 5 מ"ל באמצעות DMEM בתוספת 2% v / v חום מומת FBS, ו 1% (v / v) פניצילין-סטרפטומיצין. לאחר מכן להעביר את הבקבוקון לתוך אינקובטור 37 °C לח עם 5% CO2 במשך 60 דקות.</li>
	<li>מוציאים את הבקבוק מהחממה ומכניסים אותו ל-BSC. הוסף מדיום נוסף לנפח כולל של 15 מ"ל באמצעות DMEM בתוספת 2% v / v חום מומת FBS, ו 1% (v / v) פניצילין-סטרפטומיצין. הזז את הבקבוקון לתוך אינקובטור 37 °C לח עם 5% CO2.</li>
	<li>בדוק את הבקבוקון מדי יום תחת מיקרוסקופיה ניגוד פאזה לקבלת ראיות של אפקטים ציטוטופתיים (CPE). המשך לקציר הנגיפי (שלב 1.7) כאשר רק כ 40−50% מהתאים נשארים ב monolayer, בדרך כלל 3−5 ימים לאחר ההדבקה בהתאם לזן של ZIKV מנוצל.</li>
	<li>שאפו את הסופר-טבעי והכניסו למז"ל חרוט 50 מ"ל. להבהיר את supernatant של פסולת הסלולר על ידי צנטריפוגה (3,500 x גרם במשך 20 דקות). הערה: אם צלוחיות מרובות נדבקו באופן זהה, supernatants מבקבוקונים מרובים ניתן לשלב לתוך צינורות חרוט 50 מ"ל.</li>
	<li>הסר את supernatant מן הצינור חרוט 50 מ"ל אחד טרי, דואג לא לשבש את הכדור. להשלים את supernatant עם FBS מומת חום לריכוז הסופי של 30% (v/ v). Aliquot תערובת זו לתוך צינורות כובע בורג בודדים להקפיא ב -80 °C (80 °F) עד השימוש.</li>
</ol>2. הכנת דם מלאכותי
<ol><li>ביום שבו יתושים ייחשפו לדמיכות דם זיהומיות, הפעילו את מקור הכוח (שולחן החומרים) במתקן בלימת פרוקי רגליים, כך שיחידות ההאכלה (שולחן החומרים) יתחממו מראש עד שהיתושים יהיו מוכנים לחשיפה.</li>
	<li>הכן כתמי דם מלאכותיים באמצעות אחת השיטות המתוארות להלן.<ol>
<li>שיטה 1: שלבו דם אנושי שנקטף טרי (תוך שבוע) שנרכש מסחרית 1:1 v/v עם מלאי ויראלי (שהוכן כמתואר בסעיף 1). הערה: שיטה זו מותנית בהיעדר נוגדנים למשפחת הנגיף/וירוס הנמצאת בדם.</li>
		<li>אם היעדר נוגדנים לא ניתן לאשר או מקור הדם ידוע יש חשיפה פלביוירוס קודם, לשטוף ולארוז באופן ידני אריתרוציטים.<ol>
<li>ב BSC, להוסיף 30 מ"ל של דם אנושי שלם לצינור חרוטי 50 מ"ל ומעל עד 50 מ"ל עם תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS).</li>
			<li>צנטריפוגה ב 3,500 x g במשך 20 דקות.</li>
			<li>שאפו את supernatant או על ידי לשפוך בעדינות לתוך מחבת מגש המכיל או 10% אקונומיקה או דילול עובד של אמוניום רבוע כפול, דואג לא להשליך את כדורי אריתרוציטים.</li>
			<li>הוסף 10 מ"ל של PBS והקש בעדינות על החלק התחתון של הצינור חרוטי נגד החלק התחתון של BSC, כך גלולה אריתרוציטים כבר מחדש. להביא את נפח המתלה עד 50 מ"ל עם PBS. מערבבים על ידי היפוך עדין.</li>
			<li>חזור על שלבים 2.2.2.1−2.2.2.4 בסך הכל 4−6x. אשר כי supernatant הוא ברור או רק מעט ורוד כבר לא אטום. הסר את כל supernatant באמצעות pipette סרולוגי. resuspend גלולה אריתרוציטים ב 1−2 מ"ל של PBS.</li>
			<li>להרכיב את הדם: 350 μL של אריתרוציטים ארוזים, 100 μL של 10% סוכרוז, 200 μL של FBS מומת חום, 900 מיקרומטר RECOMBINANT ATP, ו 2 מ"ל של מלאי וירוס מדולל כראוי באמצעות DMEM בתוספת 2% v / v חום מומת FBS, ו 1% (v / v) פניצילין-סטרפטומיצין.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>כיסוי יחידת מאגר 3 מ"ל סטנדרטית(שולחן חומרים)עם עור של עכבר לא נגוע (אפשרויות אחרות כוללות סרט פרפין, קרומים קולגניים, או מעטפת נקניקיות).</li>
	<li>מניחים את המאגר המקורה על מגבות נייר לבן. הוסף ~ 2 מ"ל של דם זיהומיות למאגר 1 מ"ל בכל פעם. בדוק את המגבת מתחת למאכיל לכל ראיה לדליפה. אם קיימות דליפות, יש לשחזר את נקזת הדם מהמזינים ולהשליך את הכיסויים. לאטום את המאכילים עם תקעים. שוב לאשר כי אין דליפות קיימות.</li>
</ol>3. תיוג של קמות דם/בדיקת פלאק
<ol><li>באמצעות הנפח הנותר של קמות הדם מוכן, לבצע סדרת דילול טורי 10x (כלומר, 6 דילול, החל מדולל 10x כדי 1,000,000x) באמצעות DMEM בתוספת 2% v / v חום מומת FBS, ו 1% (v / v) פניצילין-סטרפטומיצין.</li>
	<li>Aliquot 100 μL של דילול לתוך בארות של 24 או 12 לוחות היטב מן מדלל ביותר מרוכז ביותר.</li>
	<li>דגירה עבור 1 שעה ב 37 °C (5 °F), 5% CO2 אינקובטור.</li>
	<li>בסוף תקופת הדגירה של 1 שעות, להחזיר את הלוחות לתוך BSC ולהוסיף 1 מ"ל או 2 מ"ל של כיסוי methylcellulose 24 טוב או 12 לוחות היטב, בהתאמה.</li>
	<li>מניחים צלחות כיסוי בחזרה 37 °C ,5% CO2 אינקובטור ודגרה במשך 3−7 ימים (תלוי זן וירוס).</li>
	<li>לאחר הדגירה, להסיר את הצלחות מן האינקובטור ולהביא לתוך BSC. יש להשליך את כיסוי המתילצלולוז למחבת מגש המכילה 10% אקונומיקה או חומר חיטוי אמוניום דו-צדדי.</li>
	<li>לשטוף כל באר 2x עם PBS, להשליך את לשטוף לתוך מחבת מגש המכיל 10% אקונומיקה או אמוניום quaternary כפול.</li>
	<li>הוסף ~ 1 מ"ל של מתנול:אצטון (1:1 v:v) ולאפשר לתאים לתקן על צלחת לפחות 30 דקות BSC בטמפרטורת החדר (RT). להשליך מתנול:אצטון על פי מדיניות מוסדית על פסולת אורגנית.</li>
	<li>דמיין את ZIKV באמצעות אחת משתי שיטות המתוארות להלן.<ol>
<li>לאחר הסרת מתנול:אצטון, כתם מיד עם פתרון סגול קריסטל (0.25% w /v ב 30% מתנול) במשך 5 דקות. יש לשטוף 2x במי ברז ולהשאיר לייבוש, ולאחר מכן לדמיין ישירות על ידי העין לראיות של לוחות או הרס של monolayer.</li>
		<li>לחלופין, בצע מיקוד יצירת מעש.<ol>
<li>אפשר ללוחות להתייבש עד שלא יישאר קיבוע אורגני. הערה: זה צריך לקחת ~ 2−3 שעות מחוץ ל- BSC אבל יכול להיות מואץ על ידי ייבוש אוויר BSC או מכסה המנוע אדים כימיים.</li>
			<li>לשטוף כל באר 3x במשך 15 דקות כל אחד PBS nonsterile (Mg2 + ו Ca2 + חינם) על נדנדת צלחת מסלולית. הסר PBS ולהוסיף 1 מ"ל של פתרון חסימה (PBS + 3% FBS) לכל באר וסלע במשך 15 דקות ב RT.</li>
			<li>הוסף 100 μL לבאר של α-ZIKV או α-flavivirus העיקרי נוגדן (למשל, קבוצת flavivirus hybridoma D1-4G2-4-15 [4G2]) בדילול של 1:2,000 בחסימת פתרון. דגירה עם נדנדה למינימום של 4 שעות (רצוי לילה, לא יעלה על 18 שעות) ב RT.</li>
			<li>הסר את הנוגדן העיקרי לשטוף 3x במשך 15 דקות כל אחד עם PBS (Mg2 + ו Ca2 + חינם) על נדנדת צלחת מסלולית.</li>
			<li>הוסף 100 μL לבאר של הנוגדן המשני (עז α עכבר HRP מסומן) מדולל 1:2,000 בחסימה חוצץ. דגירה עם נדנדה במשך שעה ב RT.</li>
			<li>לשטוף 3x במשך 15 דקות כל אחד עם PBS (מ"ג2 + ו Ca2 + חינם) על נדנדת צלחת מסלולית.</li>
			<li>Aliquot 100 μL של ריאגנט פיתוחמצע (טבלת החומרים)לבאר. צלחות סלע ב RT במשך 15 דקות.</li>
			<li>לעצור את התגובה עם התפתחות של מוקדים / לוחות על ידי הסרת המצע ושטיפה את הצלחות 2x עם מי ברז. יוצקים ממי ברז ומאפשרים לצלחות להתייבש לפני הכימות.</li>
			<li>ספירת מוקדים ויראליים כדי לקבוע את מספר FFU הנוכחי במדגם נתון.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ניהול דם
<ol><li>השתמש Ae. aegypti יתושים 2−4 ימים לאחר אקסלוסיה. מיין יתושים נקבות לתוך 0.5 L קרטון קרטון עם מכסים מוקרן לשלול מהם סוכר (בדרך כלל 36−48 שעות לפני מקצית הדם זיהומיות). ספק מי ליביטום עד באמצעות כדורי כותנה רוויים במים.</li>
	<li>הסר את כדורי הכותנה רווי מים בבוקר כי היתושים יהיו חשופים לדם זיהומיות.</li>
	<li>חבר מאגרים המכילים כתמי דם מלאכותיים ליחידת האכלה מוביל בתוך תיבת כפפות פלסטיק שקופה.</li>
	<li>בתוך תא הכפפות, מניחים קרטון קרטון 0.5 L עם מכסה מוקרן, המכיל 50−100 יתושי Ae. aegypti מורעבים, מתחת ליחידת ההאכלה המחוברת למאגר. הערה: יתושים מורעבים כראוי בדרך כלל להאכיל בתוך 20 דקות. האכלה יכולה להיות ממושכת לפי הצורך כדי להגדיל את גודל המדגם באוכלוסיות איטיות יותר, אם כי זה לא צריך להאריך מעבר 60 דקות, כי (ZIKV) titer ויראלי יכול להקטין בתוך המאכיל לאחר ~ 60 דקות.</li>
	<li>עם השלמת ההאכלה, להסיר את המאגר ולטבול אקונומיקה 10% טרי.</li>
	<li>יתושים מרדים קר על ידי דגירה במשך 30 s ב -20 מעלות צלזיוס או במשך 5 דקות במקרר.</li>
	<li>בתוך תא הכפפות, יוצקים את היתושים לתוך צלחת פטרי על קרח. לספור ולמיין את הנקבות הספוגות מיתושים לא שקועים. יש להיפטר מהיתושים הלא מנוצלים על ידי טבילה בצינור חרוט 50 מ"ל מלא ב-70% אתנול. בעוד היתושים עדיין מרדים, לשפוך אותם בחזרה לתוך קרטון קרטון 0.5 L לכסות במהירות עם המסך ואת המכסה. חותכים רשת מסך עודפת מהקרטון ומאבטחים את הרשת עם סרט הדבקה.</li>
	<li>מוסיפים כדור כותנה רווי בסורוז מימי ומסונן סטרילי 10% למסך של כל קרטון. מניחים את כל קרטוני היתוש במיכל פלסטיק משני גדול עם ספוג לח כדי לשמור על לחות.</li>
	<li>מניחים מיכל משני המכיל קרטונים של יתושים לתוך אינקובטור עם טמפרטורה של 27 ± 1 °C (או לפי הצורך כדי לדמות תנאים באזור העניין) עם 80% ± 10% לחות יחסית 16:8 אור:מחזור כהה). שמור על היתושים עם גישה ל-10% סוכרוז עד להשלמת הניסויים.</li>
</ol>5. רכישה ועיבוד לדוגמה
<ol><li>בימים שצוינו לאחר ההזנה, שאף מספר קבוע מראש של יתושים מהקרטונים המתאימים באמצעות שאיפה מכנית בתוך תא כפפות. כובע צינור האוסף עם סיבוב כותנה לאחר מספר היתושים הנדרש נרכש.</li>
	<li>יתושים מרדים קר על ידי דגירה במשך 30 שניות ב -20 °C (5 °F) או במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F).</li>
	<li>בתוך תא הכפפות, יוצקים את היתושים לתוך צלחת פטרי על קרח. באמצעות שני זוגות של מלקחיים, להסיר את כל שש הרגליים של כל יתוש ומניחים בצינור microcentrifuge התחתון עגול 2 מ"ל המכיל נושאת כדור נירוסטה מעוקרת (7/32) ו 500 μL של מדיה איסוף יתושים (MCM) המורכב DMEM, 2% FBS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, ו 2.5 μg / mL amphotericin.</li>
	<li>מניחים בעדינות את היתוש על טיפת שמן מינרלי כדי לרסן אותו, תוך כדי קבילות שלא לאפשר כל מגע בין השמן לראש היתוש ופרובו-ביס.</li>
	<li>הכנס את פרובוסיס היתוש לתוך קצה פיפטה 10 μL מלא 10 μL של FBS מומת חום. הערה: לחלופין, ניתן למלא את הפיפטה ב סוכרוז, דם או שמן מינרלי. השמן מאפשר הדמיה ישירה של בועות רוק באמצעות מיקרוסקופיה קלה.</li>
	<li>אפשר ליתושים להזיל ריר במשך 30 דקות. להוציא את קצה micropipette המכיל FBS + רוק לתוך צינור microcentrifuge המכיל 100 μL של MCM, ולאחר מכן למקם את הפגר לתוך צינור microcentrifuge התחתון עגול 2 מ"ל נפרד המכיל נושאת כדור פלדה מעוקרת 500 μL של MCM. ודא כי הצינורות המשמשים את הגופים, הרגליים והרוק מסומנים כך שיהיה ברור שכל שלוש הדגימות מקורן באותו יתוש.</li>
	<li>בעוד היתושים הם ריר, לבצע שלבים 5.3−5.5 על היתושים הנותרים.</li>
	<li>להעביר את הצינורות המכילים את הגופים והרגליים למכשיר הומוגניזציה של רקמת כרסום חרוזים הכלול בתוך BSC. תטריאט את כל דגימות הגוף והרגל ב-26 הרץ למשך 5 דקות כדי לשחרר חלקיקים ויראליים לתוך הסופר-נט. להבהיר את כל הדגימות על ידי צנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות כדי גלולה פסולת הסלולר. הערה: בשלב זה, דגימות ניתן להקפיא ב -80 °C (80 °F), או ed מיד.</li>
</ol>6. איתור זיק"ב באמצעות תצוקת זיהומיות
<ol><li>ב BSC, להכין 24 לוחות תרבית רקמות היטב עם תאי Vero (105 תאים לבאר) 24 שעות לפני תחילת ההדבקה. סמן כל באר בזהות של יתוש / דגימה אחת.</li>
	<li>אם דגימות הוקפאו ב -80 מעלות צלזיוס, אפשר להפשיר.</li>
	<li>הסר את המדיה מלוחות התא Vero לפני החיסון עם דגימות צלחת אחת בכל פעם.</li>
	<li>עבור דגימות המכילות גופים או רגליים, בזהירות aliquot 100 μL של supernatant מובהר לתוך כל באר, דואג לא להפריע פסולת תא יתוש מן הכדור. הערה: דגימות רוק ניתן לדלל 1:1 (v/v) עם MCM לפני חיסון על תאים כדי לחסוך דגימות עבור titration מאוחר יותר, במידת הצורך.</li>
	<li>מעבירים את הלוחות לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ודגרה למשך שעה.</li>
	<li>החזר את הצלחות ל- BSC והוסף ~ 1 מ"ל של כיסוי methylcellulose לכל באר. מניחים את הלוחות המכוסים בחזרה באינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 אינקובטור ודגרה במשך 3−7 ימים (תלוי וירוס / זן).</li>
	<li>בצע קיבוע ופריטים חזותיים כמתואר בשלבים 3.6−3.9.</li>
	<li>לגבי ניקוד באמצעות מיקוד יצירת בדיקה, לכמת את הבארות החיוביות על ידי בדיקה תחת מיקרוסקופ אור. זיהוי של כתמים intracytoplasmic של תאים בבאר מצביע על נוכחות של וירוס. דגימות מקבלות ציון אך ורק כ-focus-חיובי או שלילי.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Azar, S. R., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence:+What+Has+Zika+Virus+Taught+Us.">Vector Competence: What Has Zika Virus Taught Us.</a> Viruses. 11 (9), 867 (2019).</li><li>Souza-Neto, J. A., Powell, J. R., Bonizzoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+vector+competence+studies:+A+review.">Aedes aegypti vector competence studies: A review.</a> Infection, Genetics and Evolution. 67, 191-209 (2019).</li><li>Smith, D. R., Adams, A. P., Kenney, J. L., Wang, E., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+in+the+Mosquito+Vector+Aedes+taeniorhynchus:+Infection+Initiated+by+a+Small+Number+of+Susceptible+Epithelial+Cells+and+a+Population+Bottleneck.">Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mosquito Vector Aedes taeniorhynchus: Infection Initiated by a Small Number of Susceptible Epithelial Cells and a Population Bottleneck.</a> Virology. 372 (1), 176-186 (2008).</li><li>Forrester, N. L., Coffey, L. L., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arboviral+bottlenecks+and+challenges+to+maintaining+diversity+and+fitness+during+mosquito+transmission.">Arboviral bottlenecks and challenges to maintaining diversity and fitness during mosquito transmission.</a> Viruses. 6 (10), 3991-4004 (2014).</li><li>Kramer, L. D., Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+vectorial+capacity+for+mosquito-borne+viruses.">Dissecting vectorial capacity for mosquito-borne viruses.</a> Current Opinion in Virology. 15, 112-118 (2015).</li><li>Kramer, L. D., Hardy, J. L., Presser, S. B., Houk, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+Barriers+for+Western+Equine+Encephalomyelitis+Virus+in+Culex+tarsalis+infected+after+Ingestion+of+Low+Viral+Doses.">Dissemination Barriers for Western Equine Encephalomyelitis Virus in Culex tarsalis infected after Ingestion of Low Viral Doses.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 30 (1), 190-197 (1981).</li><li>Lounibos, L. P., Kramer, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasiveness+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+and+Vectorial+Capacity+for+Chikungunya+Virus.">Invasiveness of Aedes aegypti and Aedes albopictus and Vectorial Capacity for Chikungunya Virus.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214, 453-458 (2016).</li><li>Heitmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+Salivation+as+a+Method+to+Analyze+Vector+Competence+of+Mosquitoes.">Forced Salivation as a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57980 (2018).</li><li>Beerntsen, B. T., James, A. A., Christensen, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Mosquito+Vector+Competence.">Genetics of Mosquito Vector Competence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 115-137 (2000).</li><li>Guo, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culex+pipiens+quinquefasciatus:+a+potential+vector+to+transmit+Zika+virus.">Culex pipiens quinquefasciatus: a potential vector to transmit Zika virus.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 5 (9), 102 (2016).</li><li>Secundino, N. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+transmission+to+mouse+ear+by+mosquito+bite:+a+laboratory+model+that+replicates+the+natural+transmission+process.">Zika virus transmission to mouse ear by mosquito bite: a laboratory model that replicates the natural transmission process.</a> Parasites &amp; Vectors. 10 (1), 346 (2017).</li><li>Smith, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+Transmission+and+Effect+on+Pathogenesis.">Venezuelan Equine Encephalitis Virus Transmission and Effect on Pathogenesis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (8), 1190-1196 (2006).</li><li>Lazear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+Zika+Virus+Pathogenesis.">A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis.</a> Cell Host Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).</li><li>Morrison, T. E., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Zika+Virus+Infection,+Pathogenesis,+and+Immunity.">Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity.</a> Journal of Virology. 91 (8), 9-17 (2017).</li><li>Reynolds, E. S., Hart, C. E., Hermance, M. E., Brining, D. L., Thangamani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Overview+of+Animal+Models+for+Arthropod-Borne+Viruses.">An Overview of Animal Models for Arthropod-Borne Viruses.</a> Comparative Medicine. 67 (3), 232-241 (2017).</li><li>Rossi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Novel+Murine+Model+to+Study+Zika+Virus.">Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (6), 1362-1369 (2016).</li><li>Styer, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquitoes+inoculate+high+doses+of+West+Nile+virus+as+they+probe+and+feed+on+live+hosts.">Mosquitoes inoculate high doses of West Nile virus as they probe and feed on live hosts.</a> PLoS Pathogens. 3 (9), 1262-1270 (2007).</li><li>Azar, S. R., Diaz-Gonzalez, E. E., Danis-Lonzano, R., Fernandez-Salas, I., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+infected+Aedes+aegypti+collected+during+a+Zika+virus+outbreak+have+viral+titres+consistent+with+transmission.">Naturally infected Aedes aegypti collected during a Zika virus outbreak have viral titres consistent with transmission.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 8 (1), 242-244 (2019).</li><li>Dzul-Manzanilla, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+vertical+transmission+and+co-circulation+of+chikungunya+and+dengue+viruses+in+field+populations+of+Aedes+aegypti+(L.)+from+Guerrero,+Mexico.">Evidence of vertical transmission and co-circulation of chikungunya and dengue viruses in field populations of Aedes aegypti (L.) from Guerrero, Mexico.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 110 (2), 141-144 (2016).</li><li>Grard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+in+Gabon+(Central+Africa)+&#8211;+2007:+a+new+threat+from+Aedes+albopictus.">Zika virus in Gabon (Central Africa) &#8211; 2007: a new threat from Aedes albopictus.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681 (2014).</li><li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+epidemiology+reveals+multiple+introductions+of+Zika+virus+into+the+United+States.">Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States.</a> Nature. 546 (7658), 401-405 (2017).</li><li>Guerbois, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+Zika+Virus+Infection,+Chiapas+State,+Mexico,+2015,+and+First+Confirmed+Transmission+by+Aedes+aegyti+Mosquitoes+in+the+America.">Outbreak of Zika Virus Infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and First Confirmed Transmission by Aedes aegyti Mosquitoes in the America.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).</li><li>Lundstrom, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sindbis+virus+polyarthritis+outbreak+signalled+by+virus+prevalence+in+the+mosquito+vectors.">Sindbis virus polyarthritis outbreak signalled by virus prevalence in the mosquito vectors.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (8), 0007702 (2019).</li><li>Miller, B. R., Monath, T. P., Tabachnik, W. J., Ezike, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemic+yellow+fever+caused+by+an+incompetent+mosquito+vector.">Epidemic yellow fever caused by an incompetent mosquito vector.</a> Tropical Medicine and Parasitology. 40 (4), 396-399 (1989).</li><li>Brown, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+Mosquito+Traps+in+Measuring+Species+Abundance+and+Composition.">Effectiveness of Mosquito Traps in Measuring Species Abundance and Composition.</a> Journal of Medical Entomology. 45 (3), 517-521 (2008).</li><li>Gorsich, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+assessment+of+adult+mosquito+trapping+methods+to+estimate+spatial+patterns+of+abundance+and+community+composition+in+southern+Africa.">A comparative assessment of adult mosquito trapping methods to estimate spatial patterns of abundance and community composition in southern Africa.</a> Parasites &amp; Vectors. 12 (1), 462 (2019).</li><li>Azar, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZIKV+Demonstrates+Minimal+Pathologic+Effects+and+Mosquito+Infectivity+in+Viremic+Cynomolgus+Macaques.">ZIKV Demonstrates Minimal Pathologic Effects and Mosquito Infectivity in Viremic Cynomolgus Macaques.</a> Viruses. 10 (11), 661 (2018).</li><li>Azar, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Vector+Competency+of+Aedes+albopictus+Populations+from+the+Americas+for+Zika+Virus.">Differential Vector Competency of Aedes albopictus Populations from the Americas for Zika Virus.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (2), 330-339 (2017).</li><li>Hanley, K. A., Azar, S. R., Campos, R. K., Vasilakis, N., Rossi, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Support+for+the+Transmission-Clearance+Trade-Off+Hypothesis+from+a+Study+of+Zika+Virus+Delivered+by+Mosquito+Bite+to+Mice.">Support for the Transmission-Clearance Trade-Off Hypothesis from a Study of Zika Virus Delivered by Mosquito Bite to Mice.</a> Viruses. 11 (11), 1072 (2019).</li><li>Hart, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Vector+Competency+of+Mosquitoes,+Gulf+Coast,+United+States.">Zika Virus Vector Competency of Mosquitoes, Gulf Coast, United States.</a> Emerging Infectious Diseases. 23 (3), 559-560 (2017).</li><li>Karna, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonized+Sabethes+cyaneus,+a+Sylvatic+New+World+Mosquito+Species,+Shows+a+Low+Vector+Competence+for+Zika+Virus+Relative+to+Aedes+aegypti.">Colonized Sabethes cyaneus, a Sylvatic New World Mosquito Species, Shows a Low Vector Competence for Zika Virus Relative to Aedes aegypti.</a> Viruses. 10 (8), 434 (2018).</li><li>Roundy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+Aedes+aegypti+Mosquito+Competence+for+Zika+Virus+Transmission.">Variation in Aedes aegypti Mosquito Competence for Zika Virus Transmission.</a> Emerging Infectious Diseases. 23 (4), 625-632 (2017).</li><li>Wilson, A. J., Harrup, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+relevance+in+insect-arbovirus+infection+studies.">Reproducibility and relevance in insect-arbovirus infection studies.</a> Current Opinion in Insect Science. 28, 105-112 (2018).</li><li>Hagan, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dehydration+prompts+increased+activity+and+blood+feeding+by+mosquitoes.">Dehydration prompts increased activity and blood feeding by mosquitoes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6804 (2018).</li><li>Guo, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Feeding+Patterns+of+Mosquitoes+in+a+Rural+Malaria-Endemic+Region+in+Hainan+Island,+China.">Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).</li><li>Kuno, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+history+of+laboratory+breeding+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+focusing+on+the+origins+and+use+of+selected+strains.">Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains.</a> Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).</li><li>Mayilsamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+Long+Viability+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+Eggs+Stored+Under+Normal+Room+Condition.">Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition.</a> Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).</li><li>Althouse, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+Zika+Virus+to+Establish+a+Sylvatic+Transmission+Cycle+in+the+Americas.">Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055 (2016).</li><li>Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fever+from+the+forest:+prospects+for+the+continued+emergence+of+sylvatic+dengue+virus+and+its+impact+on+public+health.">Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).</li><li>Vasilakis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+ancestral+sylvatic+dengue-2+viruses+to+re-emerge.">Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge.</a> Virology. 358 (2), 402-412 (2007).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השיטות המתוארות כאן מספקות זרימת עבודה כללית לביצוע ניתוחי כשירות וקטורית. כמסגרת כללית, רבות מהמתודולוגיות הללו נשמרות ברחבי הספרות. עם זאת, יש מקום משמעותי לשינויים (נבדק אזר וויבר1). וירוס (למשל, שושלת ויראלית, אחסון של וירוס אתגר, היסטוריית מעבר ויראלית), אנטומולוגיה (למשל, ?...

יכולת וקטורית מוגדרת כיכולת ברמת המינים, האוכלוסייה ואפילו הפרט, של פרוקי רגליים נתון כגון יתוש, קרציה או זבוב חול פלבוטומין, לרכוש ולהעביר סוכן ביולוגית עם שכפול או התפתחות בפרוקי הרגליים1,2. ביחס ליתושים ווירוסים המועברים על ידי פרוקי רגליים (כלומר, ארבו-וירוסים), הסוכן מודבק ממארח וירמי על ידי יתושה נקבה. בעקבות בליעה, הנגיף חייב להדביק באופן פרודוקטיבי אחד מאוכלוסייה קטנה של תאי אפיתל midgut3, להתגבר על מכשולים פיזיולוגיים שונים כגון השפלה פרוטאוליטית על ידי אנזימי עיכול, נוכחות של המיקרוביוטה (מחסום זיהום midgut, או MIB), ואת מטריצה פריטרופית מופרשת. זיהום של אפיתל midgut חייב להיות מלווה שכפול של הנגיף ובסופו של דבר לברוח מן midgut לתוך מערכת הדם הפתוחה של היתוש, או המולימף, המייצג את תחילתו של זיהום מופץ להתגבר על מחסום הבריחה midgut (MEB). בשלב זה הנגיף יכול להקים זיהומים של רקמות משניות (למשל, עצבים, שרירים וגופי שומן) ולהמשיך לשכפל, אם כי שכפול משני כזה לא יכול להיות נחוץ בהחלט עבור הנגיף להדביק את תאי acinar של בלוטות הרוק (להתגבר על מחסום זיהום בלוטת הרוק). יציאה מתאי האצין של בלוטת הרוק לחללים האפיטליים שלהם ואז תנועה לתוך צינור הרוק מאפשרת חיסון של הנגיף למארחים הבאים על נשיכה, ומשלימה את מחזור השידור1,2,4,5,6,7.
בהתחשב במנגנון ההתפשטות המאופיין היטב והשמור בדרך כלל בתוך וקטור יתושים, הערכות כשירות וקטור מעבדה דומות לעתים קרובות באופן מתודולוגי, אם כי הבדלים בפרוטוקולים קיימים1,2. בדרך כלל, לאחר חשיפה לנגיף הפה, יתושים נותחים כך שרקמות בודדות כגון אמצע, רגליים, שחלות או בלוטות רוק יכולות להיבדק לזיהום ויראלי, זיהום מופץ, זיהום מופץ / שידור טרנסו-אווריאלי פוטנציאלי, וזיהום מופץ / יכולת שידור פוטנציאלית, בהתאמה8. עצם נוכחותו של וירוס בבלוטות הרוק, עם זאת, אינה עדות מוחלטת ליכולת ההדבקה, בהתחשב בראיות של מחסום בריחה /יציאה של בלוטת הרוק (SGEB) בכמה שילובים וקטור / וירוס1,2,4,5,7,9. השיטה הסטנדרטית להוכחת כשירות שידור נותרה העברת יתושים לחיה רגישה10,11,12. עם זאת, בהתחשב בכך עבור arboviruses רבים זה מחייב את השימוש של מודלים מורין immunocompromised13,14,15,16, שיטה זו היא לעתים קרובות עלות-אוסרת. חלופה נפוצה היא אוסף של רוק יתושים, אשר ניתן לנתח על ידי תגובת שרשרת שעתוק הפוך-פולימראז (RT-PCR) או בדיקה זיהומית כדי להדגים את נוכחותו של הגנום הנגיפי או חלקיקים זיהומיים, בהתאמה. ראוי לציין כי שיטות איסוף רוק במבחנה כאלה עשויות ערך יתר עלהמידה 12 או לזלזל17 את כמות הנגיף שהופקד במהלך האכלת vivo, המציין כי נתונים כאלה חייבים להתפרש בזהירות. עם זאת, שיטת מביטה היא בעלת ערך רב כאשר מנותחת מנקודת המבט של עצם נוכחות הנגיף ברוק, מה שמצביע על פוטנציאל ההדבקה.
קיימות שתי גישות עיקריות לקביעת תפקידם של וקטורים יתושים בהתפרצויות מחלות ארבו-ויראליות. השיטה הראשונה כוללת מעקב שדה, שבו יתושים נאספים בהקשר של שידור פעיל18,19,20,21,22,23,24. עם זאת, בהתחשב בכך ששיעורי ההדבקה הם בדרך כלל נמוכים למדי (למשל, שיעור ההדבקה המשוער של 0.061% יתושים באזורים של וירוס זיקה פעיל (ZIKV) במחזור בארצות הברית21), הפללה של מינים וקטוריים פוטנציאליים יכולה להיות מוטה בכבדות על ידי לכידת מתודולוגיה25,26 וסיכוי אקראי (למשל, דגימת אדם נגוע אחד מתוך 1,600 לא נגוע)21 . אם ניקח זאת בחשבון, מחקר נתון לא יכול לרכוש יתושים מספיק הן במספרים גולמיים או מגוון מינים כדי לדגום במדויק יתושים המעורבים בהעברת. לעומת זאת, ניתוחי כשירות וקטורית מתבצעים במסגרת מעבדה, המאפשרים שליטה קפדנית בפרמטרים כגון מינון אוראלי. למרות שאינם מסוגלים לייצג את המורכבות האמיתית של זיהום יתושים ויכולת שידור במסגרת שדה, הערכות מעבדה אלה נשארות כלים רבי עוצמה בתחום הארבו-וירביולוגיה.
בהתבסס על ניתוחי כשירות וקטור שונים עם ZIKV במספר מינים של יתושים, אוכלוסיות ושיטות27,28,29,30,31,32, כמו גם סקירה אחרונה של הערכות יכולת וקטורית1, אנו מתארים כאן כמה מהפרוטוקולים הקשורים לזרימת עבודה וקטורית טיפוסית. בניסויים אלה, שלוש אוכלוסיות Ae. aegypti מאמריקה (העיר סלבדור, ברזיל; הרפובליקה הדומיניקנית; ועמק ריו גרנדה התחתון, TX, ארה"ב) נחשפו לזן יחיד של ZIKV (Mex 1-7, גישה GenBank: KX247632.1) ב 4, 5, או 6יומן 10 יחידות יוצרות מיקוד (FFU)/ mL באמצעות מקת דם מלאכותי. לאחר מכן, הם נותחו לראיות לזיהום, זיהום מופץ ויכולת שידור לאחר זמנים שונים של דגירה קיצונית (2, 4, 7, 10 ו -14 ימים) באמצעות ניתוח ובסיס מדבקות מבוסס תרבות תאים. למרות שזרימת העבודה/הפרוטוקולים הנוכחיים ממוטבים עבור ZIKV, אלמנטים רבים ניתנים לתרגום ישיר לארובווירוסים אחרים המועברים על ידי יתושים ברמות בלימת פרוקי רגליים וביו-בטיחות 2 ו-3 (ACL/BSL2 או ACL/BSL3).

<table><tbody><tr><td>3mL Standard Reservoir</td><td>R37P30</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>7/32&quot; Stainless Steel 440 Grade C Balls</td><td>4RJH9</td><td>Grainger</td><td>Grinding Media</td></tr><tr><td>Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case</td><td>A16-P4</td><td>FisherScientific</td><td>Fixative</td></tr><tr><td>Adenosine 5&#039;-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture</td><td>A6419-1G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15</td><td>MAB10216</td><td>MilliporeSigma</td><td>Primary Antibody for focus forming assay</td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle</td><td>5450-0011</td><td>KPL/Seracare</td><td>Secondary Antibody for focus forming assay</td></tr><tr><td>Bleach</td><td>NC0427256</td><td>FisherScientific</td><td>Decontamination</td></tr><tr><td>Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50</td><td>10-126-34</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture consumable</td></tr><tr><td>Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning</td><td>07-200-740</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture consumable</td></tr><tr><td>Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning</td><td>07-200-91</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture consumable</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>C0775-100G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Stain</td></tr><tr><td>Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case</td><td>05-402-7</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes</td><td>14-959-70C</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes</td><td>14-959-49A</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case</td><td>13-675-20</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case</td><td>13-675-15B</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case</td><td>13-675-30</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case</td><td>13-675-22</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td><td>08-772B</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL</td><td>S11150</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides</td><td>12-550-A3</td><td>FisherScientific</td><td>Immobilization of Mosquitos</td></tr><tr><td>FU1 Feeder</td><td>FU1-0</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment; feeding units</td></tr><tr><td>Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles</td><td>140-040-182</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250&amp;mu;g/mL, 50mL/Bottle</td><td>15-290-026</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case</td><td>15-140-163</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles</td><td>25-200-114</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles</td><td>11-965-118</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit</td><td>7203706</td><td>Lampire</td><td>Bloodmeal preparation</td></tr><tr><td>InsectaVac Aspirator</td><td>2809B</td><td>Bioquip</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case</td><td>A412-4</td><td>FisherScientific</td><td>Fixative</td></tr><tr><td>Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 &amp;deg;C), 250g/Bottle</td><td>M0512-250G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Micro-chem Plus Disinfectant Detergent</td><td>C849T34</td><td>Thomas Scientific</td><td>Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium</td></tr><tr><td>Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology</td><td>M5904-5X5ML</td><td>MilliporeSigma</td><td>Immobilization of Mosquitos</td></tr><tr><td>O-rings</td><td>OR37-25</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>Plastic Plugs</td><td>PP5-250</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>PS6 Power Unit (110-120V)</td><td>PS6120</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment; power source</td></tr><tr><td>Rubis Forceps, Offset blades, superfine points</td><td>4525</td><td>Bioquip</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case</td><td>50-809-242</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Sucrose, BioUltra, for molecular biology</td><td>84097-250G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000&amp;mu;L Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case</td><td>21-402-487</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200&amp;mu;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td><td>21-402-486</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20&amp;mu;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td><td>21-402-484</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10&amp;mu;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td><td>21-402-482</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>85300</td><td>QIAGEN</td><td>Homogenization</td></tr><tr><td>TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL</td><td>5510-0030</td><td>Seracare</td><td>Developing solution for focus forming assay</td></tr><tr><td>Vero</td><td>CCL-81</td><td>American Type Culture Collection</td><td>Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay</td></tr><tr><td>Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6]</td><td>CRL-1586</td><td>American Type Culture Collection</td><td>Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay</td></tr></tbody></table>

vector competence analyses on aedes aegypti mosquitoes using zika virus

ההליכים שהוצגו מתארים מתודולוגיה כללית להדביק יתושים Aedes aegypti עם וירוס זיקה בתנאי מעבדה כדי לקבוע את קצב ההדבקה, זיהום מופץ, והעברה פוטנציאלית של הנגיף באוכלוסיית היתושים המדוברת. הליכים אלה נמצאים בשימוש נרחב עם שינויים שונים בהערכות כשירות וקטורית ברחבי העולם. הם חשובים בקביעת התפקיד הפוטנציאלי כי יתוש נתון (כלומר, מינים, אוכלוסייה, הפרט) עשוי לשחק בהעברת סוכן נתון.

שלוש אוכלוסיות של Ae. aegypti מאמריקה (סלבדור, ברזיל; הרפובליקה הדומיניקנית; ועמק ריו גרנדה, TX, ארה"ב) נחשפו לזן התפרצות של ZIKV מאמריקה (ZIKV Mex 1-7, מדינת צ'יאפס, מקסיקו, 2015) על מגוון של טיטרים של דם (4, 5, ו -6 יומן10 FFU / mL) שהוצגו בקם דם מלאכותי מבוסס אריתרוציטים אנושי שטוף. בימים 2, 4, 7, 10 ו - 14 לאחר ה?...

Watch this Scientific Journal Video about Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus at JoVE.com

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

הפרוטוקול המוצג יכול לקבוע את היכולת הווקטורית של אוכלוסיות יתושים Aedes aegypti עבור וירוס נתון, כגון זיקה, במסגרת בלימה.

וקטור יכולת ניתוחים על יתושים Aedes aegypti באמצעות וירוס זיקה

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

vector-competence-analyses-on-aedes-aegypti-mosquitoes-using-zika

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

2.9K Views.  University of Texas Medical Branch. הפרוטוקול המוצג יכול לקבוע את היכולת הווקטורית של אוכלוסיות יתושים Aedes aegypti עבור וירוס נתון, כגון זיקה, במסגרת בלימה.

Video: Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Genetics

Genome Editing in the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti using CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering field and opened the doors for precise genome editing in multiple species, including non-model organisms. In the mosquito Aedes aegypti, loss-of-function mutations and DNA insertions have been accomplished with this technology. Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology, focusing on both the generation of gene knockout and knockin lines. In this protocol, quartz needles are filled with a mixture of guide RNA, recombinant Cas9, and a plasmid containing a DNA cassette encoding a gene for a fluorescent marker, if gene knockin is desired. Embryos at the preblastoderm stage are lined up onto a strip of double-sided sticky tape placed onto a coverslip, which is subsequently mounted onto a glass slide. With the help of a microinjector, the needles are inserted gently into the posterior end of the embryos and a small volume of the CRISPR mixture is dispensed. When the embryos are hatched, the larvae are checked under the fluorescent scope, and the pupae are sex-sorted and separated in different cages. Once the adults emerge, these are reciprocally crossed with wild-type individuals, blood-fed, and placed for egg laying. Once these eggs are hatched, the fluorescent larvae collected represent individuals with stable insertion of the DNA cassette into their genome. These larvae are then grown to the adult stage, outcrossed to wild-type individuals, and then further assessed through molecular techniques to confirm that the exact sequence of the DNA cassette is present at the desired site of the mosquito genome. Homozygous lines can also be obtained by following the provided pipeline of crossing schema and molecular screening of the mutations.

Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology.

עריכת גנום ביתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti באמצעות CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת<em&gt; במבחנה</em&gt; אפקט מניעתי של אינטרפרונים

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

הצלה אפיון של וירוס רקומביננטי מעולם חדש Zika וירוס זיהום מזוהם

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

כימות של נוגדנים תלויי שיפור של הנגיף Zika בתאי אדם ראשי

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

זיהום ויראלי ניסיוני ביתושים בוגרים על ידי האכלה אוראלית ומיקרו-הזרקה

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

שמירה על Aedes aegypti יתושים נגועים Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Biology

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus particles are transmitted during a blood meal via the saliva of an infected mosquito. Forced salivation assays allow determining the vector potential on the basis of single mosquitoes, avoiding the use of animal experiments. The method is suitable to analyze a large number of mosquitoes in one experiment within a short period of time. Forced salivation assays were used to analyze 856 individual mosquitoes trapped in Germany, including two different Culex pipiens pipiens biotypes, Culex torrentium as well as Aedes albopictus, which were experimentally infected with Zika virus (ZIKV) and incubated at 18 &#176;C or 27 &#176;C for two and three weeks. The results indicated the lack of vector competence of the different Culex taxa for ZIKV. In contrast, Aedes albopictus was susceptible to ZIKV, but only at 27 &#176;C, with transmission rates similar to an Aedes aegypti laboratory colony tested in parallel.

For efficient control of mosquito borne virus transmission, the knowledge of the vector potential of respective mosquitoes is of particular interest. We describe forced salivation as a method to analyze vector competence of Aedes albopictus and three different Culex taxa for the transmission of Zika virus.

הכריחו ריור כשיטה לנתח מיומנות וקטור של יתושים

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes

The success of sterile or incompatible insect technique-based population suppression programs depends on the ability of released males to compete for wild-type females and induce sterility in the target population. Hence, laboratory assessment of male mating competitiveness is essential for evaluating the release strain&#8217;s fitness before field release. Conventionally, such an assay is performed by determining the proportion of viable eggs produced by the females after being simultaneously exposed to two sets of males (wild-type and release strains) for copulation. However, this process is time-consuming and laborious due to the need to first blood-feed the females for egg production and then hatch and enumerate the hatched eggs to determine egg viability.&#160;
Moreover, this method cannot discern the degree of competitiveness between two sterile or Wolbachia-infected mosquito lines as wild-type female mosquitoes will only produce non-viable eggs upon mating with both. To circumvent these limitations, this paper describes a more direct method of measuring male mosquito mating competitiveness in laboratory settings using the fluorescent dye, rhodamine B (RhB), which can be used to mark males by feeding them in sucrose solution containing RhB. After the mating assay, the presence of fluorescing sperms in the spermathecae of a female can be used to determine her mating partner. This method is cost-effective, reduces the experimental time by 90% and allows comparison of mating fitness between two sterile or Wolbachia-infected lines.&#160;

Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes

Here, we present a protocol for studying mating competitiveness of male Aedes aegypti using fluorescent dye as a marker. Female mosquitoes are exposed to both marked and unmarked males for copulation. Post mating, their spermathecae are examined under a fluorescence microscope to determine their mating partner.

באמצעות צבע פלואורסצנטי, רודמין B, כדי ללמוד תחרותיות הזדווגות יתושים Aedes aegypti זכר

The success of sterile or incompatible insect technique-based population suppression programs depends on the ability of released males to compete for ...

Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two main categories of these new mosquito-associated viruses are &#34;mosquito-borne viruses (MBVs)&#34; and &#34;mosquito-specific viruses (MSVs)&#34;. These novel viruses might be pathogenic to both vertebrates and mosquitoes, or they could just be symbiotic with mosquitoes. Entity viruses are essential to confirm the biological characters of these viruses. Thus, a detailed protocol has been described here for virus isolation and amplification from field-collected mosquitoes. First, the mosquito samples were prepared as supernatants of mosquito homogenates. After centrifugation twice, the supernatants were then inoculated into either mosquito cell line C6/36 or vertebrate cell line BHK-21 for virus amplification. After 7 days, the supernatants were collected as the P1 supernatants and stored at -80 &#176;C. Next, P1 supernatants were passaged twice more in C6/36 or BHK-21 cells while the cell status was being checked daily. When cytopathogenic effect (CPE) on the cells was discovered, these supernatants were collected and used to identify viruses. This protocol serves as the foundation for future research on mosquito-associated viruses, including MBVs and MSVs.

Numerous novel virus-like sequences have been found in mosquitoes due to the extensive use of sequencing technologies. We provide an effective procedure for isolating and amplifying viruses using vertebrate and mosquito cell lines, which might serve as the basis for future studies on mosquito-associated viruses, including mosquito-borne and mosquito-specific viruses.

בידוד וירוסים הקשורים ליתושים מיתושים שנאספו בשטח

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...