הפרוטוקול שלנו עבור לוציפראז מבוסס RNA מועתק במבחנה מסייע ללמוד ויסות תרגום בתאים נגועים בנגיף אבעבועות רוח. בנוסף, אורך מותאם אישית של פולי(A)ליטר מאפשר ללמוד את השפעותיו הרגולטוריות על התרגום. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת את המחקר של ויסות תרגום על ידי אלמנטים Cis כגון 5'UTR ו 3'UTR ב mRNA וספקטרום רחב של חניכת תרגום.
הויטרו מועתק RNA מבוסס RNA assay עשוי להיות מותאם לשלב שינוי כובע ושינויים אחרים המשמשים כדי לבדוק את ההשפעה על התרגום. כדי להתחיל, תכנן פריימרים קדימה ואחלווה כדי ליצור אמפייקון PCR המכיל את הרכיבים הבאים ב- 5'עד 3'כיוון:T7-Promoter, פולי(A)ליטר, Firefly Luciferase ORF בזנב פולי(A) המכונה T7_12A-Fluc, כוללים מספר נוקלאוטידים נוספים פריימר קדימה ואחריו T7-Promoter פולי(A)ליטר או רצף רצוי 5'UTR וכ 20 נוקלאוטידים המתאימים לקצה 5 של ORF של הגן הכתב. התאימו את אורך ה-Primer בהתאם לטמפרטורת ההיתוך המתאימה ל-5'ים של ORF של גן הכתב, כדי להבטיח שהאזור המתאים בפרימר זהה לתחושת הגדיל של הגן.
לאחר מכן תכנן פריימר הפוך שיכלול זנב פולי(A) וכ-20 נוקלאוטידים. התאם בהתבסס על טמפרטורת ההיתוך המתאימה לקצה ה-3 של ORF של גן הכתב, כדי להבטיח שהאזור המתאים של פריימר יהיה זהה לגדיל האנטי-נס של הגן וקדון עצירה בתוך המסגרת יהיה קיים לפני זנב הפולי(A). לשליטה פנימית, תכנן קבוצה נוספת של פריימרים המכילים את הרכיבים הבאים ב- 5'עד 3'direction:T7-Promoter, רצף קידוד אקראי של 5'UTR המכיל רצף קוזאק, רנילה לוציפראז ORF וזנב פולי(A), המכונה T7_Kozak-Rluc.
כדי להגדיר את התגובה, להוסיף ריאגנטים בסדר הבא לצינור PCR:DNase מים חינם, פולימראז DNA נאמנות גבוהה 2X, פריימרים ורצף אישר לוציפראז תבנית DNA. לאחר מחזור PCR סטנדרטי בן שלושה שלבים ליצירת תבנית DNA, זהה את מוצר ה- PCR על-ידי הפעלת 5-10% מתגובת PCR באלקטרופורזה של 1%agarose TAE gel יחד עם תקן משקל מולקולרי. כדי לקבוע את גודל מוצר ה-PCR, דמיינו את הג'ל תחת מאיר UV.
לאחר קביעת הגודל הנכון של מוצר PCR, לטהר אותו באמצעות ערכת טיהור PCR זמין מסחרית באמצעות 100 microliters של מים ללא גרעין כדי לחמק ה-DNA. בדוק את הריכוז של ה-DNA מטוהרים באמצעות ספקטרופוטומטר ולאחסן אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס לשימוש עבור תמלול במבחנה מיד. כדי לסנתז RNA ממוצר PCR, הוסף את ריאגנטים הבאים לצינור מיקרוצנטריפוגה:מים חופשיים DNase-RNase, תערובת מאגר NTP, אנלוגי כובע, תבנית מוצר PCR, ותערובת פולימראז T7-RNA מערכת שעתוק במבחנה.
מערבבים היטב. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים ולאחר מכן להמשיך לטיהור של RNA מסונתז באמצעות ערכת טיהור RNA. כדי לבדוק את RNA מטוהרים, חום RNA ב 70 מעלות במשך חמש דקות כדי להסיר מבנה משני ולהפעיל אותו על 1.5 ג'ל TBE agarose.
ואז לדמיין את הג'ל תחת מאיר UV. בדוק את הריכוז של רנ"א מטוהר באמצעות ספקטרופוטומטר. תן לי את זה ותארך במינוס 80 מעלות צלזיוס.
זרעי HeLa תאים בצלחת 24 באר כדי להשיג 80-90% confluency למחרת דגירה לילה באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. להדביק תאי HeLa עם וירוס Vaccinia בריבוי של זיהום של חמישה ולשמור על תאי HeLa לא נדבקים להשוואה. ואז לה הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במשך 10 עד 12 שעות.
לאחר השעות הרצויות לאחר ההדבקה, מערבבים 480 ננוגרם של רצף 12A הנושא את Firefly Luciferase mRNA ו -20 ננוגרם של רצף קוזאק הנושא את רנילה לוציפראז mRNA בצינור מיקרוצנטריפוגה אחד. בצינור מיקרוצנטריפוגה אחר, להוסיף 1.1 microliters של רגנט עירוי שומנים cationic. הוסיפו 55 מיקרוליטרים של מדיית סרום מופחתת לשני הצינורות, ערבבו והתערבבו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.
לאחר מכן הוסיפו 55 ריג'נטים דביקים של שומנים זעירים המכילים מדיית סרום מופחתת ל-mRNA המכיל צינור. מערבבים בעדינות אך ביסודיות עם פיפטה ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. במהלך הדגירה, להסיר את מדיום תרבות התא מהתאים ולהוסיף 400 microliters של מדיום סרום מופחת ל הבאר.
כאשר הדגירה הושלמה, להוסיף 100 microliters של תערובת טיפה חכם באופן שווה לכל באר של צלחת 24 גם. חמש שעות לאחר שיתוף transfection עם 12A Fluc ו Kozak Rluc mRNA, להסיר את מדיום הסרום מופחת מהתאים lyse התאים על ידי הוספת 150 microliters 1X מאגר תזה מתוך ערכת בדיקה לוציפראז מסוגל לבצע שתי בדיקות כתב. לאחר הדגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, מגרדים את התאים באמצעות גומי ומזרק סטרילי ומעבירים לצינור מיקרוצנטריפוגה.
כדי גלולה פסולת התא, צנטריפוגה ליזאט ב 12, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים 30 מיקרוליטרים של על-טבעיים ל הבאר של צלחת ממוסמרת אטומה עם 96 היטב לבן עם תחתית מוצקה. השתמש בערכת ההתמדה של Luciferase ובלומינומטר קורא לוחות רב-מצבי כדי למדוד את הזוהר הכפול באמצעות פונקציית קינטיקה כמתואר בכתב היד.
לאחר ייצוא נתוני קריאת luminescence לתוך תבנית קובץ רצויה, לקבוע שיעור תרגום יחסי מ 12A Fluc mRNA בתאי HELA נגועים ו- VACV נגועים על ידי חלוקת ערך Fluc על ידי ערך Rluc בקרה פנימית. בדיקה זו שימשה לבדיקת יעילות התרגום של Fluc mRNA המכיל 5'Poly(A)ליטר בתאים נגועים ו- VACV נגועים. שני תאים נגועים ו- VACV הנגועים היו בהצלחה משותף עם Fluc ו Rluc mRNA.
חלוקת Fluc על ידי Rluc מנורמל יעילות transfection ביציבות RNA בתאים. 5'Poly(A)ליטר המכיל mRNA יש יתרון תרגום במהלך זיהום VACV בהשוואה לתאים לא מודבקים. זה לא היה בגלל יעילות transfection דיפרנציאלי או יציבות mRNA כמו רמת RNA היה דומה בתאים נגועים ו- VACV נגוע חמש שעות לאחר transfection mRNA.
קח טיפול מיוחד בעת תכנון פריימרים כמו זה יכול להשפיע לא רק על יעילות תגובת PCR, אלא גם על כל התהליכים במורד הזרם הדורשים את ה-DNA מוגברת. שיטה זו היא בדיקה חשובה כדי לבדוק במהירות את תקנת התרגום על ידי אלמנטים Cis. במידת האפשר, שיטה זו צריכה להיות מאומתת על ידי ניסויים משלימים אחרים.
יש לנקוט אמצעי זהירות בעת שימוש בנגיף Vaccinia ולהימנע מחשיפה לכימיקלים כגון אתידיום ברומיד ופנול.
