מוצרים טבעיים הם לעתים קרובות biosynthesized כמו סוג של תרכובות, ולא כמוצר אחד. סינון פיצול אבחון הוא גישה פשוטה לזיהוי כל התרכובות הקשורות מבנית בתוך תערובת מורכבת. סינון פיצול אבחון, המיושם בתוכנת MZmine, מאפשר לאנליסט לחקור ערכות נתונים ספקטרומטריות מסה עבור מוצרים טבעיים חדשים שאחרת היו מפספסים.
זה כולל תוצרים ביולוגיים חדשים, וגם רעלנים חדשים. סינון פיצול אבחון, המוחל על מחלקות רעלנים המזהמות מזון ומים, יכול ליידע הערכות חשיפה. כאשר מוחל על תמציות מיקרוביאלית וצמחים, זה יכול לגרום לגילוי של תרכובות חדשות.
שימוש בסינון פיצול אבחון דורש הבנה של תכונות ספקטרומטריית מסת טנדם מרכזיות המגדירות מחלקה כימית. משמעות הדבר היא כי תרכובות דומות מבנית ייצרו יונים אופייניים. שמי שון הוגסטרה.
אני טכנאי מחקר ומפתח תוכנה במרכז שלנו, ואני אדגים את ההליך. כדי להכין מדגם לניתוח מיקרוציסטין, לחסן 30 מיליליטר של ציאנובקטריה סטרילית צמיחה בינונית עד כ 5 פעמים-10-the-החמישי תאים למיליליטר, בתנאים אספטיים, ב 250 מיליליטר ארלנזייר flasks, ניטור צפיפות התא עם המוציטמטר. לאחר 26 ימים של תרבות פוטואטוטרופית, מואר עם אור פלואורסצנטי לבן קריר באמצעות משטר 12 שעות בהיר כהה ב 27 מעלות צלזיוס, עם מערבולת פעם ביום, להשתמש 47 מיליליטר קוטר GF / C מיקרופייבר זכוכית ניירות מסנן להפריד את התאים מן מדיום התרבות על ידי סינון ואקום.
הוסף שלושה מיליליטר של 80% מתנול לתאים שנקטפו במבחנות 14 מיליליטר, ומערבולת ולאחר מכן sonicate כל צינור במשך 30 שניות. לאחר sonication, lyse את הדגימות עם שלוש שעה אחת רצופה, מינוס 20 מעלות צלזיוס להקפיא, ו 15 דקות טמפרטורת החדר להפשיר מחזורים, ולסנן כל תמצית תא ציאנובקטריה וכתוצאה מכך באמצעות מסנני מזרק פוליטרא-פוליאלורואתילן בודדים 0.22 מיקרומטר. בעזרת זרם עדין של גז חנקן, ייבשו את התמציות עם אידוי ב-30 מעלות צלזיוס, ואחסנו את התמציות יבשות במינוס 20 מעלות צלזיוס.
לניתוח ספקטרומטריית מסת טנדם כרומטוגרפיה נוזלית, יש לבנות מחדש את השאריות המיובשת שיש לנתח עם 500 מיקרוליטרים של 90% מתנול, ומערבולת הדגימות למשך 30 שניות. מעבירים לבקבוקון כרומטוגרפיה נוזלי בלחץ גבוה ענבר. לאחר מכן לנתח את תמצית ציאנובקטריה באמצעות שיטת רכישה תלוית נתונים על ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
רוב המיקרוציסטינים מכילים שאריות ATA המייצרות שני יונים של מוצרי אבחון בספקטרומטריית מסה דו-מושבית, M עד Z 135.0803 ו- 163.1114. להכנת ערכת נתונים של ספקטרומטריית מסה טנדם נוזלית לא ממוקדת, פתחו את MZmine 2 ובחרו ייבוא נתונים גולמיים"תחת שיטות נתונים גולמיות". לאחר מכן בחר את קבצי הנתונים מניתוח המיקרוציסטין ובחר את מסנן איסוף השיא כדי להחיל אלגוריתם centroiding שסופק על-ידי הספק.
לסינון פיצול אבחון, או DFF, של קבצי הרכישה המיובאים התלויים בנתונים, השתמש בסמן כדי לסמן את קבצי הנתונים ופתח את התפריט הנפתח 'פריט חזותי' כדי לבחור באפשרות DFF. בתיבת הדו-שיח DFF שמופיעה, הזן את טווח זמני השמירה ודקות שבהם המחלקה הממוקדת של אנליטים תימשך, ולמצוא את טווח יחס המסה-לטעינה של המחלקה הממוקדת של אנליטים, כולל האפשרות עבור תרכובות טעונות מרובות בעת הצורך. הזן את דיוק מסת מסת הדו-מושבית בר השגה של מכשיר ספקטרומטריית המסה, והזן את יונות המוצר הספציפיות לקבוצה של יחס המסה לטעינה.
הזן את ההפסדים הניטרליים הספציפיים לקבוצה והגדר את העוצמה המינימלית עבור יווני מוצרי אבחון ו/או הפסדים ניטרליים שייחשבו כאחוז מהשיא הבסיסי של ספקטרומטריית ספקטרומטריית מסת הדו-מושבית. לאחר מכן בחרו נתיב ושם קובץ כדי ליצור פלט של התוצאות ולחצו על הלחצן 'אשר'' כדי להפעיל את ה- DFF. התוויית DFF תופיע עם השלמת ההתקנה בהצלחה.
האנליסט חייב לפרש ספקטרום מסה טנדם של תרכובות ידועות בתוך מחלקה מורכבת כדי לזהות את היונים המוצר ו / או הפסדים ניטרליים כי הם אבחון עבור כל המחלקה של תרכובות. עלילה זו DFF נוצרה בעקבות הניתוח של M.aeruginosa CPCC 300. ציר ה- x מייצג יחס מסה-לטעינה זה של היונים המבשרים שהתאימו לקריטריוני ה- DFF המוגדרים, בעוד ציר ה- y מציג את יחס המסה לטעינה של כל היונים של המוצר בתוך ספקטרום ספקטרומטריית מסת הדו-שאדם של המיקרו-cystins.
לניתוח זה, הקריטריונים לגילוי מיקרוצסטין כללו היונים המבשרים ביחס המסה לטעינה של 400 עד 1, 200, ושעות שמירה בין שתיים לשש דקות. והכי חשוב, ספקטרום ספקטרומטריית מסת טנדם אלה הכיל את שני יחסי המסה לטעינה מעל לסף עוצמת השיא המוגדר של 15%. מתוך 4, 116 ספקטרום ספקטרומטריית מסה טנדם שנרכש במהלך הניתוח, 26 הסתפקו בקריטריוני DFF וזוהו בתמצית M.aeruginosa CPCC 300.
המיקרוציסטינים העיקריים שזוהו יכולים להיות מוקצים בביטחון כמיקרוציסטין לאוצין ארגינין וחומצה אספרטית דמתילציה מיקרוציסטין לאוצין ארגינין. כמו תרכובות חדשות מתגלים באמצעות סינון פיצול אבחון, האורגניזמים ניתן לגדל בקנה מידה גדול לבידוד ואפיון של תרכובות על ידי NMR. כאשר מוחל על microcystins, סינון פיצול אבחון מאפשר לנו לקבוע אם שיטות סינון ממוקדות מסורתיות מזהות את הרעלים העיקריים הקיימים בתוך מדגם.
