Doğal ürünler genellikle bileşiklerin bir sınıf olarak biyosentez, tek bir ürün olarak değil. Tanısal parçalanma filtreleme karmaşık bir karışım içinde tüm yapısal ilişkili bileşikleri tespit etmek için basit bir yaklaşımdır. MZmine yazılımı içinde uygulanan tanısal parçalanma filtreleme, analistaksi takdirde cevapsız olacak yeni doğal ürünler için kütle spektrometresi veri setleri keşfetmek için izin verir.
Bu yeni biyoürünler ve aynı zamanda yeni toksinler içerir. Gıda ve suyu kirleten toksin sınıflarına uygulanan tanısal parçalanma filtreleme, maruziyet değerlendirmelerini bilgilendirebilir. Mikrobiyal ve bitki özleri uygulandığında, yeni bileşiklerin keşfi neden olabilir.
Tanısal parçalanma filtreleme nin kullanılması, kimyasal sınıfı tanımlayan anahtar tandem kütle spektrometresi özelliklerinin anlaşılmasını gerektirir. Bu yapısal olarak benzer bileşikler karakteristik iyonlar üretecek anlamına gelir. Benim adım Shawn Hoogstra.
Merkezimizde araştırma teknisyeni ve yazılım geliştiricisiyim ve prosedürü sergileyecekim. Mikrosistin analizi için bir örnek hazırlamak için, 30 mililitre steril siyanobakteri büyüme ortamını mililitre başına yaklaşık beş kat-10-5 hücrelere, aseptik koşullarda, 250 mililitrelik Erlenmeyer şişelerinde, hücre yoğunluğunu hemositometre ile izleyerek. 26 günlük fotoototrofik kültürden sonra, 27 santigrat derecede 12 saatlik açık-koyu bir rejim kullanarak soğuk beyaz floresan ışıkla aydınlatıldıktan sonra, günde bir kez dönen 47 mililitre lik GF/C cam mikrofiber filtre kağıtları kullanarak hücreleri vakum filtrasyon ile kültür ortamından ayırın.
14 mililitrelik test tüplerinde hasat edilen hücrelere üç mililitre %80 metanol ekleyin ve girdap ve daha sonra her tüpü 30 saniye sonicate. Sonication sonra, üç ardışık bir saat, eksi-20 derece-Santigrat dondurma ve 15 dakikalık oda sıcaklığında çözülme döngüleri ile örnekleri lyse ve tek tek 0,22 mikrometre politetrafloroetilen şırınga filtreleri ile ortaya çıkan siyanobakteri hücre ekstresi filtre. Azot gazı nazik bir akım kullanarak, 30 santigrat derece bir buharlaştırıcı ile ayıklar kuru ve eksi-20 santigrat derece kuru özleri saklayın.
Sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi analizi için, kurutulmuş kalıntıyı %90 metanol500 mikrolitre ile analiz edilecek şekilde yeniden oluşturur ve numuneleri 30 saniye boyunca girdap. Amber yüksek basınçlı sıvı kromatografi şişesine aktarın. Daha sonra standart protokollere göre yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi üzerinde veriye bağlı bir kazanım yöntemi kullanarak siyanobakteri ekstresini analiz edin.
Mikrostinlerin çoğu tandem kütle spektrometresi, M ile Z 135.0803 ve 163.1114 olmak üzere iki tanısal ürün iyonu üreten bir ATA kalıntısı içerir. Hedeflenmemiş sıvı kromatografi spektrografi veri seti hazırlama için MZmine 2'yi açın ve Raw veri alma yöntemleri altında "drop-down menüsü" seçeneğini belirleyin. Ardından mikrosistin çözümlemesi veri dosyalarını seçin ve satıcı tarafından sağlanan santrifüj algoritması uygulamak için tepe çekme filtresini seçin.
Alınan veribağımlı edinme dosyalarının tanısal parçalanma filtreleme veya DFF için, veri dosyalarını vurgulamak için imleci kullanın ve DFF seçeneğini seçmek için Visualization"drop-down menüsünü açın. Görünen DFF diyalog kutusunda, hedeflenen analit sınıfının aşılacağı bekletme süreleri ve dakika aralığını girin ve gerektiğinde birden fazla yüklü bileşik olasılığı da dahil olmak üzere hedeflenen analit sınıfının kütle-şarj oranı aralığını bulun. Kütle spektrometresi aletinin ulaşılabilir tandem kütle spektrometresi kütle doğruluğunu ve kütle-şarj oranının sınıfa özgü ürün iyonlarını girdirin.
Sınıfa özgü nötr kayıpları girin ve tandem kütle spektrometresi spektrometresinin baz zirvesinin yüzdesi olarak kabul edilecek tanısal ürün iyonları ve/veya nötr kayıpları için minimum yoğunluğu tanımlayın. Ardından sonuçları çıktıalmak için bir yol ve dosya adı seçin ve DFF'yi başlatmak için Tamam"ı tıklatın. Kurulumun başarıyla tamamlanmasından sonra bir DFF çizimi görüntülenir.
Analist, bileşik sınıf içindeki bilinen bileşiklerin tandem kütle spektrumlarını, tüm bileşik sınıfı için tanısal olan ürün iyonlarını ve/veya nötr kayıplarını tanımlamak için yorumlamalıdır. Bu DFF arsa M.aeruginosa CPCC 300 analizi sonrasında oluşturuldu. X ekseni, tanımlanan DFF kriterlerini karşılayan öncül iyonların kütle-yük oranını temsil ederken, y ekseni mikrosistinler içindeki tüm ürün iyonlarının kütle-şarj oranını gösterir.
Bu analiziçin mikrosistin saptama kriterleri 400-1, 200 kütle-şarj oranı içinde öncül iyonlar ve iki ila altı dakika arasında tutma süreleri dahil. En önemlisi, bu tandem kütle spektrometresi spektrometresi tanımlanan %15 baz pik yoğunluk eşiğinin üzerinde kütle-yük oranları içeriyordu. Analiz sırasında elde edilen 4 tandem kütle spektrometresi spektrometresi'nden 26'sı DFF kriterlerini karşılamış ve M.aeruginosa CPCC 300 ekstresinde tespit edilmistir.
Tespit edilen majör mikrosistinler mikrosisin lösin arginin ve demethylated aspartik asit mikrosist inkişaten arginin olarak güvenle atanabilir. Tanısal parçalanma filtreleme kullanılarak yeni bileşikler keşfedildikçe, organizmalar nmr tarafından izolasyon ve karakterizasyonu için büyük ölçekte yetiştirilebilir. Mikrosistinlere uygulandığında, tanısal parçalanma filtreleme, geleneksel hedefli tarama yöntemlerinin numunede bulunan ana toksinleri tespit edip etmediğini belirlememizi sağlar.
