Os produtos naturais são muitas vezes biossintéticos como uma classe de compostos, e não como um único produto. A filtragem de fragmentação diagnóstica é uma abordagem simples para detectar todos os compostos relacionados estruturalmente dentro de uma mistura complexa. A filtragem de fragmentação diagnóstica, implementada dentro do software MZmine, permite ao analista explorar conjuntos de dados de espectrometria em massa para novos produtos naturais que de outra forma seriam perdidos.
Isso inclui novos bioprodutos, e também novas toxinas. A filtragem de fragmentação diagnóstica, aplicada a classes de toxinas que contaminam alimentos e água, pode informar avaliações de exposição. Quando aplicado a extratos microbianos e vegetais, pode resultar na descoberta de novos compostos.
O uso da filtragem de fragmentação diagnóstica requer uma compreensão das principais características de espectrometria de massa tandem que definem uma classe química. Isso significa que compostos estruturalmente semelhantes gerarão íons característicos. Meu nome é Shawn Hoogstra.
Sou técnico de pesquisa e desenvolvedor de software em nosso centro, e vou demonstrar o procedimento. Para preparar uma amostra para análise de microcistina, inocular 30 mililitros de cianobactérias estéreis de crescimento de cianobactérias para aproximadamente cinco vezes 10-10-o-quinto células por mililitro, sob condições assépticas, em frascos erlenmeyer de 250 mililitros, monitorando a densidade celular com um hemocitometro. Após 26 dias de cultura fotoautotrófica, iluminada com luz fluorescente branca fria usando um regime claro-escuro de 12 horas a 27 graus Celsius, com redemoinho uma vez por dia, use papéis de filtro de microfibra de vidro GF/C de 47 mililitros de diâmetro para separar as células do meio de cultura por filtragem de vácuo.
Adicione três mililitros de 80% de metanol às células colhidas em tubos de ensaio de 14 mililitros, e vórtice e, posteriormente, sonicar cada tubo por 30 segundos. Após a sônicação,lise as amostras com três congelamentos consecutivos de uma hora, menos-20 graus Celsius e ciclos de degelo de temperatura ambiente de 15 minutos, e filtrar cada extrato celular de cianobactéria resultante através de filtros de seringa de politefluoroetileno individuais de 0,22 micrômetros. Usando um fluxo suave de gás nitrogênio, seque os extratos com um evaporador a 30 graus Celsius, e armazene os extratos secos a menos 20 graus Celsius.
Para análise de espectrometria de massa cromatografia líquida, reconstitua o resíduo seco a ser analisado com 500 microliters de 90% de metanol e vórtice das amostras por 30 segundos. Transfira para um frasco de cromatografia líquida de alta pressão âmbar. Em seguida, analise o extrato de cianobactéria usando um método de aquisição dependente de dados em um espectrômetro de massa de alta resolução de acordo com os protocolos padrão.
A maioria das microcistinas contém um resíduo ATA que produz dois íons de produto diagnóstico em espectrometria de massa em conjunto, M a Z 135,0803 e 163.1114. Para a preparação do conjunto de dados de espectrometria de massa de cromatografia líquida não-direcionada, abra o MZmine 2 e selecione a importação de dados raw"sob os métodos de dados raw"menu suspenso. Em seguida, selecione os arquivos de dados a partir da análise de microcistina e selecione o filtro de captação de pico para aplicar um algoritmo de centroiding fornecido pelo fornecedor.
Para filtrar a fragmentação diagnóstica, ou DFF, dos arquivos de aquisição dependentes de dados importados, use o cursor para destacar os arquivos de dados e abra o menu suspenso da Visualização para selecionar a opção DFF. Na caixa de diálogo DFF que aparece, insira a faixa de tempos e minutos de retenção quando a classe alvo de analitos se elute, e para encontrar a faixa de relação massa-carga da classe alvo de analitos, incluindo a possibilidade de múltiplos compostos carregados quando apropriado. Insira a precisão de massa tandem alcançável do instrumento de espectrometria de massa e insira os íons de produtos específicos da classe da relação massa-carga.
Insira as perdas neutras específicas da classe e defina a intensidade mínima para íons de produtos diagnósticos e/ou perdas neutras a serem consideradas como uma porcentagem do pico base do espectrometria de massa tandem. Em seguida, selecione um nome de caminho e arquivo para produzir os resultados e clique em OK"para iniciar o DFF. Um gráfico DFF aparecerá após uma conclusão bem sucedida da configuração.
O analista deve interpretar espectros em massa de compostos conhecidos dentro de uma classe composta para identificar os íons do produto e/ou perdas neutras que são diagnósticas para toda a classe de compostos. Este lote DFF foi gerado após a análise do M.aeruginosa CPCC 300. O eixo x representa essa relação massa-carga dos íons precursores que satisfizeram os critérios de DFF definidos, enquanto o eixo y mostra a razão massa-carga de todos os íons do produto dentro do espectrometria de massa microcystinas tandem.
Para esta análise, os critérios para detecção de microcistina incluíram íons precursores na relação massa-carga de 400 a 1.200 e tempos de retenção entre dois a seis minutos. Mais importante, estes espectrometria de massa tandem continham ambas as relações de massa-carga acima do limiar de intensidade de pico definido de 15%. Dos 4.116 espectrometria de massa adquiridas durante a análise, 26 satisfizeram os critérios de DFF e foram detectados no extrato M.aeruginosa CPCC 300.
As principais microcistinas detectadas podem ser atribuídas com confiança como microcistina leucina arginina e microcistina ácido aspartatosinasina arginina. À medida que novos compostos são descobertos usando filtragem de fragmentação diagnóstica, os organismos podem ser cultivados em larga escala para isolamento e caracterização dos compostos por RMN. Quando aplicada a microcistinas, a filtragem de fragmentação diagnóstica nos permite determinar se os métodos tradicionais de triagem direcionada estão detectando as principais toxinas presentes dentro de uma amostra.
