Natürliche Produkte werden oft als eine Klasse von Verbindungen biosynthetisiert, und nicht als ein einziges Produkt. Die diagnostische Fragmentierungsfilterung ist ein einfacher Ansatz, um alle strukturell verwandten Verbindungen in einem komplexen Gemisch zu erkennen. Die diagnosediagnostische Fragmentierungsfilterung, die in der MZmine-Software implementiert ist, ermöglicht es dem Analytiker, Massenspektrometrie-Datensätze für neue natürliche Produkte zu untersuchen, die andernfalls fehlen würden.
Dazu gehören neue Bioprodukte, aber auch neue Giftstoffe. Die diagnostische Fragmentierungsfilterung, die auf Toxinklassen angewendet wird, die Lebensmittel und Wasser kontaminieren, kann die Expositionsbewertungen informieren. Wenn es auf mikrobielle und Pflanzliche Extrakte angewendet wird, kann es zur Entdeckung neuer Verbindungen führen.
Die Verwendung der diagnostischen Fragmentierungsfilterung erfordert ein Verständnis der wichtigsten Tandem-Massenspektrometrie-Features, die eine chemische Klasse definieren. Dies bedeutet, dass strukturell ähnliche Verbindungen charakteristische Ionen erzeugen. Mein Name ist Shawn Hoogstra.
Ich bin Forschungstechniker und Softwareentwickler in unserem Zentrum und werde das Verfahren demonstrieren. Um eine Probe für die Mikrocystin-Analyse vorzubereiten, impfen 30 Milliliter steriler Cyanobakterien-Wachstumsmedium auf etwa fünfmal-10-zu-die-fünfte Zelle pro Milliliter, unter aseptischen Bedingungen, in 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben, überwachung der Zelldichte mit einem Hämozytometer. Nach 26 Tagen photoautotropher Kultur, beleuchtet mit kühlem weißen Fluoreszenzlicht mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Regime bei 27 Grad Celsius, mit Wirbeln einmal täglich, verwenden Sie GF/C-Glas-Mikrofaserfilterpapiere mit 47 MilliliterDurchmesser, um die Zellen durch Vakuumfiltration vom Kulturmedium zu trennen.
Fügen Sie den geernteten Zellen in 14-Milliliter-Reagenzgläsern drei Milliliter 80% Methanol hinzu und wirbeln Sie jede Tube 30 Sekunden lang an. Nach der Beschallung lysieren Sie die Proben mit drei aufeinanderfolgenden einstündigen, minus 20 Grad Celsius Gefrierzyklen und 15 Minuten Raumtemperatur-Tauzyklen, und filtern Sie jeden resultierenden Cyanobakterien-Zellextrakt durch einzelne 0,22-Mikrometer-Polytetrafluorethylen-Spritzenfilter. Mit einem sanften Strom von Stickstoffgas trocknen Sie die Extrakte mit einem Verdampfer bei 30 Grad Celsius und lagern Sie die Extrakte trocken bei minus 20 Grad Celsius.
Für die Analyse der Flüssigchromatographie der Tandem-Massenspektrometrie den zu analysierenden getrockneten Rückstand mit 500 Mikroliter 90%Methanol rekonstituieren und die Proben 30 Sekunden lang wirbeln. Transfer in eine bernsteinfarbene Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie-Durchstechflasche. Analysieren Sie dann den Cyanobakterienextrakt mit einer datenabhängigen Erfassungsmethode auf einem hochauflösenden Massenspektrometer nach Standardprotokollen.
Die meisten Mikrozystoine enthalten einen ATA-Rückstand, der zwei diagnostische Produktionen in der Tandem-Massenspektrometrie produziert, M bis Z 135.0803 und 163.1114. Öffnen Sie für die nicht zielgerichtete Flüssigchromatographie die Vorbereitung von Tandem-Massenspektrometrie-Datensätzen, öffnen Sie MZmine 2, und wählen Sie Rohdatenimport"unter Dropdown-Menü "Rohdatenmethoden". Wählen Sie dann die Datendateien aus der Mikrocystinanalyse aus, und wählen Sie den Peak-Picking-Filter aus, um einen vom Hersteller bereitgestellten Zentroidierungsalgorithmus anzuwenden.
Für die Diagnosefragmentierungsfilterung (DFF) der importierten datenabhängigen Erfassungsdateien verwenden Sie den Cursor, um die Datendateien hervorzuheben, und öffnen Sie das Dropdown-Menü Visualisierung, um die DFF-Option auszuwählen. Geben Sie in der angezeigten DFF-Dialogbox den Bereich der Retentionszeiten und Minuten ein, in denen die Zielklasse von Analyten ausfällt, und finden Sie den Massen-Zu-Ladungs-Verhältnisbereich der Zielklasse von Analyten, einschließlich der Möglichkeit für mehrere geladene Verbindungen, falls angemessen. Geben Sie die erreichbare Tandem-Massenspektrometrie-Massengenauigkeit des Massenspektrometrie-Instruments ein und geben Sie die klassenspezifischen Produktionen des Massen-Zu-Lade-Verhältnisses ein.
Geben Sie die klassenspezifischen neutralen Verluste ein, und definieren Sie die Mindestintensität für diagnostische Produktionen und/oder neutrale Verluste, die als Prozentsatz des Basisspitzen der Tandemmassenspektrometriespektren zu betrachten sind. Wählen Sie dann einen Pfad und Dateinamen aus, um die Ergebnisse auszugeben, und klicken Sie auf OK", um den DFF zu starten. Nach erfolgreichem Abschluss der Einrichtung wird ein DFF-Plot angezeigt.
Der Analytiker muss Tandemmassenspektren bekannter Verbindungen innerhalb einer zusammengesetzten Klasse interpretieren, um die Produktionen und/oder neutralen Verluste zu identifizieren, die für die gesamte Klasse von Verbindungen diagnostisch sind. Dieses DFF-Diagramm wurde nach der Analyse von M.aeruginosa CPCC 300 erstellt. Die x-Achse stellt dieses Massen-Zu-Ladungs-Verhältnis der Vorläuferionen dar, die die definierten DFF-Kriterien erfüllten, während die y-Achse das Massen-Zu-Ladungs-Verhältnis aller Produktionen innerhalb der Tandem-Massenspektrometriespektren der Mikrozysine anzeigt.
Für diese Analyse umfassten die Kriterien für den Mikrocystin-Nachweis Vorläuferionen im Massen-Zu-Ladungs-Verhältnis von 400 bis 1, 200 und Retentionszeiten zwischen zwei und sechs Minuten. Am wichtigsten ist, dass diese Tandem-Massenspektrometriespektren beide Massen-Zu-Ladungs-Verhältnisse über dem definierten Schwellenwert von 15 % der Basisspitzenintensität enthielten. Von den 4, 116 Tandem-Massenspektrometriespektren, die während der Analyse erworben wurden, erfüllten 26 die DFF-Kriterien und wurden im M.aeruginosa CPCC 300-Extrakt nachgewiesen.
Die wichtigsten nachgewiesenen Mikrozystonien konnten mit Zuversicht als Mikrocystin-Leucin-Arginin und demethylierte Aspartinsäure-Mikrocystin-Arginin-Arginin zugeordnet werden. Da neue Verbindungen mittels diagnostischer Fragmentierungsfilterung entdeckt werden, können die Organismen in großem Maßstab zur Isolierung und Charakterisierung der Verbindungen durch NMR angebaut werden. Bei Anwendung auf Mikrozystonermöglicht es uns, anhand der diagnostischen Fragmentierungsfilterung zu bestimmen, ob herkömmliche gezielte Screening-Methoden die wichtigsten Toxine in einer Probe erkennen.
