הזרקת תוך-החזה לחקר בוגרים של לב זברדג

במחקר הלב על דגי זברה בוגרים, טיפולים תרופתיים נעשים בדרך כלל בצורה מערכתית. עם הזרקת intrathoracic, אפשר באופן מקומי לספק פתרון ללב מבלי לגרום נזק שריר הלב. שיטה זו מאפשרת אספקה של כמויות קטנות של תרופות, חלבונים או מולקולות אחרות בתסרון דווקא סביב הלב של דג זברה בוגר.

כדי להתחיל בהליך זה, השתמש במוציא מחט כדי למשוך נימי זכוכית borosilicate מותאם microinjection. אחסנו את נימי הנמשכים בצלחת פטרי באורך תשעה סנטימטרים עם מסילות של חימר דוגמנות או סרט הדבקה. בעזרת מספריים נפוצים, חותכים חתיכת ספוג, וגורפים צללית דמוית דג באמצעה.

לאחר מכן, להכין aliquots קטן של פתרונות ההזרקה עם חלבונים שנבדקו או תרכובות אחרות. התאימו את הריכוז שלהם בהתאם להתמדה על ידי דילול החומר בתווית המלח המאוזנת של הנקס 1x עם 10% פנול אדום. כדי להשיג את ריכוז העבודה של הרדמה, להוסיף שניים עד שלושה מיליליטר של פתרון מלאי tricaine לבקבוק המכיל 100 מיליליטר של מי דגים.

תחילה, הפעל את המיקרוסקופ הסטריאו עם האור מלמעלה והתאם את ההגדלה ל- 16x. משרים את הספוג עם מי דגים, וממקמים אותו על צלחת פטרי באורך תשעה סנטימטרים על המיקרוסקופ. התאימו את המיקוד, ותחת מיקרוסקופ הסטריאו, השתמשו במספריים של iridectomy כדי לחתוך את הקצה של מיקרו-אקפילארי במרחק של כשבעה מילימטרים מהבסיס, כמפורט איור 1A של פרוטוקול הטקסט.

הכנס את המיקרו-אקפילארי החתך למחזיק המחט של מנגנון המיקרו-מינג'קטור. באמצעות טיפים Microloader, לטעון פתרון בקרה כדי להגדיר את הלחץ של הזרקה על מנת להשיג את הזרימה המתאימה, ולאחר מכן לרוקן את המחט. לאחר מכן, לטעון את הנפח הנבחר של פתרון ההזרקה לתוך קצה נימי, לוודא כי אין בועות אוויר.

השתמש ברשת כדי לתפוס דג בוגר, ולהעביר אותו לתוך הפתרון ההרדמה. לאחר שעה עד שתי דקות, כאשר הדג מפסיק לשחות ותנועת אופרקולום מצטמצמת, לגעת בדגים עם כף פלסטיק כדי לוודא שהוא לא מגיב לכל מגע. לאחר מכן, במהירות ובזהירות להעביר את הדג לתוך החריץ של ספוג רטוב, עם הצד הגחוני למעלה.

ראש הדג צריך להצביע הרחק מידו הדומיננטית של המפעיל. מתחת למיקרוסקופ הסטריאו, יש להתבונן היטב בתנועת הלב הפועם מתחת לעור הדג. חזותית לקבוע את נקודת ההזרקה מעל הלב הפועם באמצע המשולש, מוגדר על ידי צלחות cartilaginous הגחוני.

הכנס את קצה נימי בזווית בין 30 ל 45 מעלות יחסית לציר הגוף. בעדינות לחדור את העור עם קצה microcapillary לתוך pericardium. לאחר המחט היא בתוך קרום הלב, לחץ על הדוושה של מכשיר microinjector כדי להשלים את ההזרקה.

לאחר ההזרקה, מוציאים בעדינות את נימי בית החזה, ומיד מעבירים את הדגים למיכל עם מי מערכת להחלמה. לפקח על הדגים עד התאוששות מוחלטת מהרדמה. כדי לנתח את ההשפעות של הזרקה, לאסוף את הלב בנקודת הזמן הרצויה, ולהכין אותו לניתוח נוסף.

במחקר זה, תרכובות אקסוגניות וחלבונים מועברים לתוך חלל pericardial על מנת לחקור את ההשפעות שלהם על הלב של דגי זברה בוגרים. כדי לאמת שיטה זו, שני ניסויי בדיקה מבוצעים על ידי הזרקת צבע וצבעים פלואורסצנטיים לדגים המתת דם. בשתי הראיות, ניתוח שלם של ההר חושף תיוג של הלב כולו כולל החדר, ה אטריום, ואת העורקים בולבוס.

תוצאות אלו חושפות התפשטות יעילה של פתרונות ההזרקה על פני הלב. כדי להשוות את התאמת הזרקת intrathoracic לעומת הזרקה תוך-ניתוחית למחקרי לב, כמות דומה של DAPI מוזרק באמצעות שתי השיטות. לאחר מכן הלבבות קבועים לאחר חמש דקות או 120 דקות.

אין תאים חיוביים DAPI נצפו בלבבות לאחר הזרקה תוך-לידתית בכל נקודת זמן. לעומת זאת, הזרקות תוך-חזה לגרום לנוכחות של גרעינים שכותרתו DAPI שריר הלב. תוצאות אלו מראות כי הזרקת תוך-חזה משפרת את המסירה של המתחם ללב, בהשוואה להזרקה תוך-ניתוחית.

כדי לבדוק את התאמת שיטה זו למחקרי התחדשות הלב, החדרים הם cryoinjured, ולאחר מכן זריקות מבוצעות בשלושה ושבעה ימים לאחר cryoinjury. הן שריר הלב והן הרקמה הפצועה מכילים תאים חיוביים רבים DAPI, המציין חדירה יעילה של צבע זה לתוך הלב שלם ואת הרקמה הפיברוטית. יתר על כן, פאלואידין מוזרק AF649 מאוגד גם על ידי cardiomyocytes של אזור הפציעה פרי וכמה fibroblasts מגויסים של האזור הפצוע.

ניסוי זה מגלה כי התרופות יכולות לחצות את האפיקרדיום ולחדור לתוך שריר הלב הבסיסי. לאחר בדיקת היעילות של זריקות תוך-חזה באמצעות צבעים, ההשפעות של חלבונים מוזרקים על הלב מנותחים. לשם כך, ההשפעות של ציטוקין אקסוגני על תהליכים שונים נחקר.

ההיבטים הביולוגיים של התפשטות קרדיומיוציט, תצהיר מטריצה חוץ תאית, גיוס תאים חיסוניים, וביטוי גנים cardioprotective מופעלים על ידי הזרקה תוך-תאורקטית של ציטוקינים. תוצאות אלו מראות כי הזרקת תוך-חזה מספקת אסטרטגיה מתאימה לאספקה ממוקדת של חלבונים כדי לחקור את השפעותיהם על רקמות לב נפרדות במגוון של מחקרים. החדרת המחט לתוך ההקפאה היא צעד מפתח עבור זריקה מוצלחת.

צורת המחט, זווית החדירה ואתרי הדקירה הם כולם גורמים המשפיעים על החדרת המחט. לאחר או לפני הזרקת intrathoracic, אפשר לבצע cryoinjury על מנת לנתח את ההשפעה של מולקולות מוזרק על התחדשות הלב. הזרקת תוך-חזה שימשה דגי זברה כדי ללמוד תנאים מוקדמים לב.

חלבון בשם CNTF הוזרק והוצג כדי לשפר את תוכניות cytoprotective ופרו רגנרטיבית בלב.